第7卷第3-4期 2009年11月菌 物 研 究
Journal of Fungal Research Vol 17No 13-4 Nov. 2009
植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法
刘学敏
1*
, 孟玉芹
2
(1. 东北农业大学农学院, 哈尔滨150030; 2. 黑河出入境检验检疫局, 黑河164300)
摘 要:植物病害诊断是通过病菌鉴定和致病性测定等步骤实现的。在过去的10年里用于细菌鉴定的基因组技术的快速发展极大地简化和促进了病菌的检测和鉴定, 但是DNA 分子检测方法不能完全取代传统的培养检验和表型检验方法。文中介绍了未显示病害症状的植物或植物产品中已知细菌的免疫检测和基因组DNA 检测方法, 以及细菌病害诊断鉴定的新方法。
关键词:病原细菌; 免疫检测; DNA 分子检测; 基因组探针; 多相分析诊断
中图分类号:S43211 文献标识码:A 文章编号:1672-3538(2009) 03-04-0211-07
Approaches of Plant Pathogenic Bacteria Detection
and Bacterial Disease Diagnosis
LIU Xue -m in , M ENG Yu -qin
(1. College o f Agronomy , No rtheast Agricultural University , Harbin 150030, China; 2. Heihe Entry -Ex -it Ins pection and Quarantine Bureau, Heihe 164300, China)
Abstract:Plant disease diagnosis is based on a number of factors, including laboratory tests for pathogen identification and pathogenicity tests. Rapid development of genomic techniques for characterization of bacteria over the past decade has greatly simplified and improved pathogen detection and identification, but DNA -based methods have not yet entirely replaced traditional culture and phenotypic tests. The paper sum marized rapid immunodiagnostic and DNA -based detection methods for known bacterial pathogens in plants or plant products, which often manifest no symptoms of disease, and new me thods for identifying and characterizing bacteria disease diagnosis.
Key words:pathogenic bacteria; immunodiagnosis; DNA -based detection; genomic probe; polyphasic
analysis diagnosis
细菌是仅次于真菌和病毒的重要植物病原物。迄今已知由细菌引起的病害在500种以上, 其中青枯病、软腐病、马铃薯环腐病以及水稻白叶
-2]枯病等都是世界性重要病害[1。病原细菌鉴定
1
2
腐生细菌就更加困难。在过去10年中, 细菌鉴定
的基因组技术的快速发展极大地简化和促进了病菌的检测鉴定工作, 目前已报道了多种常见植物病原细菌检测的PCR 引物序列。与传统检测方法相比, 现代分子生物学技术应用可大大提高检测灵敏度和准确度, 并使得快速检测大样本的操作成为可能。但由于试剂、设备、试验人员以及方法本身的局限, 利用选择性培养基分离培养或采用免疫诊断进行确定性试验一直是细菌病害诊断的普遍作法。
和细菌病害诊断始终是细菌学家和植物病理学家的重要工作。然而至今还没有一套仅靠少数指标就能准确鉴定细菌和诊断细菌病害的简便方法, 细菌病害诊断往往需要综合方法。
细菌表型和基因型特征作为细菌鉴定的依据可相互印证。对已知细菌的诊断只需症状识别和快速检验等简单程序, 但对未知病菌的诊断则要有田间观察、染病植物组织检查和基于柯赫氏法则的病菌分离鉴定等步骤, 鉴定遍布于环境中的
*
1 已有的细菌检测方法
了解传播体来源、估计病害发生趋势是控制
作者简介:刘学敏, 男, 博士, 教授, 从事植物病理学教学和研究。:
212菌 物 研 究2009年
病原细菌传播为害的基础。有多种传统和现代技术都可检测种子、植株残体、土壤和水中存在的已知病原细菌[3]。由于多数细菌病害是通过种子或繁殖材料传播的, 因此快速检测植物产品的带菌情况非常重要, 国际贸易中更是如此。细菌检测的一般程序是利用选择性培养基从种子或植物浸出物中分离病菌, 然后根据形态学和生理生化特征鉴定菌落, 继而进行致病性测定。完成一次检验往往需要1周乃至数周时间, 不能满足生产的要求。因此需要有快速、准确的检测方法以取代繁琐、耗时的分离培养和致病性测定方法。111 免疫诊断
细菌细胞表面具有蛋白质、脂多糖(LPS)和胞外多糖等抗原分子, 利用多克隆抗血清可以鉴定细菌的种。尽管优良的抗体可以显示鉴定病菌的特征, 但其与不相关种的交叉反应是普遍存在的, 因此难以查清抗血清的专化性范围。杂交瘤技术的发展为单克隆抗体(MAbs) 的制备提供了方向。由于鼠骨髓瘤细胞系分泌的抗体对单个抗原决定部位显示唯一特性, 杂交瘤产生特定的抗体, 因此直接改良细菌血清学是可能的, 这使得不同实验室的检测结果可以重复。
杂交瘤技术很快被用于制备病原细菌的单克隆抗体, 进行病菌特异性和流行学研究[4]。其中许多抗体被大量靶标菌系验证, 甚至亲缘较远的细菌也能共享公共的抗原决定部位, 这对于认识与同一抗体反应的非相关细菌非常重要。一旦一个单克隆抗体被完全定性, 根据鉴定的需要, 一组单克隆抗体可被组成综合试剂用来检测病原细菌的属、种、亚种和致病型[5]。此外, 噬菌体展示技术(Phage -display technology) 也被用于筛选检测茄科青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum ) 的特定单克隆抗体。
与制备多克隆抗体相比, 单克隆抗体的制备程序包括数百个杂交瘤细胞系的广泛筛选以鉴定出能分泌期望专化性抗体的惟一细胞系。实际上鉴定一个致病变种与其他成员区别的抗原首先是让它们与各自的单克隆抗体反应, 只有定性为蛋白质、脂多糖(LPS) 或其他化合物的才是抗原。细菌LPS 作为抗原决定部位是在根癌农杆菌(A -grobacterium tume faciens ) 的标准菌系上发现的, 依此制备的单克隆抗体被用于鉴定其生物变种3[7][6]
它的MAbs 不能区别根癌农杆菌(A. tume faciens )
和放射形土壤杆菌(A. radiobacter ) 。黄单胞杆菌间脂多糖的差别在MAbs 之前很久就被研究证明是可用的, 但它是否与致病变种的地位和寄主特异性有关却不清楚。早期研究表明, 鉴别甘蓝黑腐黄单胞(Xanthomonas cam pestris ) 致病变种的许多MAbs 识别不同细菌的LPS 组分[4]。同样通过识别不同LPS 分子的MAbs 区分了引致柑橘溃疡病的地毯草流胶病菌柑橘致病变种(X. ax -onopodis pv. citri ) A 、B 和C 3个致病型[4]。许多单克隆抗体定义的病菌亚种群被包括RFLP 分析在内的多种DNA 检测方法确定的组进一步确定。鉴于血清学变种(serovar) 与毒性、致病性或地理起源的相关性很少发现, 故进一步分型为血清学变种的意义不大。但是无论如何, 在流行学研究中追踪传播体菌系的迁移或者用较少的费用比较菌系的流行适合度, 单克隆抗体都是有用的。
包括凝集检验(agglutination assays) 、ELISA 、Western blot 、免疫荧光(im munofluorescence, IF) 或免疫荧光菌落染色(immunofluorescence colony -staining, IFC) 以及侧流方法(lateral flo w devices) 在内的单克隆抗体和多克隆抗血清对多种形式的检测应用是有效的。与耐热LPS 反应的病菌特异MAbs 的制备使得用于田间和实验室病害快速诊断的普通检测试剂盒的开发成为可能。同样MAbs 也能识别病菌的荚膜和(或) 胞外多糖, 如番茄溃疡病菌(C. michiganensis subsp. Michiganen -sis ) 和青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum ) , 这一特性在许多免疫诊断方式中都是可用的。
111. 1 E LISA 多数病原细菌MAbs 的制备开始都是通过E LISA 方法筛选的, 然后再用其他免疫诊断检测验证。ELISA 是良好的、广泛用于大量样本检测的方法, 而且容易适应自动化要求并且对大规模检验具有重复性相对较好的结果。迄今为止, 运用多克隆和单克隆2种抗体的E LISA 检测方法对植物病原细菌的许多分类单元的鉴定都有效, 快速检测试剂盒也已商业化。ELISA 的灵敏度(105~106c fu/mL)对于鉴定显症植株上的病原细菌和选择性培养基上的菌落是足够的。如果使用能使LPS 释放到溶液中的含有E DTA 和溶菌酶的提纯缓冲液, E LISA 的灵敏度就能提高10倍, 而且在不增加背景读数的情况下提高抗体) [9][8]
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通过增加信(号) 噪(声) 比(signal B noise) 的方法也能改善灵敏度。此外, 富集技术也能提高检测的灵敏度, 但只能做定性检测[10]。目前已经开发了用不同的酶标在同一个酶联板上检测多个标样的多靶标或复合ELISA 技术, 这一技术被用于番茄溃疡病菌(C. michiganensis subsp. michiganensis ) 和番茄细菌性斑点病菌(X. axonopodis pv. vesica -toria ) 的检测。
11112 侧流方法(Lateral flow devices) 快速侧流方法的应用原理是ELI SA 的初期形式, 但以不同类型的滤纸做黏合反应的固相支持物[11]。英国中央科学实验室已开发出侧流方法检验试剂盒, 可在3min 内一步检测青枯菌(R. solanacer -rum ) [11]。该试剂盒也可用于X. hortorum pv. pelargonii 和E. amylovora 的检测。
11113 免疫荧光(IF) IF 在欧洲被广泛用于种子和繁殖材料中病原细菌的检测。荷兰每年用I F 筛选6万份马铃薯种块以检测其是否存在引起褐腐病的青枯菌(R. solanancearum ) 。IF 技术在法国也被用于检测马铃薯环腐棒形细菌(C. michiganensis subsp. sepedonicus ) , 此外IF 技术也被用于筛查番茄种子中的细菌性溃疡病菌(C. michiganensis subsp. michiganensis ) 。
11114 流式细胞光度术(flow cytometry) 流式细胞光度术是一项细胞或其他微粒快速鉴定和定量的技术, 当它们分别通过液流传感器时, 细胞被结合特异抗体上的荧光染料鉴定, 基于细胞的荧光和其消散光的能力多个细胞参数可被同时确定。待测样品的制备很简单, 只需要过滤细胞悬浮液以去掉大颗粒, 然后用荧光色素标记的抗体染色即可。流式细胞光度术被用于检测番茄种子浸出物中的C. michiganensis subsp. michiganensis , 引起花烛疫病(anthurium blight) 的X. axonopodis pv. die ffenbachiae , 检测油菜(Brassica sp. ) 的种子提取物中的X . campestris pv. cam petris 以及确定马铃薯种薯中的青枯菌(R. solanacearum ) 等。11115 免疫磁性分离(immunomagnetic separati on) 利用由特异抗体包被的顺磁聚苯乙烯珠能够把目标细胞从混合液中分离出来, 接着进行脱洗, 被束缚的细胞可用于PCR, 或当它们是活的就可以在选择性培养基上培养出。112 遗传方法(Genotypic Approaches)
[7]
样本中直接检测已知病菌的遗传学方法, 如利用特异性引物PCR 或PC R 与其他技术相结合的方法检测混合物中的病原细菌[12], 利用复合PCR 同时检测几个病原菌, 新的联合PCR(Co -PC R) 技术也已开发用于水中青枯菌(R. solanacearum ) 的检测。实时PCR(Rea -l time PCR) 技术由于能提供准确和快速病原细菌的检测结果并具有其他的优势而得到应用。此外, DNA 杂交、斑点印迹(do-t blots) 以及依赖于核酸序列的扩增技术(NAS -B A) 也被用于检测细菌[6]。
开发待测目标病菌的特异探针是过去10余年的研究热点。Manulis 等开发了用于X. cam pestris pv. pelargonii 致病变种检测的特异性PC R 探针, 每个样本灵敏度可达10~50cfu, 可准确鉴定显症组织中的潜在病菌。Like wise, Koh 和Nou [16]也开发出了用以检测无症状猕猴桃中细菌性溃疡病菌(P. s yringae pv. actinidae ) 的引物和探针。Cubero 和Graham [17]为X. axno podis pv. citri 开发了一套引物, 它能够鉴别致病型A 和X. auranti f olii 致病型B 和C, 引物是根据I TS 区序列的差异和pth A 基因设计的。根据核糖体序列设计的引物对于X. axnopodis pv. citri A 有很高的特异性, 而根据pth A 基因设计的引物对柑橘细菌性溃疡病的所有类型是通用的。
欧氏杆菌属(Erwinia ) 的病菌能与肠道腐生菌区别, 但是一旦知道属后, 细菌学和血清学检验对鉴定胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜软腐致病变种(E. carotovora subsp. carotovora ) , 胡萝卜软腐欧氏杆菌黑腐致病变种(E. carotovora subsp. a -troseptica ) 和菊欧氏菌(E. chrysanthemi ) 的结果不总是一致。Avrova 等[18]发现菌株的AFLP 分析显示的亚组与亚种名称完全相符, 其中组1包括E. carotovora subsp. carotovora 和E. carotovora subsp. o dori f era ; 组2包括E. carotovora subsp. atrose ptica 和E. carotovora subsp. betavasculorum ; 组3包括E. caroto vo ra subsp. wasabiae; 组4包括E. chrysanthemi 。尽管在混合培养物中不能进行AFLP 分析, 但是用代表性菌株纯培养的病菌多样性的研究将最终允许快速鉴定未知分离以及在诊断中潜在应用。113 其他方法
激光诱导荧光的方法也被开发用作龙舌兰病[19], [15]
[14]
[13]
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(He)) 氖(Ne) 激光做激发源, 体内荧光发射谱在660~790nm 的范围。接种后3d 侵染植株的荧光密度增加, 15d 后又降低, 而未感染的或用杀菌剂处理的植株荧光密度没有明显的改变, 荧光密度比值是病程的指示物[19]。114 检测和鉴定的综合方法
从检测结果的灵敏度和可靠性上看新方法与传统培养方法一致。与培养方法相比较, 扩增假单胞杆菌16S rRNA 位点引物的特异性要高于扩增其16S~23S 间区的引物。特异引物的PCR 与培养法检测相比显示95%的一致, 但是PCR 也鉴定出了7个通过培养法鉴定为阴性的阳性标样。11411 富集检测 在免疫诊断或DNA 的检测前短期培养通常能提高IF 、ELISA 和PCR 的灵敏性。如利用病菌特异MAbs 富集-ELISA 方法检测叶片中X. axono podis pv. die ffenbachiae 或马铃薯种块的E. solanacearum
carotovora subsp.
[10]
合物限制了直接利用PC R 检测天然样本中的目标细菌, 这个问题可采用免疫捕获或免疫磁性分离(I MS) 技术克服。用多克隆抗血清包被的高级磁性珠(AM) 免疫捕获P. syringae pv. s yringae 的最适抚育时间是1h 。与发光团反应产生的免疫捕获检测极限仅是106cfu/mL, 但当免疫捕获由特异PCR 产生时检测极限得以显著提高。提高马铃薯嫩芽提取物E. catoto vo ra subsp. carotovora 回收率的方法是通过与AM 和病菌特异多克隆抗血清的免疫捕获实现的。在12~200L g/mL的范围内颗粒浓度与回收率呈线性关系, 每微克颗粒中有66%的目标细胞被回收。与PC R 结合在每一反应管中这个方法能检测出50个细胞(2@10cfu/mL), I MS-PCR 要比没有I MS 的PCR 的灵敏度高100倍, 在马铃薯嫩芽中目标细胞有105cfu/mL出现时就能检测到[23]。I MS 加PC R 在检测Acidovorax avenae subsp. citrulli 时的灵敏度比直接PCR 提高了100倍
[24]
3
atroseptica 和R.
。甚至不能满足菌落鉴定需要的
有限培养步骤也能使E LISA 检测灵敏度提高约
1万倍, 富集检测具有只有活的细胞才能产生阳性信号的优势。免疫荧光菌落染色(IFC) 技术是把用于菌落检测的倾倒平板的富集步骤与荧光染料标记的抗体结合, 它能使IF 的灵敏度提高约1万倍[20]。其中活细胞增殖形成的微菌落能在40~60倍荧光体视显微镜下观察到, 而单个(死的) 细胞在这样低的放大倍数下则不能观察到[21]。IFC 技术更多地用于流行学研究以及判断其他不能区别活、死细胞检测方法所得结果的可靠性
[20]
。
11413 免疫荧光(I F ) 和荧光原位杂交(FISH) 与23S rRNA 探针的荧光原位杂交(FISH)技术被用于检测马铃薯嫩芽青枯菌(R. solanacearum ) 3号小种的生物变种2[6]。对R. solanacearum 特异的探针被进一步用于马铃薯样本病菌鉴定, 其结果与通过病菌特异免疫荧光(IF) 检测一致。在快速(1d) 检验中2个独立方法的运用能直接提高阳性检测结果的置信界限, 而这一点对于主要作物繁殖材料的大规模筛查尤为重要。
11414 病菌检测的多相方法 Van Overbeek [21]等采用了多种方法研究大批量土壤和番茄根际土壤中青枯菌(R. solanacearum ) 已知菌系的动态变化, 用FISH 方法确定经生防菌株P. corrugata 处理的根集群中病菌的差异。PC R 与密度梯度凝胶电泳(DGGE) 分析技术相结合为确定P. corrugata 与R. solanacearum 的拮抗作用提供依据。其中强带只在含有病菌的土壤剖面中显示出来, 而R. solanacearum 的弱带则在混合系统的土壤剖面中被检测到。为了进一步验证, 他们采用活菌计数法、gfp 遗传标记和血清学技术(IFC) 追踪已知R. solanacearum 菌株的传播。这些复合检测方法的应用进一步证实和确认了通过分子检测获得的结[21]
。
选择性培养基上目标细菌的富集也能提高
PC R 反应的灵敏度, 在PCR 反应前从培养皿中收集菌落活细胞的检测通常被称为生物-PCR (BI O -PCR) 。尽管从死细菌中也能得到小的扩增子(amplic ons) , 但是主要的条带都是由活细胞DNA 扩增产生的。应用BIO-PCR 技术Sakthivel 等检测到每一反应管中55fg 的DNA 标样(约相当于每一反应管中有7个X. oryzae pv. oryzae 细胞或者原始样本中的70cfu/m L) [22]。利用BIO-PC R 方法检测被污染的P. cepacia 样本只需要在液体培养基中培养24h, 提纯DNA, 然后用特异引物进行PC R, 全部检测在27h 内即可完成, 而目标细菌的分离和鉴定的标准方法则需要5~6d 。11[12]
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2 病害诊断
诊断目的是证实染病组织中存在可疑病菌, 已有多种方法可用于诊断, 但要解决田间诊断的问题往往需要多个方法相结合[25]。Stowell 和Gelernter [25]指出, 为及时采取有效防治措施, 对草坪病害必须在72h 内做出诊断。此外, 还要考虑非生物因素, 鉴于没有足够的时间分离病菌, 对真菌和线虫引致的侵染性病害还可通过访问、经验判断以及显微镜观察等相结合的方法做出诊断, 早期这些原则也被用于细菌病害的诊断。除非必要情况一般很少使用显微镜, 分离培养或用特异的试验鉴定可疑生物体是必要的, 但这一程序会明显延误诊断。
211 寄主列表和描述症状
采用现有方法和积累的大量资料, 许多细菌性病害都能被快速、准确诊断。方法是首先查阅记载已知病害的寄主列表、典型症状和特殊寄主上已知的潜在病菌。目前许多细菌侵染的寄主植物和引致的病害都已被编成详细的列表, 鉴于出版后细菌的分类地位可能会发生变动, 因此目录需使用修订后的名字。212 分离培养
细菌是发病的原因, 因此一旦找到新的、比分离培养更灵敏和高效的方法, 就会被用于检测是否存在病菌, 进而与病菌分离和致病性实验相比较以证明检测结果的可靠性。这里的困难主要是从长满腐生菌的培养基中准确挑选出假定的病菌。熟悉腐生菌的基本特征将有助于准确选定病菌, 通常根据病菌在普通培养基上不同生长阶段的特征确定的分离物要比利用选择性培养基筛选更有效。
213 病菌假定鉴定
获得某一属分离物后只要根据少数关键特征就能对病害进行快速诊断。鉴定和选择性培养基的分离同时运用对于假定鉴定的第二阶段非常有用。用牙签把单个菌落从最初的培养皿中移至一系列培养基上的特定位置, 记录其24~72h 的生长特征。如通过革兰氏染色和氧化酶检测等少数方法把7个番茄病原细菌菌株很快区分为1个属, 然后将它们转移到一系列特征选择性培养基上, 再根据他们在YDC, KMB, FS, E T, MS, CVP, D172h 内, 通过这组试验将快速鉴别出E. carotovo -ra , C. michiganensis, X. axono podis pv. vesicatori -a, P. s yringae, P. corrugata, R. solanacearum, A. tume f aciens 和Pantoea herbicola, Enterobacter agglomerans, Micrococcus luteus 以及Stenotro phomon -as maltophilia 等腐生污染菌。类似的快速诊断方案也能够鉴定其他已知细菌病害, 诊断专家也可用其制定自己熟悉的特定寄主潜在病菌症状的鉴定方案。214 致病性测定
病菌的最终确认一般要通过致病性测定来实现, 但致病性实验需要时间, 还要有合适的寄主材料、适当的环境条件以及对照等。有些病菌能在烟草上引起过敏性反应, 这一特性可用于致病性测定, 但其他病菌很少或不引起HR 反应。在合适条件下许多病菌3~4d 即可诱导出叶斑症状, 因此通过致病性实验鉴定叶斑病菌效果较好。在既没有致病性测验也没有过敏性反应的情况下, 利用单克隆抗体进行快速免疫诊断检测或用致病变种特异引物PCR 检测也能区别类似于P. sy -ringae pv. tomato 和P. syringae pv. syringae 密切相关的致病变种。致病性测验对潜伏期长的病菌不适合, 如C. michiganensis subsp. michiganensis 的高毒力菌株侵染番茄茎3~4d 可显症, 中等毒力菌株需要7~10d, 而有些菌株则要在接种21~28d 后才能表现症状。
215 免疫诊断和DN A 检测
致病性检验需要长的潜育期, 因此如果用于分析的数据库是有用的, 运用快速免疫诊断或DNA 检测更有效。如运用免疫诊断检测或rep -PC R 指纹分析可把C. michiganensis susp. michi-ganensis 鉴定到种和亚种[18]。利用发表的引物直接PCR 能检测许多菌株, 但在对世界范围的菌株收集物的检测中观察到了比用免疫诊断检测更多的假阳性和假阴性反应结果。
已经证明免疫诊断和PCR 方法对特殊病菌的直接鉴定是可用的。当有病菌的纯培养时, 鉴定结果可用DNA 指纹进一步验证[18]。目前已经开发出了从植物组织中直接鉴定病菌的试剂盒, 这些试剂盒可确认显症叶片和茎组织中的已知病菌, 引起植株显症的细菌细胞数量足以使免疫诊断和DNA 检测方法产生阳性反应结果。但在未,
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潜伏侵染阶段的病害。不过分离培养、富集ELISA 以及BI O-PC R 等方法在潜伏侵染阶段的组织中未检出病菌的比例也很高[26]。此外, 分子检测方法规定非常小的样本, 在这种情况下很少或没有办法建立对潜伏侵染组织检测的正确方法。
216 其他方法
利用快速检测方法鉴定细菌纯培养是可行的, 其中脂肪酸甲基酯分析、代谢测验、DNA 序列分析等方法已被用于商业服务, 此外细菌鉴定的代谢检验方法也被广泛应用。
21611 诊断新的或未知的病菌和病害 诊断新病害是非常复杂的工作, 而且要求操作者要比确定已知寄主上假定存在的病菌有更多的经验。没有简单的实验可使问题容易解决, 确切地说, 着眼点必需集中在显微镜检查和病菌与病害症状的最初联系上, 一旦证明病害是由细菌侵染引起的就可利用前面叙述的方法进行鉴定。
21612 病菌纯培表型和基因型检测 诊断真正的未知病菌引起的病害时, 采用划线稀释以获得病菌纯培养且在合适的条件下进行致病性鉴定是必要的。此外代谢实验、代谢底物分析、脂肪甲基酯分析和16S rDNA 分析等相对用较少的实验也能用于细菌的进一步鉴定。要注意科学解释检验的结果, 尤其鉴定那些目前还没有被描述的细菌引起的病害。如在鉴定引起澳洲坚果、兰和生姜等植物病害的细菌时, 利用代谢检测(API 条带分析) 、FAME 分析和16S rDNA 序列分析等3种方法把所得细菌的纯培养确定为4个不同的种名, 该菌株与已知种相比较, 序列相似性少于9715%, 因此不能通过16S rDNA 分析鉴定。产生这种结果的原因显然是由于各种分析方法的数据库中没有准确描述该未知标样, 可见在确定采用来自于数据库的名称之前进行基础细菌学实验的重要性, 而不必考虑获得类似标准的分析方法是否精确。
21613 多种诊断方法的综合) 多相分析 多相分析一直被认为是鉴定新病菌的最可靠方法[27]。一旦通过控制条件实验证明病菌的致病力, 属就可通过基本的细菌学实验加以确定, 最终通过基因型检验方法鉴定细菌。16S rDNA 数据与典型菌株表型数据比较有助于选择确定性实验方法, Concalves 等运用多相分析方法鉴定未曾被描述的西番莲果和菜蓟病菌, 他们首先用普通培养基从西番莲植株中分离了1个病菌并鉴定其为Xanthomonas campestris 。以后他们又从西番莲果中分离到了55个黄单胞菌株并采用RAPD 分析、B OX 、E RIC 、REP 引物的rep-PCR 、16S~23S rDNA 基因间隔区(intergenic spacer region) 的RFLP 、稀有内切酶消化的基因组DNA 的脉冲场凝胶电泳(PFGE)、AFLP 以及细胞全蛋白SDS-PAGE 等多种方法检查了它们的遗传变异。这些方法建立了Xanthomonas 种的基本外形特征, 但还是不能确定寄生西番莲Xanthomonas 菌株的分类地位。最后利用DNA-DNA 杂交技术把它们定为X. ax -onopodis pv. passi f lorae 。
3 结 语
准确诊断病害需要发病田、实验室观察以及病菌的准确鉴定等程序, 环境中变异较大的病原细菌通常还需要多种互补实验才能得到最终鉴定。尽管诊断方法和试剂都是可靠的, 但也必须了解标准菌株的基本特征才能对未知菌株予以准确诊断。因此详尽研究标准菌株的变异对鉴定十分必要, 特异性PCR 引物或抗体必须是靶标菌鉴定方法中列出的, 这样才可作为检验标准以鉴定待测菌株。通常一般的分类鉴定可通过细胞表面抗原分子鉴定等少量表型特征实现, 这使得免疫诊断方法得以健康发展, 它能在几分钟完成常规实验需要数小时乃至数天才能完成的鉴定性实验。
适当的取样方法对诊断也很重要, 尤其是检测发病植株、繁殖材料、土壤以及植物残体上的病菌。在微克级的样品检验中, 由于样本的体积太小而会使真实情况被掩盖, 因此与最初病菌接种体密度相关的流行学数据对于建立证明程序的临界侵染水平是必需的, 这就需要找到合适的方法使被检验的材料缩减到需要小的体积。此外, 新方法的极端灵敏度对大量过境植物和植物产品检验也不具有实际意义。生物芯片[29]和阵列传统器[30]的加速运用可能用于病菌检测鉴定, 此外包
[31]
括生物芯片或者电子鼻等新方法的使用在大样本的检疫性病菌的检测中将会有很好的前景。参考文献:
王生1]. :中出,
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第7卷第3-4期 2009年11月菌 物 研 究
Journal of Fungal Research Vol 17No 13-4 Nov. 2009
植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法
刘学敏
1*
, 孟玉芹
2
(1. 东北农业大学农学院, 哈尔滨150030; 2. 黑河出入境检验检疫局, 黑河164300)
摘 要:植物病害诊断是通过病菌鉴定和致病性测定等步骤实现的。在过去的10年里用于细菌鉴定的基因组技术的快速发展极大地简化和促进了病菌的检测和鉴定, 但是DNA 分子检测方法不能完全取代传统的培养检验和表型检验方法。文中介绍了未显示病害症状的植物或植物产品中已知细菌的免疫检测和基因组DNA 检测方法, 以及细菌病害诊断鉴定的新方法。
关键词:病原细菌; 免疫检测; DNA 分子检测; 基因组探针; 多相分析诊断
中图分类号:S43211 文献标识码:A 文章编号:1672-3538(2009) 03-04-0211-07
Approaches of Plant Pathogenic Bacteria Detection
and Bacterial Disease Diagnosis
LIU Xue -m in , M ENG Yu -qin
(1. College o f Agronomy , No rtheast Agricultural University , Harbin 150030, China; 2. Heihe Entry -Ex -it Ins pection and Quarantine Bureau, Heihe 164300, China)
Abstract:Plant disease diagnosis is based on a number of factors, including laboratory tests for pathogen identification and pathogenicity tests. Rapid development of genomic techniques for characterization of bacteria over the past decade has greatly simplified and improved pathogen detection and identification, but DNA -based methods have not yet entirely replaced traditional culture and phenotypic tests. The paper sum marized rapid immunodiagnostic and DNA -based detection methods for known bacterial pathogens in plants or plant products, which often manifest no symptoms of disease, and new me thods for identifying and characterizing bacteria disease diagnosis.
Key words:pathogenic bacteria; immunodiagnosis; DNA -based detection; genomic probe; polyphasic
analysis diagnosis
细菌是仅次于真菌和病毒的重要植物病原物。迄今已知由细菌引起的病害在500种以上, 其中青枯病、软腐病、马铃薯环腐病以及水稻白叶
-2]枯病等都是世界性重要病害[1。病原细菌鉴定
1
2
腐生细菌就更加困难。在过去10年中, 细菌鉴定
的基因组技术的快速发展极大地简化和促进了病菌的检测鉴定工作, 目前已报道了多种常见植物病原细菌检测的PCR 引物序列。与传统检测方法相比, 现代分子生物学技术应用可大大提高检测灵敏度和准确度, 并使得快速检测大样本的操作成为可能。但由于试剂、设备、试验人员以及方法本身的局限, 利用选择性培养基分离培养或采用免疫诊断进行确定性试验一直是细菌病害诊断的普遍作法。
和细菌病害诊断始终是细菌学家和植物病理学家的重要工作。然而至今还没有一套仅靠少数指标就能准确鉴定细菌和诊断细菌病害的简便方法, 细菌病害诊断往往需要综合方法。
细菌表型和基因型特征作为细菌鉴定的依据可相互印证。对已知细菌的诊断只需症状识别和快速检验等简单程序, 但对未知病菌的诊断则要有田间观察、染病植物组织检查和基于柯赫氏法则的病菌分离鉴定等步骤, 鉴定遍布于环境中的
*
1 已有的细菌检测方法
了解传播体来源、估计病害发生趋势是控制
作者简介:刘学敏, 男, 博士, 教授, 从事植物病理学教学和研究。:
212菌 物 研 究2009年
病原细菌传播为害的基础。有多种传统和现代技术都可检测种子、植株残体、土壤和水中存在的已知病原细菌[3]。由于多数细菌病害是通过种子或繁殖材料传播的, 因此快速检测植物产品的带菌情况非常重要, 国际贸易中更是如此。细菌检测的一般程序是利用选择性培养基从种子或植物浸出物中分离病菌, 然后根据形态学和生理生化特征鉴定菌落, 继而进行致病性测定。完成一次检验往往需要1周乃至数周时间, 不能满足生产的要求。因此需要有快速、准确的检测方法以取代繁琐、耗时的分离培养和致病性测定方法。111 免疫诊断
细菌细胞表面具有蛋白质、脂多糖(LPS)和胞外多糖等抗原分子, 利用多克隆抗血清可以鉴定细菌的种。尽管优良的抗体可以显示鉴定病菌的特征, 但其与不相关种的交叉反应是普遍存在的, 因此难以查清抗血清的专化性范围。杂交瘤技术的发展为单克隆抗体(MAbs) 的制备提供了方向。由于鼠骨髓瘤细胞系分泌的抗体对单个抗原决定部位显示唯一特性, 杂交瘤产生特定的抗体, 因此直接改良细菌血清学是可能的, 这使得不同实验室的检测结果可以重复。
杂交瘤技术很快被用于制备病原细菌的单克隆抗体, 进行病菌特异性和流行学研究[4]。其中许多抗体被大量靶标菌系验证, 甚至亲缘较远的细菌也能共享公共的抗原决定部位, 这对于认识与同一抗体反应的非相关细菌非常重要。一旦一个单克隆抗体被完全定性, 根据鉴定的需要, 一组单克隆抗体可被组成综合试剂用来检测病原细菌的属、种、亚种和致病型[5]。此外, 噬菌体展示技术(Phage -display technology) 也被用于筛选检测茄科青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum ) 的特定单克隆抗体。
与制备多克隆抗体相比, 单克隆抗体的制备程序包括数百个杂交瘤细胞系的广泛筛选以鉴定出能分泌期望专化性抗体的惟一细胞系。实际上鉴定一个致病变种与其他成员区别的抗原首先是让它们与各自的单克隆抗体反应, 只有定性为蛋白质、脂多糖(LPS) 或其他化合物的才是抗原。细菌LPS 作为抗原决定部位是在根癌农杆菌(A -grobacterium tume faciens ) 的标准菌系上发现的, 依此制备的单克隆抗体被用于鉴定其生物变种3[7][6]
它的MAbs 不能区别根癌农杆菌(A. tume faciens )
和放射形土壤杆菌(A. radiobacter ) 。黄单胞杆菌间脂多糖的差别在MAbs 之前很久就被研究证明是可用的, 但它是否与致病变种的地位和寄主特异性有关却不清楚。早期研究表明, 鉴别甘蓝黑腐黄单胞(Xanthomonas cam pestris ) 致病变种的许多MAbs 识别不同细菌的LPS 组分[4]。同样通过识别不同LPS 分子的MAbs 区分了引致柑橘溃疡病的地毯草流胶病菌柑橘致病变种(X. ax -onopodis pv. citri ) A 、B 和C 3个致病型[4]。许多单克隆抗体定义的病菌亚种群被包括RFLP 分析在内的多种DNA 检测方法确定的组进一步确定。鉴于血清学变种(serovar) 与毒性、致病性或地理起源的相关性很少发现, 故进一步分型为血清学变种的意义不大。但是无论如何, 在流行学研究中追踪传播体菌系的迁移或者用较少的费用比较菌系的流行适合度, 单克隆抗体都是有用的。
包括凝集检验(agglutination assays) 、ELISA 、Western blot 、免疫荧光(im munofluorescence, IF) 或免疫荧光菌落染色(immunofluorescence colony -staining, IFC) 以及侧流方法(lateral flo w devices) 在内的单克隆抗体和多克隆抗血清对多种形式的检测应用是有效的。与耐热LPS 反应的病菌特异MAbs 的制备使得用于田间和实验室病害快速诊断的普通检测试剂盒的开发成为可能。同样MAbs 也能识别病菌的荚膜和(或) 胞外多糖, 如番茄溃疡病菌(C. michiganensis subsp. Michiganen -sis ) 和青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum ) , 这一特性在许多免疫诊断方式中都是可用的。
111. 1 E LISA 多数病原细菌MAbs 的制备开始都是通过E LISA 方法筛选的, 然后再用其他免疫诊断检测验证。ELISA 是良好的、广泛用于大量样本检测的方法, 而且容易适应自动化要求并且对大规模检验具有重复性相对较好的结果。迄今为止, 运用多克隆和单克隆2种抗体的E LISA 检测方法对植物病原细菌的许多分类单元的鉴定都有效, 快速检测试剂盒也已商业化。ELISA 的灵敏度(105~106c fu/mL)对于鉴定显症植株上的病原细菌和选择性培养基上的菌落是足够的。如果使用能使LPS 释放到溶液中的含有E DTA 和溶菌酶的提纯缓冲液, E LISA 的灵敏度就能提高10倍, 而且在不增加背景读数的情况下提高抗体) [9][8]
第7卷 第3-4期刘学敏等:植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法
213
通过增加信(号) 噪(声) 比(signal B noise) 的方法也能改善灵敏度。此外, 富集技术也能提高检测的灵敏度, 但只能做定性检测[10]。目前已经开发了用不同的酶标在同一个酶联板上检测多个标样的多靶标或复合ELISA 技术, 这一技术被用于番茄溃疡病菌(C. michiganensis subsp. michiganensis ) 和番茄细菌性斑点病菌(X. axonopodis pv. vesica -toria ) 的检测。
11112 侧流方法(Lateral flow devices) 快速侧流方法的应用原理是ELI SA 的初期形式, 但以不同类型的滤纸做黏合反应的固相支持物[11]。英国中央科学实验室已开发出侧流方法检验试剂盒, 可在3min 内一步检测青枯菌(R. solanacer -rum ) [11]。该试剂盒也可用于X. hortorum pv. pelargonii 和E. amylovora 的检测。
11113 免疫荧光(IF) IF 在欧洲被广泛用于种子和繁殖材料中病原细菌的检测。荷兰每年用I F 筛选6万份马铃薯种块以检测其是否存在引起褐腐病的青枯菌(R. solanancearum ) 。IF 技术在法国也被用于检测马铃薯环腐棒形细菌(C. michiganensis subsp. sepedonicus ) , 此外IF 技术也被用于筛查番茄种子中的细菌性溃疡病菌(C. michiganensis subsp. michiganensis ) 。
11114 流式细胞光度术(flow cytometry) 流式细胞光度术是一项细胞或其他微粒快速鉴定和定量的技术, 当它们分别通过液流传感器时, 细胞被结合特异抗体上的荧光染料鉴定, 基于细胞的荧光和其消散光的能力多个细胞参数可被同时确定。待测样品的制备很简单, 只需要过滤细胞悬浮液以去掉大颗粒, 然后用荧光色素标记的抗体染色即可。流式细胞光度术被用于检测番茄种子浸出物中的C. michiganensis subsp. michiganensis , 引起花烛疫病(anthurium blight) 的X. axonopodis pv. die ffenbachiae , 检测油菜(Brassica sp. ) 的种子提取物中的X . campestris pv. cam petris 以及确定马铃薯种薯中的青枯菌(R. solanacearum ) 等。11115 免疫磁性分离(immunomagnetic separati on) 利用由特异抗体包被的顺磁聚苯乙烯珠能够把目标细胞从混合液中分离出来, 接着进行脱洗, 被束缚的细胞可用于PCR, 或当它们是活的就可以在选择性培养基上培养出。112 遗传方法(Genotypic Approaches)
[7]
样本中直接检测已知病菌的遗传学方法, 如利用特异性引物PCR 或PC R 与其他技术相结合的方法检测混合物中的病原细菌[12], 利用复合PCR 同时检测几个病原菌, 新的联合PCR(Co -PC R) 技术也已开发用于水中青枯菌(R. solanacearum ) 的检测。实时PCR(Rea -l time PCR) 技术由于能提供准确和快速病原细菌的检测结果并具有其他的优势而得到应用。此外, DNA 杂交、斑点印迹(do-t blots) 以及依赖于核酸序列的扩增技术(NAS -B A) 也被用于检测细菌[6]。
开发待测目标病菌的特异探针是过去10余年的研究热点。Manulis 等开发了用于X. cam pestris pv. pelargonii 致病变种检测的特异性PC R 探针, 每个样本灵敏度可达10~50cfu, 可准确鉴定显症组织中的潜在病菌。Like wise, Koh 和Nou [16]也开发出了用以检测无症状猕猴桃中细菌性溃疡病菌(P. s yringae pv. actinidae ) 的引物和探针。Cubero 和Graham [17]为X. axno podis pv. citri 开发了一套引物, 它能够鉴别致病型A 和X. auranti f olii 致病型B 和C, 引物是根据I TS 区序列的差异和pth A 基因设计的。根据核糖体序列设计的引物对于X. axnopodis pv. citri A 有很高的特异性, 而根据pth A 基因设计的引物对柑橘细菌性溃疡病的所有类型是通用的。
欧氏杆菌属(Erwinia ) 的病菌能与肠道腐生菌区别, 但是一旦知道属后, 细菌学和血清学检验对鉴定胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜软腐致病变种(E. carotovora subsp. carotovora ) , 胡萝卜软腐欧氏杆菌黑腐致病变种(E. carotovora subsp. a -troseptica ) 和菊欧氏菌(E. chrysanthemi ) 的结果不总是一致。Avrova 等[18]发现菌株的AFLP 分析显示的亚组与亚种名称完全相符, 其中组1包括E. carotovora subsp. carotovora 和E. carotovora subsp. o dori f era ; 组2包括E. carotovora subsp. atrose ptica 和E. carotovora subsp. betavasculorum ; 组3包括E. caroto vo ra subsp. wasabiae; 组4包括E. chrysanthemi 。尽管在混合培养物中不能进行AFLP 分析, 但是用代表性菌株纯培养的病菌多样性的研究将最终允许快速鉴定未知分离以及在诊断中潜在应用。113 其他方法
激光诱导荧光的方法也被开发用作龙舌兰病[19], [15]
[14]
[13]
214菌 物 研 究2009年
(He)) 氖(Ne) 激光做激发源, 体内荧光发射谱在660~790nm 的范围。接种后3d 侵染植株的荧光密度增加, 15d 后又降低, 而未感染的或用杀菌剂处理的植株荧光密度没有明显的改变, 荧光密度比值是病程的指示物[19]。114 检测和鉴定的综合方法
从检测结果的灵敏度和可靠性上看新方法与传统培养方法一致。与培养方法相比较, 扩增假单胞杆菌16S rRNA 位点引物的特异性要高于扩增其16S~23S 间区的引物。特异引物的PCR 与培养法检测相比显示95%的一致, 但是PCR 也鉴定出了7个通过培养法鉴定为阴性的阳性标样。11411 富集检测 在免疫诊断或DNA 的检测前短期培养通常能提高IF 、ELISA 和PCR 的灵敏性。如利用病菌特异MAbs 富集-ELISA 方法检测叶片中X. axono podis pv. die ffenbachiae 或马铃薯种块的E. solanacearum
carotovora subsp.
[10]
合物限制了直接利用PC R 检测天然样本中的目标细菌, 这个问题可采用免疫捕获或免疫磁性分离(I MS) 技术克服。用多克隆抗血清包被的高级磁性珠(AM) 免疫捕获P. syringae pv. s yringae 的最适抚育时间是1h 。与发光团反应产生的免疫捕获检测极限仅是106cfu/mL, 但当免疫捕获由特异PCR 产生时检测极限得以显著提高。提高马铃薯嫩芽提取物E. catoto vo ra subsp. carotovora 回收率的方法是通过与AM 和病菌特异多克隆抗血清的免疫捕获实现的。在12~200L g/mL的范围内颗粒浓度与回收率呈线性关系, 每微克颗粒中有66%的目标细胞被回收。与PC R 结合在每一反应管中这个方法能检测出50个细胞(2@10cfu/mL), I MS-PCR 要比没有I MS 的PCR 的灵敏度高100倍, 在马铃薯嫩芽中目标细胞有105cfu/mL出现时就能检测到[23]。I MS 加PC R 在检测Acidovorax avenae subsp. citrulli 时的灵敏度比直接PCR 提高了100倍
[24]
3
atroseptica 和R.
。甚至不能满足菌落鉴定需要的
有限培养步骤也能使E LISA 检测灵敏度提高约
1万倍, 富集检测具有只有活的细胞才能产生阳性信号的优势。免疫荧光菌落染色(IFC) 技术是把用于菌落检测的倾倒平板的富集步骤与荧光染料标记的抗体结合, 它能使IF 的灵敏度提高约1万倍[20]。其中活细胞增殖形成的微菌落能在40~60倍荧光体视显微镜下观察到, 而单个(死的) 细胞在这样低的放大倍数下则不能观察到[21]。IFC 技术更多地用于流行学研究以及判断其他不能区别活、死细胞检测方法所得结果的可靠性
[20]
。
11413 免疫荧光(I F ) 和荧光原位杂交(FISH) 与23S rRNA 探针的荧光原位杂交(FISH)技术被用于检测马铃薯嫩芽青枯菌(R. solanacearum ) 3号小种的生物变种2[6]。对R. solanacearum 特异的探针被进一步用于马铃薯样本病菌鉴定, 其结果与通过病菌特异免疫荧光(IF) 检测一致。在快速(1d) 检验中2个独立方法的运用能直接提高阳性检测结果的置信界限, 而这一点对于主要作物繁殖材料的大规模筛查尤为重要。
11414 病菌检测的多相方法 Van Overbeek [21]等采用了多种方法研究大批量土壤和番茄根际土壤中青枯菌(R. solanacearum ) 已知菌系的动态变化, 用FISH 方法确定经生防菌株P. corrugata 处理的根集群中病菌的差异。PC R 与密度梯度凝胶电泳(DGGE) 分析技术相结合为确定P. corrugata 与R. solanacearum 的拮抗作用提供依据。其中强带只在含有病菌的土壤剖面中显示出来, 而R. solanacearum 的弱带则在混合系统的土壤剖面中被检测到。为了进一步验证, 他们采用活菌计数法、gfp 遗传标记和血清学技术(IFC) 追踪已知R. solanacearum 菌株的传播。这些复合检测方法的应用进一步证实和确认了通过分子检测获得的结[21]
。
选择性培养基上目标细菌的富集也能提高
PC R 反应的灵敏度, 在PCR 反应前从培养皿中收集菌落活细胞的检测通常被称为生物-PCR (BI O -PCR) 。尽管从死细菌中也能得到小的扩增子(amplic ons) , 但是主要的条带都是由活细胞DNA 扩增产生的。应用BIO-PCR 技术Sakthivel 等检测到每一反应管中55fg 的DNA 标样(约相当于每一反应管中有7个X. oryzae pv. oryzae 细胞或者原始样本中的70cfu/m L) [22]。利用BIO-PC R 方法检测被污染的P. cepacia 样本只需要在液体培养基中培养24h, 提纯DNA, 然后用特异引物进行PC R, 全部检测在27h 内即可完成, 而目标细菌的分离和鉴定的标准方法则需要5~6d 。11[12]
第7卷 第3-4期刘学敏等:植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法
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2 病害诊断
诊断目的是证实染病组织中存在可疑病菌, 已有多种方法可用于诊断, 但要解决田间诊断的问题往往需要多个方法相结合[25]。Stowell 和Gelernter [25]指出, 为及时采取有效防治措施, 对草坪病害必须在72h 内做出诊断。此外, 还要考虑非生物因素, 鉴于没有足够的时间分离病菌, 对真菌和线虫引致的侵染性病害还可通过访问、经验判断以及显微镜观察等相结合的方法做出诊断, 早期这些原则也被用于细菌病害的诊断。除非必要情况一般很少使用显微镜, 分离培养或用特异的试验鉴定可疑生物体是必要的, 但这一程序会明显延误诊断。
211 寄主列表和描述症状
采用现有方法和积累的大量资料, 许多细菌性病害都能被快速、准确诊断。方法是首先查阅记载已知病害的寄主列表、典型症状和特殊寄主上已知的潜在病菌。目前许多细菌侵染的寄主植物和引致的病害都已被编成详细的列表, 鉴于出版后细菌的分类地位可能会发生变动, 因此目录需使用修订后的名字。212 分离培养
细菌是发病的原因, 因此一旦找到新的、比分离培养更灵敏和高效的方法, 就会被用于检测是否存在病菌, 进而与病菌分离和致病性实验相比较以证明检测结果的可靠性。这里的困难主要是从长满腐生菌的培养基中准确挑选出假定的病菌。熟悉腐生菌的基本特征将有助于准确选定病菌, 通常根据病菌在普通培养基上不同生长阶段的特征确定的分离物要比利用选择性培养基筛选更有效。
213 病菌假定鉴定
获得某一属分离物后只要根据少数关键特征就能对病害进行快速诊断。鉴定和选择性培养基的分离同时运用对于假定鉴定的第二阶段非常有用。用牙签把单个菌落从最初的培养皿中移至一系列培养基上的特定位置, 记录其24~72h 的生长特征。如通过革兰氏染色和氧化酶检测等少数方法把7个番茄病原细菌菌株很快区分为1个属, 然后将它们转移到一系列特征选择性培养基上, 再根据他们在YDC, KMB, FS, E T, MS, CVP, D172h 内, 通过这组试验将快速鉴别出E. carotovo -ra , C. michiganensis, X. axono podis pv. vesicatori -a, P. s yringae, P. corrugata, R. solanacearum, A. tume f aciens 和Pantoea herbicola, Enterobacter agglomerans, Micrococcus luteus 以及Stenotro phomon -as maltophilia 等腐生污染菌。类似的快速诊断方案也能够鉴定其他已知细菌病害, 诊断专家也可用其制定自己熟悉的特定寄主潜在病菌症状的鉴定方案。214 致病性测定
病菌的最终确认一般要通过致病性测定来实现, 但致病性实验需要时间, 还要有合适的寄主材料、适当的环境条件以及对照等。有些病菌能在烟草上引起过敏性反应, 这一特性可用于致病性测定, 但其他病菌很少或不引起HR 反应。在合适条件下许多病菌3~4d 即可诱导出叶斑症状, 因此通过致病性实验鉴定叶斑病菌效果较好。在既没有致病性测验也没有过敏性反应的情况下, 利用单克隆抗体进行快速免疫诊断检测或用致病变种特异引物PCR 检测也能区别类似于P. sy -ringae pv. tomato 和P. syringae pv. syringae 密切相关的致病变种。致病性测验对潜伏期长的病菌不适合, 如C. michiganensis subsp. michiganensis 的高毒力菌株侵染番茄茎3~4d 可显症, 中等毒力菌株需要7~10d, 而有些菌株则要在接种21~28d 后才能表现症状。
215 免疫诊断和DN A 检测
致病性检验需要长的潜育期, 因此如果用于分析的数据库是有用的, 运用快速免疫诊断或DNA 检测更有效。如运用免疫诊断检测或rep -PC R 指纹分析可把C. michiganensis susp. michi-ganensis 鉴定到种和亚种[18]。利用发表的引物直接PCR 能检测许多菌株, 但在对世界范围的菌株收集物的检测中观察到了比用免疫诊断检测更多的假阳性和假阴性反应结果。
已经证明免疫诊断和PCR 方法对特殊病菌的直接鉴定是可用的。当有病菌的纯培养时, 鉴定结果可用DNA 指纹进一步验证[18]。目前已经开发出了从植物组织中直接鉴定病菌的试剂盒, 这些试剂盒可确认显症叶片和茎组织中的已知病菌, 引起植株显症的细菌细胞数量足以使免疫诊断和DNA 检测方法产生阳性反应结果。但在未,
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2009年
潜伏侵染阶段的病害。不过分离培养、富集ELISA 以及BI O-PC R 等方法在潜伏侵染阶段的组织中未检出病菌的比例也很高[26]。此外, 分子检测方法规定非常小的样本, 在这种情况下很少或没有办法建立对潜伏侵染组织检测的正确方法。
216 其他方法
利用快速检测方法鉴定细菌纯培养是可行的, 其中脂肪酸甲基酯分析、代谢测验、DNA 序列分析等方法已被用于商业服务, 此外细菌鉴定的代谢检验方法也被广泛应用。
21611 诊断新的或未知的病菌和病害 诊断新病害是非常复杂的工作, 而且要求操作者要比确定已知寄主上假定存在的病菌有更多的经验。没有简单的实验可使问题容易解决, 确切地说, 着眼点必需集中在显微镜检查和病菌与病害症状的最初联系上, 一旦证明病害是由细菌侵染引起的就可利用前面叙述的方法进行鉴定。
21612 病菌纯培表型和基因型检测 诊断真正的未知病菌引起的病害时, 采用划线稀释以获得病菌纯培养且在合适的条件下进行致病性鉴定是必要的。此外代谢实验、代谢底物分析、脂肪甲基酯分析和16S rDNA 分析等相对用较少的实验也能用于细菌的进一步鉴定。要注意科学解释检验的结果, 尤其鉴定那些目前还没有被描述的细菌引起的病害。如在鉴定引起澳洲坚果、兰和生姜等植物病害的细菌时, 利用代谢检测(API 条带分析) 、FAME 分析和16S rDNA 序列分析等3种方法把所得细菌的纯培养确定为4个不同的种名, 该菌株与已知种相比较, 序列相似性少于9715%, 因此不能通过16S rDNA 分析鉴定。产生这种结果的原因显然是由于各种分析方法的数据库中没有准确描述该未知标样, 可见在确定采用来自于数据库的名称之前进行基础细菌学实验的重要性, 而不必考虑获得类似标准的分析方法是否精确。
21613 多种诊断方法的综合) 多相分析 多相分析一直被认为是鉴定新病菌的最可靠方法[27]。一旦通过控制条件实验证明病菌的致病力, 属就可通过基本的细菌学实验加以确定, 最终通过基因型检验方法鉴定细菌。16S rDNA 数据与典型菌株表型数据比较有助于选择确定性实验方法, Concalves 等运用多相分析方法鉴定未曾被描述的西番莲果和菜蓟病菌, 他们首先用普通培养基从西番莲植株中分离了1个病菌并鉴定其为Xanthomonas campestris 。以后他们又从西番莲果中分离到了55个黄单胞菌株并采用RAPD 分析、B OX 、E RIC 、REP 引物的rep-PCR 、16S~23S rDNA 基因间隔区(intergenic spacer region) 的RFLP 、稀有内切酶消化的基因组DNA 的脉冲场凝胶电泳(PFGE)、AFLP 以及细胞全蛋白SDS-PAGE 等多种方法检查了它们的遗传变异。这些方法建立了Xanthomonas 种的基本外形特征, 但还是不能确定寄生西番莲Xanthomonas 菌株的分类地位。最后利用DNA-DNA 杂交技术把它们定为X. ax -onopodis pv. passi f lorae 。
3 结 语
准确诊断病害需要发病田、实验室观察以及病菌的准确鉴定等程序, 环境中变异较大的病原细菌通常还需要多种互补实验才能得到最终鉴定。尽管诊断方法和试剂都是可靠的, 但也必须了解标准菌株的基本特征才能对未知菌株予以准确诊断。因此详尽研究标准菌株的变异对鉴定十分必要, 特异性PCR 引物或抗体必须是靶标菌鉴定方法中列出的, 这样才可作为检验标准以鉴定待测菌株。通常一般的分类鉴定可通过细胞表面抗原分子鉴定等少量表型特征实现, 这使得免疫诊断方法得以健康发展, 它能在几分钟完成常规实验需要数小时乃至数天才能完成的鉴定性实验。
适当的取样方法对诊断也很重要, 尤其是检测发病植株、繁殖材料、土壤以及植物残体上的病菌。在微克级的样品检验中, 由于样本的体积太小而会使真实情况被掩盖, 因此与最初病菌接种体密度相关的流行学数据对于建立证明程序的临界侵染水平是必需的, 这就需要找到合适的方法使被检验的材料缩减到需要小的体积。此外, 新方法的极端灵敏度对大量过境植物和植物产品检验也不具有实际意义。生物芯片[29]和阵列传统器[30]的加速运用可能用于病菌检测鉴定, 此外包
[31]
括生物芯片或者电子鼻等新方法的使用在大样本的检疫性病菌的检测中将会有很好的前景。参考文献:
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