现代食品科技
Modern Food Science and Technology 2012, Vol.28, No.12
自筛菌株PM-1脂肪酶的提取及 对脱脂乳风味改进的研究
苗君莅，张锋华，肖杨，任璐，蔡涛，王辉
（乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业研究院，上海 200436）
摘要：本文将筛选到的、对乳脂肪有高度专一性的脂肪酶高产菌株PM-1得的粗酶提取液是原上清液酶活的4.5倍。将粗酶液发酵稀奶油产物用于90%脱脂乳中，感官评定效果良好，90%脱脂乳中的游离脂肪酸和挥发性风味物质可知，增香后的90%脱脂乳中中链及部分长链脂肪酸增加，显著增长。从而肯定了该菌株所产脂肪酶的应用潜质。
关键词：脂肪酶；提取；风味；应用 文章篇号：1673-9078(2012)12-1751-1754
MIAO Jun-li, ZHANGANG Hui
Abstract: hydrolyzed cream by Key words:
[1]。脂肪
果等食品中以达到增加产品奶油香气、标准化不同生产批次产品感官特性等效果。
作者从天然干酪中筛选到了对乳脂肪有高度专一性的脂肪酶高产菌株PM-1，本文将该菌株所产脂肪酶进行初步的分离纯化，而后验证了酶解稀奶油产物用于改善脱脂乳风味的效果。从而确定了该菌株及其
收稿日期：2012-07-19
作者简介：苗君莅（1979-），女，工程师，研究方向：乳品加工
脂肪酶的应用效果和价值，为脂肪酶的进一步提纯奠定基础，为脂肪酶的工业化生产提供了可能。 1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌种
自筛菌株PM-1。 1.1.2 培养基[3~4]
液体产酶培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母浸膏1.5，氯化钠5.0，可溶性淀粉1.0，磷酸氢二钾2.5，乳化稀奶油25.0。 1.1.3 试剂和仪器
蛋白胨、酵母膏、可溶性淀粉、磷酸氢二钾、聚乙烯醇、硫酸铵：均为分析纯，购自上海国药化学试剂有限公司。稀奶油：食品级，光明乳业乳品二厂。 数显恒温搅拌循环水箱HH-60，常州国华电器有限公司；恒温培养振荡器ZHWY -200，上海智城分析仪器制造有限公司；恒温恒湿培养箱KBF115，德国
1751
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2012, Vol.28, No.12
宾得公司。 1.2 方法
1.2.1 脂肪酶活力测定[5]
A 、B 两个锥形瓶，A 为空白对照，B 为样品瓶。分别在两个瓶中加入5 mL磷酸缓冲液和4 mL稀奶油乳化液，28 ℃水浴保温5 min，在B 瓶中加入1 mL酶液。反应10 min ，取出后立即在两瓶中都加入95%的乙醇15 mL ，在A 瓶中加入1 mL 酶液。滴加3滴酚酞，用0.05 mol/L NaOH滴定。
酶活力(U/mL)=(V-V 0)/t 50
式中：V -滴定样液所消耗的NaOH 体积(mL)；V 0-滴定空白样液所消耗的NaOH 体积(mL)；T-反应时间(min)；N-样品的稀释倍数。
1.2.5 感官评价
参照GB/T 14454.2-2008对加入酶解产物的牛奶进行感官评定。
香气评定结果用分数表示（满分为40分），选用纯正（39.1分~40.0分）、较纯正（36.0分~39.0分）、可以（32.0分~35.9分）、尚可（28.0分~31.9分）、及格（24.0分~27.9分）和不及格（24.0分以下）表述。 1.2.6 固相微萃取（SPME ）
萃取条件：萃取温度70 30 min；平衡时间30 min；解析时间3 min。 1.2.7 GC-MS 条件[7~9]
1.2.7.1 色谱条件
℃；m×0.25 mm×0.25 µm ，2 ℃每分钟到230 20 min；He ，流速：1 mL/min。
150 ℃。
NIST library (107k Wiley Library (320k Compound Version 800（最大值一化法计算。 2 结果与讨论
2.1 脂肪酶粗品的盐析范围
对发酵上清液进行硫酸铵分级沉淀，结果见图1。当硫酸铵饱和度在40%以下时，沉淀的酶活力很小；当硫酸铵饱和度为60%时，沉淀的酶活最高；而当硫酸铵饱和度为60%以上时，沉淀酶活明显降低。因此，确定硫酸铵饱和度范围为60%。
1.2.2 粗酶液的提取6 1.2.2.1 发酵液的收集
将菌株PM-1种子液以2%接种量接入液体产酶培养基中，摇床180 r/min、28 ℃，培养72 h。 1.2.2.2 盐析范围的确定
发酵液12000 r/min离心10 min后，取上清液加入20%饱和度的硫酸铵，搅拌2 h，静置过夜，12000 r/min离心10 min ，将沉淀的蛋白重新溶解于pH 7.5的磷酸缓冲液中，测液体酶活。上清液以相同的方法加入40%饱和度的硫酸铵，以此类推再分别测定80%、100%最适的硫酸铵沉淀饱和度。 1.2.2.3 粗酶液纯化提取
中，℃旋转蒸发，得到浓缩粗酶液。1.2.3 ℃，24 95 ℃水浴保温0.5%添加量，加入至→均质→杀菌→冷却，品 1.2.4
度。酸值（Acid Value）是指中和1g 乳脂肪中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的量(mg)(GB/T 5530-2005)。
AV(mg KOH/g)=
56.1×C×V
m
［］
图1 硫酸铵分级沉淀
Fig.1 Ammonium sulfate fractional precipitation
式中：C-所用KOH 标准溶液的浓度（mol/L）；V-所用KOH 标准溶液的体积（mL ）；m-样品的质量（g ）；56.1-氢氧化钾的摩尔质量（g/mol）。
2.2 粗酶液的酶活
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硫酸铵沉淀的活性蛋白，经过溶解、透析脱盐、蒸发浓缩后，滴定法测得的酶活力为8.77 U/mL，是发酵上清液酶活力（1.95 U/mL）的4.5倍。 2.3 酶解稀奶油的应用效果
2.3.1 感官评价
将酸值13.00 mg/g的酶解产物以0.5%（V/V）添加量加入至90%脱脂乳中，制得的增香牛奶感官评价分数均为39.0分以上。因此判断，此脂肪酶酶解稀奶油产物
脱脂乳的风味物质测定，对奶香贡献较大的特征性风味物质增长了一倍以上，其中，除作为乳香重要组成成分的中、短链及部分长链游离脂肪酸增长外，具有奶油甜味的酮类、对奶香有特别贡献的酯类[11]、以及醛类都有显著增长。因此，从挥发性风味物质的角度证明了该脂肪酶酶解产物的加入，改进了90%脱脂乳的风味。
1753
3 结论
将对乳脂肪有高度专一性的脂肪酶高产菌株PM-1发酵，上清液经硫酸铵沉淀、透析脱盐、蒸发浓缩后
获得的粗酶提取液酶活8.77 U/mL，是发酵上清液的4.5倍。将粗酶液发酵稀奶油产物用于90%脱脂乳中，对其风味改善进行感官评定，效果良好。通过对增香前后90%脱脂乳中的游离脂肪酸和挥发性风味物质进行比
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较，作为乳香重要成分的中链及部分长链脂肪酸显著增加，特征性风味物质总量增长一倍以上，具有奶油味、奶味的醛类、酮类及酯类显著增加，因而，从原理上解释了90%脱脂乳风味得到改善的原因，证明了该脂肪酶可用于增强乳品相关风味的应用前景。从而，为该菌株及所产脂肪酶的进一步提纯与应用奠定了基础。 参考文献
[1] Haki GD, Rakshit SK. Developments in industrially
important thermostable enzymes: a review [J]. Bioresource Technology, 2003, 89(1): 17-34
[2] MAFALDA A R,BETINA M C. Flavour Development via
Lipolysis of Milkfats:Changes in Free Fatty Acid Pool [J]. International Journal of Food Science and Technology, 2007, 42(8): 961-968
[3] 曾璐, 林亲录, 王伟. 脂肪酶产生菌产酶条件的研究[J].现代
食品科技.2007,23(7):15-21
[4] V ijay G, Debabrata D. Lipase fermentation:progress and
prospects [J]. Indian Journal of Biotechnology, 2005, 4: 437-
[5] L Chen, T Coolbear, R M Daniel. Characteristics of
proteinases and lipases produced by seven Bacillus sp. isolated from milk powder production lines [J]. International Dairy Journal, 2004, 14: 495-504
[6] 尚喜雨, 柯涛, 王玲玲, 等. 产脂肪酶酵母的筛选及菌种鉴定[J].
安徽农业科学,2010,38(20):10512-10513
[7] 郭冉冉. 高产脂肪酶菌株的筛选及酶学性质的研究[D].重庆:
西南大学,2010
[8] 刘志东, 王荫榆, 郭本恒, 等. 的影响[J].食品工业科技[9] 侯园园. :
江南大学,2008
[10] 陈影. :天津科技
大学[11] 332
. ,2011,27(6):655-657
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自筛菌株PM-1脂肪酶的提取及 对脱脂乳风味改进的研究
苗君莅，张锋华，肖杨，任璐，蔡涛，王辉
（乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业研究院，上海 200436）
摘要：本文将筛选到的、对乳脂肪有高度专一性的脂肪酶高产菌株PM-1得的粗酶提取液是原上清液酶活的4.5倍。将粗酶液发酵稀奶油产物用于90%脱脂乳中，感官评定效果良好，90%脱脂乳中的游离脂肪酸和挥发性风味物质可知，增香后的90%脱脂乳中中链及部分长链脂肪酸增加，显著增长。从而肯定了该菌株所产脂肪酶的应用潜质。
关键词：脂肪酶；提取；风味；应用 文章篇号：1673-9078(2012)12-1751-1754
MIAO Jun-li, ZHANGANG Hui
Abstract: hydrolyzed cream by Key words:
[1]。脂肪
果等食品中以达到增加产品奶油香气、标准化不同生产批次产品感官特性等效果。
作者从天然干酪中筛选到了对乳脂肪有高度专一性的脂肪酶高产菌株PM-1，本文将该菌株所产脂肪酶进行初步的分离纯化，而后验证了酶解稀奶油产物用于改善脱脂乳风味的效果。从而确定了该菌株及其
收稿日期：2012-07-19
作者简介：苗君莅（1979-），女，工程师，研究方向：乳品加工
脂肪酶的应用效果和价值，为脂肪酶的进一步提纯奠定基础，为脂肪酶的工业化生产提供了可能。 1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌种
自筛菌株PM-1。 1.1.2 培养基[3~4]
液体产酶培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母浸膏1.5，氯化钠5.0，可溶性淀粉1.0，磷酸氢二钾2.5，乳化稀奶油25.0。 1.1.3 试剂和仪器
蛋白胨、酵母膏、可溶性淀粉、磷酸氢二钾、聚乙烯醇、硫酸铵：均为分析纯，购自上海国药化学试剂有限公司。稀奶油：食品级，光明乳业乳品二厂。 数显恒温搅拌循环水箱HH-60，常州国华电器有限公司；恒温培养振荡器ZHWY -200，上海智城分析仪器制造有限公司；恒温恒湿培养箱KBF115，德国
1751
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2012, Vol.28, No.12
宾得公司。 1.2 方法
1.2.1 脂肪酶活力测定[5]
A 、B 两个锥形瓶，A 为空白对照，B 为样品瓶。分别在两个瓶中加入5 mL磷酸缓冲液和4 mL稀奶油乳化液，28 ℃水浴保温5 min，在B 瓶中加入1 mL酶液。反应10 min ，取出后立即在两瓶中都加入95%的乙醇15 mL ，在A 瓶中加入1 mL 酶液。滴加3滴酚酞，用0.05 mol/L NaOH滴定。
酶活力(U/mL)=(V-V 0)/t 50
式中：V -滴定样液所消耗的NaOH 体积(mL)；V 0-滴定空白样液所消耗的NaOH 体积(mL)；T-反应时间(min)；N-样品的稀释倍数。
1.2.5 感官评价
参照GB/T 14454.2-2008对加入酶解产物的牛奶进行感官评定。
香气评定结果用分数表示（满分为40分），选用纯正（39.1分~40.0分）、较纯正（36.0分~39.0分）、可以（32.0分~35.9分）、尚可（28.0分~31.9分）、及格（24.0分~27.9分）和不及格（24.0分以下）表述。 1.2.6 固相微萃取（SPME ）
萃取条件：萃取温度70 30 min；平衡时间30 min；解析时间3 min。 1.2.7 GC-MS 条件[7~9]
1.2.7.1 色谱条件
℃；m×0.25 mm×0.25 µm ，2 ℃每分钟到230 20 min；He ，流速：1 mL/min。
150 ℃。
NIST library (107k Wiley Library (320k Compound Version 800（最大值一化法计算。 2 结果与讨论
2.1 脂肪酶粗品的盐析范围
对发酵上清液进行硫酸铵分级沉淀，结果见图1。当硫酸铵饱和度在40%以下时，沉淀的酶活力很小；当硫酸铵饱和度为60%时，沉淀的酶活最高；而当硫酸铵饱和度为60%以上时，沉淀酶活明显降低。因此，确定硫酸铵饱和度范围为60%。
1.2.2 粗酶液的提取6 1.2.2.1 发酵液的收集
将菌株PM-1种子液以2%接种量接入液体产酶培养基中，摇床180 r/min、28 ℃，培养72 h。 1.2.2.2 盐析范围的确定
发酵液12000 r/min离心10 min后，取上清液加入20%饱和度的硫酸铵，搅拌2 h，静置过夜，12000 r/min离心10 min ，将沉淀的蛋白重新溶解于pH 7.5的磷酸缓冲液中，测液体酶活。上清液以相同的方法加入40%饱和度的硫酸铵，以此类推再分别测定80%、100%最适的硫酸铵沉淀饱和度。 1.2.2.3 粗酶液纯化提取
中，℃旋转蒸发，得到浓缩粗酶液。1.2.3 ℃，24 95 ℃水浴保温0.5%添加量，加入至→均质→杀菌→冷却，品 1.2.4
度。酸值（Acid Value）是指中和1g 乳脂肪中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的量(mg)(GB/T 5530-2005)。
AV(mg KOH/g)=
56.1×C×V
m
［］
图1 硫酸铵分级沉淀
Fig.1 Ammonium sulfate fractional precipitation
式中：C-所用KOH 标准溶液的浓度（mol/L）；V-所用KOH 标准溶液的体积（mL ）；m-样品的质量（g ）；56.1-氢氧化钾的摩尔质量（g/mol）。
2.2 粗酶液的酶活
1752
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2012, Vol.28, No.12
硫酸铵沉淀的活性蛋白，经过溶解、透析脱盐、蒸发浓缩后，滴定法测得的酶活力为8.77 U/mL，是发酵上清液酶活力（1.95 U/mL）的4.5倍。 2.3 酶解稀奶油的应用效果
2.3.1 感官评价
将酸值13.00 mg/g的酶解产物以0.5%（V/V）添加量加入至90%脱脂乳中，制得的增香牛奶感官评价分数均为39.0分以上。因此判断，此脂肪酶酶解稀奶油产物
脱脂乳的风味物质测定，对奶香贡献较大的特征性风味物质增长了一倍以上，其中，除作为乳香重要组成成分的中、短链及部分长链游离脂肪酸增长外，具有奶油甜味的酮类、对奶香有特别贡献的酯类[11]、以及醛类都有显著增长。因此，从挥发性风味物质的角度证明了该脂肪酶酶解产物的加入，改进了90%脱脂乳的风味。
1753
3 结论
将对乳脂肪有高度专一性的脂肪酶高产菌株PM-1发酵，上清液经硫酸铵沉淀、透析脱盐、蒸发浓缩后
获得的粗酶提取液酶活8.77 U/mL，是发酵上清液的4.5倍。将粗酶液发酵稀奶油产物用于90%脱脂乳中，对其风味改善进行感官评定，效果良好。通过对增香前后90%脱脂乳中的游离脂肪酸和挥发性风味物质进行比
现代食品科技 Modern Food Science and Technology
445
2012, Vol.28, No.12
较，作为乳香重要成分的中链及部分长链脂肪酸显著增加，特征性风味物质总量增长一倍以上，具有奶油味、奶味的醛类、酮类及酯类显著增加，因而，从原理上解释了90%脱脂乳风味得到改善的原因，证明了该脂肪酶可用于增强乳品相关风味的应用前景。从而，为该菌株及所产脂肪酶的进一步提纯与应用奠定了基础。 参考文献
[1] Haki GD, Rakshit SK. Developments in industrially
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[2] MAFALDA A R,BETINA M C. Flavour Development via
Lipolysis of Milkfats:Changes in Free Fatty Acid Pool [J]. International Journal of Food Science and Technology, 2007, 42(8): 961-968
[3] 曾璐, 林亲录, 王伟. 脂肪酶产生菌产酶条件的研究[J].现代
食品科技.2007,23(7):15-21
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prospects [J]. Indian Journal of Biotechnology, 2005, 4: 437-
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proteinases and lipases produced by seven Bacillus sp. isolated from milk powder production lines [J]. International Dairy Journal, 2004, 14: 495-504
[6] 尚喜雨, 柯涛, 王玲玲, 等. 产脂肪酶酵母的筛选及菌种鉴定[J].
安徽农业科学,2010,38(20):10512-10513
[7] 郭冉冉. 高产脂肪酶菌株的筛选及酶学性质的研究[D].重庆:
西南大学,2010
[8] 刘志东, 王荫榆, 郭本恒, 等. 的影响[J].食品工业科技[9] 侯园园. :
江南大学,2008
[10] 陈影. :天津科技
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. ,2011,27(6):655-657
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