乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究
摘要:乳酸菌是一类具有多种生理功能的细菌，本文通过阐述乳酸菌不同来源的分离鉴定方式，探讨了乳酸菌的部分主要生理功能。
关键词:乳酸菌 分离鉴定 功能
Abstract: Lactic acid bacteria are a kind of many physiological functions of bacteria, this paper explains the separated and identified from different sources of lactic acid bacteria, and probes into the way of its part main physiological function.
Keywords: lactic acid bacteria separated and identified function
乳酸菌是一类广泛分布于自然界、与人类生活密切相关、可发酵碳水化合物、产生乳酸的细菌，然而，乳酸菌的许多特性是由其基因编码决定的【1】，利用这一特性，人们可以用乳酸菌作为载体，在食品及医药领域中构建表达系统。乳酸菌具有控制肠道感染，改善乳糖代谢，增加某些食物的营养价值，诱导体内特异性及非特异性免疫等作用。
乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状或球状，生殖方式为裂殖，消耗葡萄糖50％以上，产生乳酸分解蛋白质，但不产生腐败产物，不形成内生孢子，无运动性或极少运动，目前己发现的乳酸菌在细菌分类学上有18个属
功能。
一、乳酸菌的分离鉴定
乳酸菌的来源广泛，腌菜、发酵肉制品、腐乳、酱醅、牛乳等食物中乳酸菌的含量极其丰富。
（一） 腌菜盐水中乳酸菌的分离与鉴定
乳酸菌广泛存在于泡菜和腌菜等食品中，此类乳酸菌较耐盐，因此，以腌菜为样品，分离优良乳酸菌株，将其应用到含盐量较大的食品中，可以改善食品的风味，提高食品的质量。通过建立下列几种培养基【3】【2】。通过对乳酸菌分离鉴定，可测定其生理可以对腌菜盐水中的乳酸菌进行分离、鉴定：
1、种子培养基：酵母膏7．5g，蛋白胨7．5g，葡萄糖10g，西红柿汁100 ml，吐温80 0.5ml，蒸馏水900ml，KH2PO4 2g，调pH7．0(若配制固体培养基，琼脂添加量为2％)；
2、乳酸纸层析试验培养基：蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，吐温80 0．5ml，葡萄糖l0g，蒸馏水1000ml，1．6％溴甲酚紫1．4ml，调pH6．8—7；
3、鉴别培养基：蛋白胨水培养基，碳水化合物发酵培养基，硝酸盐培养基等生理生化
培养基。
（二）发酵肉制品中乳酸菌的分离鉴定
发酵肉制品是乳酸菌发酵鲜肉而制成的风味特殊肉制品。参与发酵的乳酸菌可以利用原料中的碳水化合物，分泌乳酸菌素，产生有机酸、酒精和二氧化碳等，抑制腐败菌和致病菌的生长，对病原菌和有害菌有抑制作用。同时，乳酸菌可增加食品的可消化性并产生一些维生素、抗氧化剂；能够分解部分氨基酸，产生独特的香味物质，赋予产品独特的风味和质地。另外，乳酸菌可促使亚硝酸盐向一氧化氮肌红蛋白转化，减少了产品中的亚硝酸盐残留量，同时形成良好色泽。通过建立以下培养基
的分离鉴定工作：
1、乳酸菌分离：MRS培养基；
2、乳酸菌鉴定：糖发酵培养基，甲基红(M.R)培养基，乙酰甲基甲醇(v—P)培养基，靛基质(吲哚)培养基，产H2S培养基，尿素酶培养基，触酶(H2O2)培养基，硝酸盐还原培养基，中性红油脂培养基，淀粉琼脂培养基，脱脂牛乳琼脂培养基，石蕊牛乳培养基；
3、乳酸菌抑菌试验：LB琼脂培养基。
（三）腐乳中乳酸菌的分离鉴定
腐乳中含有高水平的适度耐盐菌，其主导耐盐微生物是耐盐乳酸菌，它在腐乳的腌制和后酵过程中起着非常重要的作用，一定数量的乳酸菌在后酵过程中对腐乳风味物质的形成具有积极意义。通过建立下列几种培养基【5】【4】系统可完成发酵肉制品中乳酸菌可以对腐乳中的乳酸菌进行分离、鉴定：
1、MRS液体培养基(用于乳酸菌富集培养)：蛋白胨10g，牛肉膏8g，酵母膏4g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二氨2g，吐温8O 1 mL，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0．04g，MgSO4·7H2O 0．2g，水1000 mL。pH 自然，121℃灭菌15 min；
2、改良MRS培养基(用于乳酸菌分离纯化)：向MRS培养基中加入2%的琼脂，3%碳酸钙。灭菌后放入6O℃恒温水浴中备用，用前加入0．1%的纳他霉素，抑制霉菌和酵母菌生长；
3、MRS琼脂培养基(用于乳酸菌保存计数)：向MRS培养基中加入2%的琼脂。
(四)酱醅中乳酸菌的分离鉴定
豆酱和酱油独特风味的形成是多种微生物相互协调，共同作用的结果。除了霉菌和酵母菌外，细菌尤其是乳酸菌是促进豆酱和酱油风味物质形成的重要微生物，对豆酱和酱油的风味与品质起重要作用。通过建立以下培养基【6】系统可完成酱醅中乳酸菌的分离鉴定工作：
1、MRS液体培养基(用于乳酸菌富集培养)：蛋白胨lOg，牛肉膏8g，酵母膏4g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二氨2g，吐温-80 lmL，K2HPO4 2g，MnSO4·4H20 0．04g，MgSO4·7H2O
0．2g，水1000mL，pH值自然，121％灭菌15min；
2、改良MRS培养基(用于乳酸菌分离纯化)：向MRS培养基中加入2％琼脂，3％碳酸钙。灭菌后放入6O℃恒温水浴中备用，用前加入0．1％纳他霉素、抑制霉菌和酵母菌生长；
3、MRS琼脂培养基(用于乳酸菌保存计数)：向MRS培养基中加入2％琼脂。
（五）牛乳中乳酸菌的分离鉴定
牛奶中的乳糖经乳酸菌发酵，其中20%~30%被分解成葡萄糖和半乳糖。前者进一步转化为乳酸或其他有机酸，这些有机酸有益于身体健康；后者被人体吸收后，可参与幼儿脑苷脂和神经物质的合成，并有利于提高乳脂肪的利用率。牛奶中的蛋白质经发酵作用后，乳蛋白变成微细的凝乳粒，易于被人体消化吸收；脂肪经乳酸菌作用后，发生解离或酯键受到破坏，易于被机体吸收。发酵过程中，乳酸菌还会产生人体所必需的维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸和叶酸等营养物质。通过建立下列几种培养基
菌进行分离、鉴定：
1、分离培养基：乳酸菌培养基I（BCP平板）（%）：蛋白胨0.5，酵母膏0.25，溴甲酚紫0.004，pH值7.0；乳酸菌培养基II（%）：酵母膏1，葡萄糖1.5，CaCO31.5，琼脂1.8；乳酸菌培养基III（%）：脱脂奶粉12，葡萄糖3，琼脂1.8.；
2、产酸培养基（%）：葡萄糖1.0，蛋白胨0.2，酵母膏0.5，MgSO4·7H2O 0.1,NaCl 0.1,KH2PO4 0.1,pH值7.0；
3、鉴别培养基：糖发酵培养基，生化反应培养基。
二、乳酸菌的功能性质研究
（一）乳酸菌的产酸特性
乳酸菌的产酸特性是筛选发酵乳品用发酵剂的重要特性。优良的菌种特性、低温贮存、较低的最终发酵酸度是保证乳酸菌低后酸化的有效措施。一般而言，在乳中增殖速度较快的乳酸菌，其后酸化的趋势也强，是其菌体活力和乳糖代谢酶活力的体现【8】【7】可以对腐乳中的乳酸。乳酸菌利用可发酵性糖产生酸味柔和的乳酸，同时还产生丙酸、醋酸等有机酸，在赋予产品酸味的同时，与发酵过程中产生的酸、醇、酮等物质相互作用，形成新的呈味物质，改善制品风味。此外，乳酸发酵还能消除某些原料带来的异味和怪味，因而经乳酸发酵的食品都具有其独特的风味。
（二） 乳酸菌的生物拮抗作用
乳酸菌的生物拮抗作用是生物保持竞争力的技能，也就是生物之间的竞争性排斥、干扰、抑制等作用。乳酸菌的生物拮抗作用主要表现在两个方面：一方面是乳酸菌与致病菌之间的
拮抗作用；另一方面是乳酸菌之间的拮抗作用。其主要原因是由代谢产生的一些抑菌物质导致的，主要有乳酸、过氧化氢、细菌素等。利用乳酸菌的拮抗作用来开发各种益生菌制剂，抑制病原菌的生长，增强宿主细胞的抵抗力和免疫力，还可以作为生物防腐剂。具有拮抗作用的菌株混合使用制作发酵剂时，会产生相互抑制作用，破坏优良发酵剂应具备的高活性、球杆比例平衡等特征【9】。在人体内，免疫作用是宿主防御机制中的重要作用，而生物拮抗作用是微生物保持竞争力的一种技能，这两者的结合是微生态平衡的重要条件。
（三） 乳酸菌的抗氧化活性
乳酸菌的抗氧化活性已得到了体内及体外实验的证实，其抗氧化机理包括金属离子螯合能力、活性氧的清除、酶活性控制和乳酸菌的还原活性等【10】。乳酸菌对机体的免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应激反应等发生作用，在食品工业中乳酸菌具有提高食品的营养价值、改善风味和延长产品保质期等功能。
以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它们数量的多和少，直接影响到人的健康与否，直接影响到人的寿命长短，科学家长期研究的结果证明，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。
参考文献：
【1】 Mckay LL，Baldwin KA．Applications for biotechnology：present and future
improvements in lactic acid bacteria【Ｊ】．FCNS Microbiol Rev，1990，87：3—4．
【2】 张秀凤，王军，李云芳.乳酸菌维持人体肠道微生态平衡的作用及其机理【Ｊ】.中
国食物与营养，2007（6）：59-61.
【3】 吕红线，王晓红.腌菜盐水中乳酸菌的分离与鉴定【Ｊ】.江苏食品与发
酵,2000(4):7-9.
【4】 葛钰瑛，李焕荣，傅力等．发酵肉制品中乳酸菌的分离鉴定及菌种性能的研究【Ｊ】．食
品研究与开发，2008,（12）：23-26．
【5】 王夫杰，鲁绯等.腐乳中乳酸菌的分离与鉴定【Ｊ】.中国调味品，2010（7）：98-101.
【6】 王夫杰，鲁绯等.酱醅中乳酸菌的分离与鉴定【Ｊ】.中国酿造，2010（5）：49-52.
【7】 张国锦，张宝芹，薛林贵.牛乳中乳酸菌的分离鉴定【Ｊ】.中兽医医药杂志，2009
（6）：44-45.
【8】 刘振民，王荫榆. 乳酸菌产酸特性研究【Ｊ】. 乳业科学与技术，2010（4）：169-172.
【9】 王玉文，刘英华．乳酸菌的生物拮抗作用【Ｊ】．中国乳品工业，2008（2）：55-57.
【10】 LINMY，YEN CL．Antioxidative Ability of Lactic Acid Bacteria【J】．Agric Food
Chem ，1999，47：1460—1466．
乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究
摘要:乳酸菌是一类具有多种生理功能的细菌，本文通过阐述乳酸菌不同来源的分离鉴定方式，探讨了乳酸菌的部分主要生理功能。
关键词:乳酸菌 分离鉴定 功能
Abstract: Lactic acid bacteria are a kind of many physiological functions of bacteria, this paper explains the separated and identified from different sources of lactic acid bacteria, and probes into the way of its part main physiological function.
Keywords: lactic acid bacteria separated and identified function
乳酸菌是一类广泛分布于自然界、与人类生活密切相关、可发酵碳水化合物、产生乳酸的细菌，然而，乳酸菌的许多特性是由其基因编码决定的【1】，利用这一特性，人们可以用乳酸菌作为载体，在食品及医药领域中构建表达系统。乳酸菌具有控制肠道感染，改善乳糖代谢，增加某些食物的营养价值，诱导体内特异性及非特异性免疫等作用。
乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状或球状，生殖方式为裂殖，消耗葡萄糖50％以上，产生乳酸分解蛋白质，但不产生腐败产物，不形成内生孢子，无运动性或极少运动，目前己发现的乳酸菌在细菌分类学上有18个属
功能。
一、乳酸菌的分离鉴定
乳酸菌的来源广泛，腌菜、发酵肉制品、腐乳、酱醅、牛乳等食物中乳酸菌的含量极其丰富。
（一） 腌菜盐水中乳酸菌的分离与鉴定
乳酸菌广泛存在于泡菜和腌菜等食品中，此类乳酸菌较耐盐，因此，以腌菜为样品，分离优良乳酸菌株，将其应用到含盐量较大的食品中，可以改善食品的风味，提高食品的质量。通过建立下列几种培养基【3】【2】。通过对乳酸菌分离鉴定，可测定其生理可以对腌菜盐水中的乳酸菌进行分离、鉴定：
1、种子培养基：酵母膏7．5g，蛋白胨7．5g，葡萄糖10g，西红柿汁100 ml，吐温80 0.5ml，蒸馏水900ml，KH2PO4 2g，调pH7．0(若配制固体培养基，琼脂添加量为2％)；
2、乳酸纸层析试验培养基：蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，吐温80 0．5ml，葡萄糖l0g，蒸馏水1000ml，1．6％溴甲酚紫1．4ml，调pH6．8—7；
3、鉴别培养基：蛋白胨水培养基，碳水化合物发酵培养基，硝酸盐培养基等生理生化
培养基。
（二）发酵肉制品中乳酸菌的分离鉴定
发酵肉制品是乳酸菌发酵鲜肉而制成的风味特殊肉制品。参与发酵的乳酸菌可以利用原料中的碳水化合物，分泌乳酸菌素，产生有机酸、酒精和二氧化碳等，抑制腐败菌和致病菌的生长，对病原菌和有害菌有抑制作用。同时，乳酸菌可增加食品的可消化性并产生一些维生素、抗氧化剂；能够分解部分氨基酸，产生独特的香味物质，赋予产品独特的风味和质地。另外，乳酸菌可促使亚硝酸盐向一氧化氮肌红蛋白转化，减少了产品中的亚硝酸盐残留量，同时形成良好色泽。通过建立以下培养基
的分离鉴定工作：
1、乳酸菌分离：MRS培养基；
2、乳酸菌鉴定：糖发酵培养基，甲基红(M.R)培养基，乙酰甲基甲醇(v—P)培养基，靛基质(吲哚)培养基，产H2S培养基，尿素酶培养基，触酶(H2O2)培养基，硝酸盐还原培养基，中性红油脂培养基，淀粉琼脂培养基，脱脂牛乳琼脂培养基，石蕊牛乳培养基；
3、乳酸菌抑菌试验：LB琼脂培养基。
（三）腐乳中乳酸菌的分离鉴定
腐乳中含有高水平的适度耐盐菌，其主导耐盐微生物是耐盐乳酸菌，它在腐乳的腌制和后酵过程中起着非常重要的作用，一定数量的乳酸菌在后酵过程中对腐乳风味物质的形成具有积极意义。通过建立下列几种培养基【5】【4】系统可完成发酵肉制品中乳酸菌可以对腐乳中的乳酸菌进行分离、鉴定：
1、MRS液体培养基(用于乳酸菌富集培养)：蛋白胨10g，牛肉膏8g，酵母膏4g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二氨2g，吐温8O 1 mL，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0．04g，MgSO4·7H2O 0．2g，水1000 mL。pH 自然，121℃灭菌15 min；
2、改良MRS培养基(用于乳酸菌分离纯化)：向MRS培养基中加入2%的琼脂，3%碳酸钙。灭菌后放入6O℃恒温水浴中备用，用前加入0．1%的纳他霉素，抑制霉菌和酵母菌生长；
3、MRS琼脂培养基(用于乳酸菌保存计数)：向MRS培养基中加入2%的琼脂。
(四)酱醅中乳酸菌的分离鉴定
豆酱和酱油独特风味的形成是多种微生物相互协调，共同作用的结果。除了霉菌和酵母菌外，细菌尤其是乳酸菌是促进豆酱和酱油风味物质形成的重要微生物，对豆酱和酱油的风味与品质起重要作用。通过建立以下培养基【6】系统可完成酱醅中乳酸菌的分离鉴定工作：
1、MRS液体培养基(用于乳酸菌富集培养)：蛋白胨lOg，牛肉膏8g，酵母膏4g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二氨2g，吐温-80 lmL，K2HPO4 2g，MnSO4·4H20 0．04g，MgSO4·7H2O
0．2g，水1000mL，pH值自然，121％灭菌15min；
2、改良MRS培养基(用于乳酸菌分离纯化)：向MRS培养基中加入2％琼脂，3％碳酸钙。灭菌后放入6O℃恒温水浴中备用，用前加入0．1％纳他霉素、抑制霉菌和酵母菌生长；
3、MRS琼脂培养基(用于乳酸菌保存计数)：向MRS培养基中加入2％琼脂。
（五）牛乳中乳酸菌的分离鉴定
牛奶中的乳糖经乳酸菌发酵，其中20%~30%被分解成葡萄糖和半乳糖。前者进一步转化为乳酸或其他有机酸，这些有机酸有益于身体健康；后者被人体吸收后，可参与幼儿脑苷脂和神经物质的合成，并有利于提高乳脂肪的利用率。牛奶中的蛋白质经发酵作用后，乳蛋白变成微细的凝乳粒，易于被人体消化吸收；脂肪经乳酸菌作用后，发生解离或酯键受到破坏，易于被机体吸收。发酵过程中，乳酸菌还会产生人体所必需的维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸和叶酸等营养物质。通过建立下列几种培养基
菌进行分离、鉴定：
1、分离培养基：乳酸菌培养基I（BCP平板）（%）：蛋白胨0.5，酵母膏0.25，溴甲酚紫0.004，pH值7.0；乳酸菌培养基II（%）：酵母膏1，葡萄糖1.5，CaCO31.5，琼脂1.8；乳酸菌培养基III（%）：脱脂奶粉12，葡萄糖3，琼脂1.8.；
2、产酸培养基（%）：葡萄糖1.0，蛋白胨0.2，酵母膏0.5，MgSO4·7H2O 0.1,NaCl 0.1,KH2PO4 0.1,pH值7.0；
3、鉴别培养基：糖发酵培养基，生化反应培养基。
二、乳酸菌的功能性质研究
（一）乳酸菌的产酸特性
乳酸菌的产酸特性是筛选发酵乳品用发酵剂的重要特性。优良的菌种特性、低温贮存、较低的最终发酵酸度是保证乳酸菌低后酸化的有效措施。一般而言，在乳中增殖速度较快的乳酸菌，其后酸化的趋势也强，是其菌体活力和乳糖代谢酶活力的体现【8】【7】可以对腐乳中的乳酸。乳酸菌利用可发酵性糖产生酸味柔和的乳酸，同时还产生丙酸、醋酸等有机酸，在赋予产品酸味的同时，与发酵过程中产生的酸、醇、酮等物质相互作用，形成新的呈味物质，改善制品风味。此外，乳酸发酵还能消除某些原料带来的异味和怪味，因而经乳酸发酵的食品都具有其独特的风味。
（二） 乳酸菌的生物拮抗作用
乳酸菌的生物拮抗作用是生物保持竞争力的技能，也就是生物之间的竞争性排斥、干扰、抑制等作用。乳酸菌的生物拮抗作用主要表现在两个方面：一方面是乳酸菌与致病菌之间的
拮抗作用；另一方面是乳酸菌之间的拮抗作用。其主要原因是由代谢产生的一些抑菌物质导致的，主要有乳酸、过氧化氢、细菌素等。利用乳酸菌的拮抗作用来开发各种益生菌制剂，抑制病原菌的生长，增强宿主细胞的抵抗力和免疫力，还可以作为生物防腐剂。具有拮抗作用的菌株混合使用制作发酵剂时，会产生相互抑制作用，破坏优良发酵剂应具备的高活性、球杆比例平衡等特征【9】。在人体内，免疫作用是宿主防御机制中的重要作用，而生物拮抗作用是微生物保持竞争力的一种技能，这两者的结合是微生态平衡的重要条件。
（三） 乳酸菌的抗氧化活性
乳酸菌的抗氧化活性已得到了体内及体外实验的证实，其抗氧化机理包括金属离子螯合能力、活性氧的清除、酶活性控制和乳酸菌的还原活性等【10】。乳酸菌对机体的免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应激反应等发生作用，在食品工业中乳酸菌具有提高食品的营养价值、改善风味和延长产品保质期等功能。
以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它们数量的多和少，直接影响到人的健康与否，直接影响到人的寿命长短，科学家长期研究的结果证明，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。
参考文献：
【1】 Mckay LL，Baldwin KA．Applications for biotechnology：present and future
improvements in lactic acid bacteria【Ｊ】．FCNS Microbiol Rev，1990，87：3—4．
【2】 张秀凤，王军，李云芳.乳酸菌维持人体肠道微生态平衡的作用及其机理【Ｊ】.中
国食物与营养，2007（6）：59-61.
【3】 吕红线，王晓红.腌菜盐水中乳酸菌的分离与鉴定【Ｊ】.江苏食品与发
酵,2000(4):7-9.
【4】 葛钰瑛，李焕荣，傅力等．发酵肉制品中乳酸菌的分离鉴定及菌种性能的研究【Ｊ】．食
品研究与开发，2008,（12）：23-26．
【5】 王夫杰，鲁绯等.腐乳中乳酸菌的分离与鉴定【Ｊ】.中国调味品，2010（7）：98-101.
【6】 王夫杰，鲁绯等.酱醅中乳酸菌的分离与鉴定【Ｊ】.中国酿造，2010（5）：49-52.
【7】 张国锦，张宝芹，薛林贵.牛乳中乳酸菌的分离鉴定【Ｊ】.中兽医医药杂志，2009
（6）：44-45.
【8】 刘振民，王荫榆. 乳酸菌产酸特性研究【Ｊ】. 乳业科学与技术，2010（4）：169-172.
【9】 王玉文，刘英华．乳酸菌的生物拮抗作用【Ｊ】．中国乳品工业，2008（2）：55-57.
【10】 LINMY，YEN CL．Antioxidative Ability of Lactic Acid Bacteria【J】．Agric Food
Chem ，1999，47：1460—1466．