（2014届）
毕业论文（设计）
题 目： 芳香烃有机物生物降解研究
学 院： 生物与化学院
专 业： 化学工程与工艺
班 级： 化工102
学 号： [1**********]3
姓 名： 王娅茹
指导教师： 缪程平
教 务 处 制
2014年 05月20 日
诚信声明
我声明，所呈交的论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究结果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。
论文（设计）作者签名： 签名日期: 年 月 日
授权声明
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论文（设计）作者签名： 签名日期: 年 月
摘要：本论文通过培养筛选出对芳香有机物4-甲砜基甲苯和邻硝基对甲砜基苯甲酸有降解功能的活性菌株，并将其应用于4-甲砜基甲苯和邻硝基对甲砜基苯甲酸的降解研究。 考察了在不同温度、pH 、碳源、氮源和微量元素等影响对降解工艺的影响，并进行了优化。试验结果表明：4-甲砜基甲苯降解菌在35℃、pH= 8、10%废水量（v/v）时降解率最大，达74.6%；邻硝基对甲砜基苯甲酸降解菌在温度30℃、PH= 6、1%葡萄糖、0.5%硝酸铵、0.1%硫酸锌时，降解率最大，为31.44%。
关键词: 4-甲砜基甲苯；邻硝基对甲砜基苯甲酸；生物降解
Abstract : In this paper, the strains were obtained through the cultivation of screening with degradation of aromatic organic compounds 4- methylsulfone toluene and ortho-nitro-4-methylsulfone benzoic acid, and its application to the study on degradation of 4- methylsulfone toluene and ortho nitro 4-methylsulfone benzoic acid. The effect of degradation process with different temperature, pH, carbon source, nitrogen source and trace elements were studied and optimized. The results shows that ：the maximum of degradation rate of 4- methylsulfone toluene, up to 74.6% with degrading bacteria in 35℃, pH= 8, 10% (v/v) of water waste, and ortho-nitro-4-methysulfonyl benzoic acid degrading bacteria at a temperature of 30℃, pH= 6, 1% glucose, 0.5% ammonium nitrate, 0.1% zinc sulfate, the maximum degradation rate up to 31.44%.
Keywords : 4- methylsulfone toluene; ortho-nitro-4-methysulfonyl benzoic acid; Biodegradable
目 录
1 绪论 . ...................................................................................................................................................... 1
1.1 芳香烃生物降解的研究背景 . ..................................................................................................... 1
1.2 芳香烃生物降解研究的意义和国内外研究状况 ...................................................................... 1
1.3 芳香族化合物降解菌的来源及菌种 .......................................................................................... 2
1.4 芳香族化合物的生物降解过程 . ................................................................................................. 2
1.5生物降解性的测定方法 . .............................................................................................................. 3
1.6影响生物降解的因素[13] .............................................................................................................. 4
1.6.1化合物的链结构 . ............................................................................................................... 4
1.6.2 分子量及其分布 . .............................................................................................................. 4
1.6.3降解试验条件 . ................................................................................................................... 4
1.7 本文研究内容 . ............................................................................................................................. 4
2 实验部分 . .............................................................................................................................................. 5
2.1 实验材料与仪器 . ......................................................................................................................... 5
2.2 实验内容 . ................................................................................................................................... 5
2.2.1 降解菌株的培养筛选 . .................................................................................................... 5
2.2.2 芳香烃有机物的降解处理 . ............................................................................................ 6
2.3 实验测量及优化方法 . ................................................................................................................. 6
2.3.1 分析方法 . .......................................................................................................................... 6
2.3.2 流动相的配置 . .................................................................................................................. 6
2.3.3 标准曲线的制作 . ............................................................................................................ 7
3 结果与分析 . .......................................................................................................................................... 8
3.1标准曲线的获得 . .......................................................................................................................... 8
3.2 筛选出的菌株 . ........................................................................................................................... 9
3.3 4-甲砜基甲苯降解实验结果..................................................................................................... 9
3.3.1温度、pH 值对4-甲砜基甲苯降解的影响 . ..................................................................... 9
3.3.2 碳源对4-甲砜基甲苯降解的影响 . ................................................................................ 10
3.3.3 氮源对4-甲砜基甲苯降解的影响 . ................................................................................ 10
3.3.4 微量元素对4-甲砜基甲苯降解的影响 . ........................................................................ 10
3.3.5 4-甲砜基甲苯降解菌的应用 . .......................................................................................... 11
3.4 邻硝基对甲砜基苯甲酸降解实验结果 .................................................................................... 11
3.4.1温度对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 .................................................................. 11
3.4.2 pH值对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 ................................................................ 12
3.4.3碳源对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 .................................................................. 12
3.4.4氮源对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 .................................................................. 13
3.4.5微量元素对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 .......................................................... 13
3.4.6 最优条件下的降解率 . .................................................................................................... 14
4 结论 . .................................................................................................................................................... 15
致 谢 . ...................................................................................................................................................... 16
参考文献 . .................................................................................................................................................. 17
1 绪论
1.1 芳香烃生物降解的研究背景
近年来，伴随我国工农业的高速发展，污水排放和环境污染物的排放量逐年增加，它们广泛来源于造纸、化工、纺织、电力等行业生产排放，基本比例如下：
图1-1 各个行业的废水排放比重
废水的排放导致生态环境日趋恶化，而芳香烃类化合物作为一类重要的化工原料与中间体，普遍应用于食物、煤油、染料、有机合成等行业，如多氯萘（PCN ）就常作为混合物生产用于商业应用[1]。这些芳烃类化合物在环境中的化学稳定性较高，水溶性低，许多都是致癌致突变因子[2]，对人体健康和周围环境造成严重危害。所以要采取一些行之有效，经济便利的策略缓解芳香烃这类化合物对环境的污染。
1.2 芳香烃生物降解研究的意义和国内外研究状况
利用微生物净化各种有机废水具有投资少、占地小又不需特殊设备等优点，通过该方法筛选出高效降解菌株，有效的降解环境中芳香族化合物，是而今环境治理的一个重要手段，该项技术目前正处于突飞猛进阶段，以美国、西欧、日本在这方面钻研尤其活跃。生物降解发展迅速，但其研究的时间却并不短，大致可分为三个阶段：
第一阶段从二十世纪初到1940年前后，该时期主要特征为生物降解对生活污水的处理研究和应用，随着它的发展，逐步解释了有机物在生物处理过程中的降解基质，以西欧的德、英、法为主。
第二阶段从1940年开始持续到1960年，以美国为研究主流，主要原因是这段时间他们工业处在极速发展阶段，为应对工业发展所必然导致的废水污水排放增多，从而使生物降解技术得到推广，也是这一时期，工业废水中的有机物的生物降解有了较多的研究。
第三阶段是六十年代以后，工业三废的危害日益严重，生物降解技术的应用也因此越来越广泛。其中的突出表现为日本工业的迅猛发展，促使它在微生物降解方面别具一格，主要特点是开始应用工业微生物学方面成就，即培养纯种菌种分解工业废水中有机物。
总的来说，生物降解适用前景广阔，并拥有一定的发展历史，目前还处在高速发展阶段，是一种处理环境污染物切实可效的方法。近年来，利用生物降解处理芳香挺化合物已引发了许多科学家的致力探索，他们不单热衷于探索物质降解路径的多种性，而且也探究微生物引发生物降解的生化和遣传机理，为生态中芳香烃的优化降解提供了新的可能和路径[3]。
另外，对于芳烃类物质降解的研究，基本可分单环，联苯和多氯联苯，多环芳香烃的降解处理研究。其中微生物转化甲苯的路线是探究芳香类降解的典型范例。至今已有5种不同微生物进行甲苯好氧分借途径的报道，而厌氧分解只是最近才发现。联苯的降解具有一个比较清晰的生物降解路径，并且已分离和鉴定了一些符合这种路径的中间产物[4]。在多环芳香烃降解这方面，已经证明微生物及其共生生物有能力分解多环芳烃，并且分离了具有能分解蔡、菲、葱、药、荧的微生物纯种。早在30年前，就已说明了少些最简单多环芳烃如蔡、菲和葱等的微生物降解途径
[5]。对一些较复杂的多环芳烃的微生物分解途径，只到近几年才能确定。
1.3 芳香族化合物降解菌的来源及菌种
芳香族类降解菌的来源有多条途径，常见的有：①直接从污染环境中分离筛选出降解菌。②利用废水处理厂的活性污泥、沉降池底或厌氧消化池的污泥当作菌种。③纯化、驯化、筛选专性菌株。④利用基因工程技术构建菌株。
常见的芳香化合物降解菌，酵母菌，真菌是常见的白腐菌，假单胞菌，棒状杆菌属，芽孢杆菌，微球菌属，诺卡氏菌，球菌，产甲烷菌属，蓝藻等，，它们目前主要应用于造纸废水，印染废水，生活污水，残留石油、农药等领域，对芳香族污染物的降解起着相当重要的作用。
1.4 芳香族化合物的生物降解过程
苯环类芳烃降解大抵分5个阶段：①降解物质进到细胞内、②形成苯环裂解前体、③ 苯环结构裂解、④两性中间体产物形成、⑤产物被利用。芳香烃结构不同，在不同的条件下，能够由不同的微生物降解。从反应所需的条件上观察，芳烃类物质降解类别可分为好氧型与厌氧型降解；而从化学结构上看，分为单环结构的芳香烃与多环结构的芳香烃降解。
好氧型菌降解苯环化合物的路径的相同点是：先在酶和氧分子的配合作用下，苯环结构形成邻苯二酚或者其衍生物的共同代谢中间体，接着再历经开环酶和氧分子的协同作用，形成直链分子，末尾分解进入三羧酸循环。目前已发现，数量众多的杂环类芳香烃聚合物、氯代多环芳香烃
以及含氮类芳香族化合物，如硝基的芳香烃等均可通过好氧型途径进行降解。
图1-2 芳香烃化合物降解途径
如图1-2（a ）所示，苯在生物降解时通常存在两个分支路径，起初苯环是被苯双加氧酶进攻转化为邻苯二酚，之后再进一步通过邻位或间位双加氧酶的作用，产生粘康酸或粘康酸半醛。
如果苯环上存在取代基，那么它的降解会出现两种可能：先进攻苯环或先进攻侧链。实际上，如果侧脸很长，那么它的氧化就足够提供微生物生长所需的能量，导致它们不会去降解苯环。这些化合物被称作取代烷烃而不是取代芳香化合物。含2~7个碳原子的单烃基取代物的一般途径如图1-2（b ）。当碳原子数大于七时，会经由w 、β氧化先进攻取代烃侧链，之后再降解苯环。
联苯的降解路径如图1-2（c ）所示，两种方式添加联苯降解氧，分别为1，2位上加氧和3，4位上加氧，相比之下，前者占多数。联苯的降解是由两步双加氧酶作用，转化为2-羟基-6-酮基-6-苯基-2，3-己二烯酸，最后被降解成苯甲酸。
多环芳烃是一类含有两个或两个以上融合芳香环的化合物，由有机物不完全燃烧所产生[8]。萘的生物降解途径如图1-2（d ）所示。与其它芳香族化合物的降解类似，第一步中双加氧酶攻击环转化为1，2-羟基萘，然后在第一和第九个碳原子之间断裂。
1.5生物降解性的测定方法
生物降解性通常分为好氧生物降解性测定方法、厌氧条件下的生物降解性能测定方法、模拟实验法[6]。好氧生物降解性测定方法又可分为呼吸方法[7]、测定基质去除的方法、测定有机物分解产生的CO2量[8] 、分析细菌增殖情况的方法。
测定基质去除法是指直接检测微生物去除有机物的功效，它最能直观地展现出有机物的降解
情况，根据不同的指标，测定基质去除法可分特异性分析方法和综合指标法这两种，其中，综合指标法又分四种，分别为静置烧瓶筛选试验[9] 、半连续活性污泥法[10]、ATP 法[11]、（4）综合测试评价法 [12] 。
1.6影响生物降解的因素[13]
1.6.1化合物的链结构
生物降解速率与化合物的链结构息息相关，如果主链的柔顺性大，那么降解速率快，随着硬段引入主链，生物降解速率减小。另外，支链上基团的亲水疏水性和化学式的立体结构中的空间位阻同样对其具有影响。
1.6.2 分子量及其分布
通常情况下，生物降解的顺序由端基最先开始，分子量高的聚合物，因为它端基数量不多，所以它的降解速率较小，对于一些分布宽的聚合物，通常是低分子量部分先被降解。
1.6.3降解试验条件
环境条件如温度，pH 值，溶解氧，湿度，光，土壤，盐，或其他微生物生存所需要营养条件，如真菌在酸性环境中生长，细菌生长在微碱性条件。细菌与真菌的类型、数量及相互作用的方式，试验的时间与微生物（或酶）触碰的形式、样品的浓度等方面都会对化合物的降解产生诸多影响。
1.7 本文研究内容
本文针对4-甲砜基甲苯和邻硝基对甲砜基苯甲酸筛选对其有效降解的活性菌株，采取控制环境因素中的温度、pH 值、碳源、氮源、微量元素等来考察微生物在不同条件下的降解性能，运用液相色谱得出各个条件下底物剩余浓度，再根据已知初始浓度计算得到生物降解率，分析降解率的大小从而获得到最适温度、pH 值，以及最适微生物生存的营养条件，使工艺得到优化。
2 实验部分
2.1 实验材料与仪器
主要实验材料如表2-1所列。
表 2-1 主要实验材料
药品名称 制造商或产地
4-甲砜基甲苯 浙江嘉化能源化工股份有限公司
邻硝基对甲砜基甲苯 浙江嘉化能源化工股份有限公司
邻硝基对甲砜基苯甲酸 浙江嘉化能源化工股份有限公司
乙腈 国药集团化学试剂有限公司
磷酸 华东医药股份有限公司
主要实验材料如表2-2所列。
表 2-2 主要仪器和设备
电子天平AL204
冰箱JinsongBCD-kk204
全温空气摇床QYZ-211
生物显微镜YS100
液相色谱仪1200
超声波清洗机SK3300H
生化培养箱SHP-150
立式压力蒸汽灭菌锅YSQ-LS-75 梅特勒-托利多仪器有限公司 杭州金松优诺电器有限公司 上海福玛实验设备有限公司 上海长方光学仪器有限公司 上海精宏实验设备有限公司 上海科导超声仪器有限公司 上海博迅实业有限公司 上海福玛实验设备有限公司
2.2 实验内容
2.2.1 降解菌株的培养筛选
从化工厂中分别获得含有几种特定芳香烃有机物的未处理废水，从中筛选出能降解该芳香烃的活性菌株。具体方法如下：将具有特定芳香烃的工业废水经适当稀释，在牛肉膏蛋白胨固体培养基或土豆固体培养基（含有0.5‰的某种特定芳香烃）平板涂布，放置在35℃或28℃培养箱中培养72h 。将有生长的菌种分别标记，并在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线纯化。
图2-2 降解筛选过程流程图
纯化好的菌种，分别接于50mL 无糖无机盐培养基（含有1‰的同种特定芳香烃）中，放置在35℃或28℃恒温摇床中，130r/min，初筛培养48h/72h。初筛了的菌种再次转接到50mL 无糖无机盐培养基（含有2‰的同种芳香烃）中，放置在35℃或28℃恒温摇床中，130r/min，驯化培养48h/72h，得到芳香烃有机物的耐受菌。分别考察所得菌种对该类芳香烃的降解性能，从而获得该芳香烃的降解菌。
2.2.2 芳香烃有机物的降解处理
芳香烃有机物的降解处理以4-甲砜基甲苯为例：在灭菌无机盐培养基中加入4-甲砜基甲苯储备液，配成50mL 培养基体系，分别调节体系初始pH 值、环境温度、微量元素、碳源、氮源，于130 r/min条件下培养，在48 h后取样测定甲砜甲苯残余量，考察以上因素对降解菌降解4-甲砜基甲苯的影响。邻硝基对甲砜基苯甲酸的降解处理方法类似。
2.3 实验测量及优化方法
2.3.1 分析方法
论文采取的生物降解性检测方法是测定基质去除的方法，它是用特殊仪器或方法测定反应前、后受试验物浓度的变化，用于分析受试物的降解性，例如，甲砜甲苯降解率(%)=甲砜甲苯残余量/初始甲砜甲苯量*100%。本论文使用的特殊仪器是液相色谱仪，运用时首先需要制定出用于检测的标准曲线，得到一条峰面积对应样品浓度的标准曲线方程。在检测样品中组分含量时，只要在与标准曲线相同的色谱条件下测得峰面积，就可以运用标准曲线方程直接计算出注入色谱柱中的样品组分浓度。
2.3.2 流动相的配置
液相色谱中使用的流动相主要由超纯水，乙腈、磷酸等几种溶剂配制而成。通常所说的去离子水，实际上它并不是完全的纯物质，它还含有一些有机物，因此不适合高效液相色谱分析使用，而所谓的超纯水是指普通去离子水经由超纯水仪去除有机物后的二次蒸馏水。
配置时用250ml 的量筒量取250ml 超纯水，倒入500ml 的试剂瓶中，再量取220ml 的乙腈，倒入相同试剂瓶中，最后用移液管向试剂瓶中加入0.15ml 磷酸。轻轻摇匀，将试剂瓶放入超声波清洗机进行脱气，脱气完全后流动相即可使用。
2.3.3 标准曲线的制作
论文主要以4-甲砜基甲苯、邻硝基-4-甲砜基甲苯等芳香化合物为检测对象，已知检测时它们的大约浓度范围在千分之二左右，围绕这一范围称取标准样品，加蒸馏水制成不同浓度梯度的标准溶液，再与待测组分在相同的色谱条件，既波长254nm 、流速0.5ml/min下，相同体积精确进样，测量各峰的峰面积，用峰面积对样品浓度的关系，绘制标准曲线。实验测量时，待测物在相同色谱下，测到其峰面积，就可以直接利用标准曲线方程求得浓度。
具体步骤如下：得4-甲砜基甲苯标准样品，用电子天平精确称取0.4g 、0.8g 、 1.0g 、1.6g 、
3.2g 甲砜甲苯标准样品，分别放入五个50ml 容量瓶中，加蒸馏水置刻度线、定容，等到固体药品全部溶解后，启动液相色谱，调节波长和流速，使其控制在254nm ，0.5ml/min的测量条件下，待基线稳定后，用进样针以每针25微升的进样量进样，出峰后，得到峰面积，根据峰面积对样品的浓度的关系绘制出标准曲线图。以此类推，邻硝基对甲砜基苯甲酸也是用这种方法得到相应的标准曲线。
3 结果与分析
3.1标准曲线的获得
按照2.3.3介绍的标准曲线制作方法，用峰面积对样品浓度的关系绘制标准曲线，具体见图3-1和图3-2。
S 1-methyl-4-(methylsulfonyl)-Benzene(g/ml)
图3-1 4-甲砜基甲苯标准曲线
Y p e a k a r e a (m v . s e c ) X BA concentration(g/ml)
X BA concentration(g/ml)
图3-2 邻硝基对甲砜基苯甲酸标准曲线
经测得的两条标准曲线方程分别为4-甲砜基甲苯：Y=321.86+5750000X,R=0.999；邻硝基对甲砜基苯甲酸:Y=46469800*X-26.25343,R=0.99984。
3.2 筛选出的菌株
筛选得到的降解菌经纯化培养，进行微生物形态学观察。如图3-3和3-4所示。
图3-3 4-甲砜基甲苯降解菌株 图3-4 邻硝基对甲砜基苯甲酸镜检结果
4-甲砜基甲苯的降解菌经革兰氏染色镜检发现为球状革兰氏阴性菌。邻硝基对甲砜基苯甲酸的镜检结果发现该类菌落生长迅速，呈致密丛束状或不定型棉絮状，表面呈绿色。
3.3 4-甲砜基甲苯降解实验结果
3.3.1温度、pH 值对4-甲砜基甲苯降解的影响
以温度为例，50mL 培养基体系调节体系初始pH 值为7，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下，130r/min条件下培养48h ，测定4-甲砜基甲苯残余量，得到4-甲砜基甲苯的降解率。pH 的实验设计与之类似，即控制温度不变，设置一系列不同pH 值的培养基，其他培养条件不变，一段时间后，考察pH 值对4-甲砜基甲苯降解的影响。实验结果如表3-1、3-2所示。
表3-1温度对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌株 温度℃ 降解率（%）
20 20
25 30
降解菌株A 30 30
35 35
40 25
表3-2体系初始pH 对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌种 PH （℃） 降解率（%）
4 5
5 5
降解菌株A 6 15
7 15
8 20
9 10
实验结果表明，菌种降解4-甲砜基甲苯的最适温度为35℃，这可能是由于菌种为细菌，在35℃条件下，最适于菌种生长，对4-甲砜基甲苯的降解率最大，而该种菌的最适pH 值为8。
3.3.2 碳源对4-甲砜基甲苯降解的影响
50 mL4-甲砜基甲苯水溶液中（2‰）分别加入0.05 g 葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，再设置一组无碳源空白对照组，均接入菌种。调节pH 值为8，在35℃下，130 r/min条件下培养48 h，测定4-甲砜基甲苯残余量，得到甲砜甲苯的降解率。
表3-3 体系碳源对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌种 碳源 降解率（%）
葡萄糖 71
降解菌株A 果糖 66
麦芽糖 65
蔗糖 63
空白对照 56
由表3-3可知，在培养基中适当加入葡萄糖最有助于4-甲砜基甲苯的降解。理论上细菌有机碳源有多种，而以葡萄糖作为最理想化的碳源。
3.3.3 氮源对4-甲砜基甲苯降解的影响
50 mL 甲砜甲苯水溶液中（2‰）分别加入0.05 g 过硫酸铵，氯化铵，硝酸铵，硫酸铵，再设置一组无氮源空白对照组，均接入菌种。调节pH 值为8，在35℃下，130 r/min条件下培养48h ，测定4-甲砜基甲苯残余量，得到4-甲砜基甲苯的降解率。
表3-4 体系氮源对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌种 无机氮源 降解率（%）
过硫酸铵 61
氯化铵 60
绿色木霉菌 硝酸铵 67
硫酸铵 61
空白对照 56
实验结果（见表3-4）表明，适当加入氮源能加强菌种对4-甲砜基甲苯的降解效果。其中硝酸铵对降解效果的影响最为明显。
3.3.4 微量元素对4-甲砜基甲苯降解的影响
50mL 培养基体系分别加入1*10-5mol/L的微量元素Fe 2(SO4) 3 · XH 2O 、MnSO 4· H 2O 、CuSO 4· 5H2O 、ZnSO 4· 7H2O 、MgSO 4· 7H2O ，再设置一组无微量元素的空白对照组，均接入菌种。调节pH 值为8，在35℃下，130r/min条件下培养48h ，测定4-甲砜基甲苯残余量，得到4-甲砜基甲苯的降解率，实验结果如表3-5所示。
表3-5 体系微量元素对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌种 微量元素 降解率(%)
Fe 2(SO4) 3 · XH2O 70.9
MnSO 4· H2O 72.9
降解菌株A CuSO 4· 5H2O 59.4
ZnSO 4· 7H2O 58.41
MgSO 4· 7H2O 57.77
空白对照 56
结论：结果表明，这5种微量元素对降解菌降解4-甲砜基甲苯均有降解作用，尤以MnSO 4。
3.3.5 4-甲砜基甲苯降解菌的应用
将降解体系配成10%，20%，30%，40%，50%, 60%体积比的废水培养液，130r/min条件下培养48h 后，测定4-甲砜基甲苯残余量，考察其对降解菌降解甲砜甲苯的影响，实验结果如表3-6所示。
表3-6 不同废水体积比下甲砜甲苯的降解率
菌种 废水量 降解率(%)
10 74.6
20 71.9
降解菌株A 30 65.8
40 63.6
50 62.3
60 60.2
结论：实验结果表明，甲砜甲苯降解菌在10%废水量时降解作用最大，降解率达74.6%，条件最优。
3.4 邻硝基对甲砜基苯甲酸降解实验结果
3.4.1温度对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制4个液体培养基，调节体系pH 值在相同条件下，分别取10mL 样品标记保存，再接入降解菌，分别置于20℃，30℃，40℃，50℃下培养72 h。72小时后再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-7所示。
菌种 温度（℃） 降解率（%）
20 18.72
绿色木霉菌 30 24.33
40 11.09
50 4.5
由表可知，该种菌的最适温度为30℃。猜测这种菌可能为霉菌，因为霉菌培养的最适温度为28℃，故该菌在30℃生长状况最佳，使得BA 降解的量最多。当温度过高时，会抑制或杀死该菌，造成降解率明显降低。
3.4.2 pH值对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制5个液体培养基，分别通过加HCL 或NaOH 调节PH 为3、4、6、7、9，分别取10mL 样品标记保存。再接入降解菌，置于相同温度下培养72 h。72小时后再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-6所示。
表3-8不同pH 值下菌种的降解效果
菌种 pH 降解率（%）
3 3.99
4 14.66
绿色木霉菌 6 17.8
7 7.82
9 0.95
由表3-8可知，该种菌最适pH 在6左右。由于PH 值为6有助于霉菌的生长，故使得降解率最大。PH 过酸或过碱条件下，会抑制该菌株的生长，使得降解率大幅度降低甚至起不到降解效果。
3.4.3碳源对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制4个液体培养基，分别加入1%的葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖。调节PH 至6。各取10mL 样品标记保存。再接入降解菌，置于30℃下培养72 h。72小时后再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-7所示。
菌种 碳源 降解率（%）
葡萄糖 22.78
绿色木霉菌 果糖 16.12
麦芽糖 19.11
蔗糖 18.93
由表3-9可知，在培养基中适当加入葡萄糖有助于BA 的降解。理论上霉菌的有机碳源有多种，而以葡萄糖作为最理想化的碳源。
3.4.4氮源对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制4个液体培养基，分别加入0.5%的过硫酸铵，硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，甘氨酸，L-组氨酸，DL-丙氨酸，L-白氨酸。取10mL 样品标记保存。再接入降解菌，置于30℃下培养72 h。72小时后再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-8和表3-9所示。42.13
表3-10不同无机氮源下菌种的降解效果
菌种 无机氮源 降解率（%）
过硫酸铵 15.80
绿色木霉菌 硫酸铵 16.21
硝酸铵 24.95
氯化铵 23.29
表3-11不同有机氮源下菌种的解效果
菌种 有机氮源 降解率（%）
甘氨酸 16.98
绿色木霉菌 组氨酸 17.86
丙氨酸 26.45
白氨酸 24.83
由以上2个表可知，适当加入无机氮和有机氮能加强该种菌对BA 的降解效果。其中无机氮中硝酸铵和有机氮中丙氨酸对降解效果的影响最为明显。对于菌体，以还原氮形式存在的铵盐是最先被利用的，已知菌体可以直接利用铵盐，参与细胞内含氮化合物的形成，使得菌体生长迅速，提高了降解的效果。
3.4.5微量元素对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制4个液体培养基，分别加入0.1%的硫酸铁，硫酸锌，硫酸锰。取10mL 样品标记保存。再接入降解菌，置于30℃下培养72 h 。再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-10所示。
表3-12不同微量元素下菌种的降解效果
菌种 微量元素 降解率
Fe 3+ 15.19
绿色木霉菌 Zn 2+ 20.56
Mn 2+ 15.14
由表3-10可知，该种菌在培养基中加入Zn 2+，对菌株的降解效果起到一定的帮助。在微生物体能Zn 2+能激活多种酶活性，能帮助BA 的降解。
3.4.6 最优条件下的降解率
通过上述实验找出最优条件为，温度30℃，PH 6,加入1%葡萄糖，0.5%硝酸铵，0.1%硫酸锌。在最优条件下BA 的降解率为31.44%
4 结论
本文就以芳香烃的生物降解处理展开一系列研究，绪论部分着重介绍了芳香烃有机物的研究背景、意义和国内外研究状况，芳香烃化合物降解菌的来源、菌种以及它的生物降解过程，此外还介绍了生物降解的测定方法和影响生物降解的因素。实验部分的主要内容包含不同细菌或霉菌的筛选获得，选择4-甲砜基甲苯、邻硝基-4-甲砜基苯甲酸等芳香化合物，进行生物降解处理，利用液相色谱测定处理前后有机物的含量，并进行工艺优化。
利用液相色谱检测过程中需要配置一定比例的流动相，制定标准曲线，本文中所列举的两条标准曲线均在与待测物相同色谱条件下测定，既254nm 、0.5ml/min,进料量25微升下，曲线相关系数均达到0.999以上，说明这两条曲线都具有一定的测量准确性。
已经阐明生物降解受降解试验条件的影响，如环境中的温度、pH 值、碳源、氮源、微量元素、以及样品浓度等。本文就采取控制变量法研究各个环境条件对微生物降解的影响。研究结果表明：4-甲砜基甲苯降解菌在35℃、pH=8，10%废水量时降解率最大，达74.6%，邻硝基对甲砜基苯甲酸降解菌在温度30℃，PH 6，1%葡萄糖，0.5%硝酸铵，0.1%硫酸锌时，降解率最大, 为31.44%。生物降解对污水中芳香烃污染物的处理具有广泛的应用前景。
当然实验仍存在许多不足之处，譬如本次实验采取的测定方法是标准曲线法，它除了具有应用简单快捷，可直接读取测量数据等优点外，也存在难以控制每次待测物一定在相同的色谱条件下，导致结果存在较大的测量误差。就实验本身上，我们是特别列举了几种芳香烃有机物，以及它们降解菌的筛选获得，而实际上，自然界中还存在许多未发现的降解菌株和不了解许多已发现的降解菌的降解路径。因此，未来对于芳香烃的生物降解处理研究还需要我们更加深入的探索和发现。
致 谢
毕业论文暂告收尾，这也意味着我在嘉院的四年的学习生活既将结束。回首既往，这四年里，我在学习上和思想上都受益非浅。这些进步除了自身努力外，与各位老师、同学和朋友的关心、支持和鼓励是分不开的。
论文的写作和实验操作是枯燥艰辛而又富有挑战的。芳香烃污染物的生物降解一直环境治理方面的热门话题，本论文实验由此展开一系列的降解研究和工艺优化，在这过程中，我特别要感谢我的导师缪程平老师，因为从一开始的论文的选题、到文献的采集、框架的设计、结构的布局，以及最终的论文定稿，缪老师都对我提供了最大的支持和鼓励，并教导我过程出现问题的原因，以及最后完善论文结构。没有缪老师的辛勤栽培、孜孜教诲，就没有我论文的顺利完成。
此外，我还要感谢与本实验有关的几位生物班同学，与他们的交流使我受益颇多。最后要感谢我周围朋友们对我的鼓励和帮助，正是因为有了他们，我才有了更多追求进步的勇气和信心。时间的仓促及自身专业水平的不足，整篇论文肯定存在尚未发现的缺点和错误。恳请阅读此篇论文的老师、同学，多予指正，不胜感激！
参考文献
[1] Falandysz J (1998) Polychlorinated napthalenes:an environmental update. Environ Pollut101:77-90
[2]Blumer M, Youngblood WW, scence, 1975,(13):53,188
[3]Zylstra G.J.,Molecular Environmental Biology(Garte SJ eg,).CRC Pree.BocaRaton.Florida. 1994,(32):83-115
[4]Yates J.R.,Modello.FJ.Molecular Envirmmntal Biology(Gart SJ ed.) ，CRC Press,Boca Raton Flo -rida. 1994,(8):65-82
[5]何德文, 等. 白腐真菌处理难降解的有机废水研究[J] . 工业水处理, 2000,20(3):14-17
[6]王宏, 叶常明. 天然水中有机污染物的生物降解性模拟试验方法[J].环境化学,1994,12(3):161-171
[7]安虎仁, 钱易, 顾夏声. 关于有机物生物降解性能测定方法选择的几点探讨[J].环境科学与技术, 1994, (4):47-49
[8] 王昆, 方建华, 等. 润滑油生物降解性快速测定方法的研究[J].石油学报(石油加工),2004,20(6): 74-78
[9] Tabak H H. Biodeg radability studies with organic priority pollutant compounds. WPCF,1981 53(10): 1503-1518
[10]李遵峰, 张立勇, 等. 半连续活性污泥法测定表面活性剂的好氧生物降解度[J].日用化学工业，2007,37(2):85-87,96
[11]孙立新, 蒋展鹏, 师绍其.ATP 法测定有机物好氧生物降解性的研究. 环境科学,1996,17(1):1-4
[12]蒋展鹏, 杨宏伟, 等. 有机物好氧降解性的综合测试评价方法[J].环境科学,1999,20(6):10-13
[13] 王昆, 方建华, 等. 润滑油生物降解性快速测定方法的研究[J].石油学报(石油加工),2004,20(6): 74-78
（2014届）
毕业论文（设计）
题 目： 芳香烃有机物生物降解研究
学 院： 生物与化学院
专 业： 化学工程与工艺
班 级： 化工102
学 号： [1**********]3
姓 名： 王娅茹
指导教师： 缪程平
教 务 处 制
2014年 05月20 日
诚信声明
我声明，所呈交的论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究结果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。
论文（设计）作者签名： 签名日期: 年 月 日
授权声明
学院有权保留送交论文（设计）的原件，允许论文（设计）被查阅和借阅，学校可以公布论文（设计）的全部或部分内容，可以影印、缩印或其他复制手段保存论文（设计），学校必须严格按照授权对论文（设计）进行处理，不得超越授权对论文（设计）进行任意处理。
论文（设计）作者签名： 签名日期: 年 月
摘要：本论文通过培养筛选出对芳香有机物4-甲砜基甲苯和邻硝基对甲砜基苯甲酸有降解功能的活性菌株，并将其应用于4-甲砜基甲苯和邻硝基对甲砜基苯甲酸的降解研究。 考察了在不同温度、pH 、碳源、氮源和微量元素等影响对降解工艺的影响，并进行了优化。试验结果表明：4-甲砜基甲苯降解菌在35℃、pH= 8、10%废水量（v/v）时降解率最大，达74.6%；邻硝基对甲砜基苯甲酸降解菌在温度30℃、PH= 6、1%葡萄糖、0.5%硝酸铵、0.1%硫酸锌时，降解率最大，为31.44%。
关键词: 4-甲砜基甲苯；邻硝基对甲砜基苯甲酸；生物降解
Abstract : In this paper, the strains were obtained through the cultivation of screening with degradation of aromatic organic compounds 4- methylsulfone toluene and ortho-nitro-4-methylsulfone benzoic acid, and its application to the study on degradation of 4- methylsulfone toluene and ortho nitro 4-methylsulfone benzoic acid. The effect of degradation process with different temperature, pH, carbon source, nitrogen source and trace elements were studied and optimized. The results shows that ：the maximum of degradation rate of 4- methylsulfone toluene, up to 74.6% with degrading bacteria in 35℃, pH= 8, 10% (v/v) of water waste, and ortho-nitro-4-methysulfonyl benzoic acid degrading bacteria at a temperature of 30℃, pH= 6, 1% glucose, 0.5% ammonium nitrate, 0.1% zinc sulfate, the maximum degradation rate up to 31.44%.
Keywords : 4- methylsulfone toluene; ortho-nitro-4-methysulfonyl benzoic acid; Biodegradable
目 录
1 绪论 . ...................................................................................................................................................... 1
1.1 芳香烃生物降解的研究背景 . ..................................................................................................... 1
1.2 芳香烃生物降解研究的意义和国内外研究状况 ...................................................................... 1
1.3 芳香族化合物降解菌的来源及菌种 .......................................................................................... 2
1.4 芳香族化合物的生物降解过程 . ................................................................................................. 2
1.5生物降解性的测定方法 . .............................................................................................................. 3
1.6影响生物降解的因素[13] .............................................................................................................. 4
1.6.1化合物的链结构 . ............................................................................................................... 4
1.6.2 分子量及其分布 . .............................................................................................................. 4
1.6.3降解试验条件 . ................................................................................................................... 4
1.7 本文研究内容 . ............................................................................................................................. 4
2 实验部分 . .............................................................................................................................................. 5
2.1 实验材料与仪器 . ......................................................................................................................... 5
2.2 实验内容 . ................................................................................................................................... 5
2.2.1 降解菌株的培养筛选 . .................................................................................................... 5
2.2.2 芳香烃有机物的降解处理 . ............................................................................................ 6
2.3 实验测量及优化方法 . ................................................................................................................. 6
2.3.1 分析方法 . .......................................................................................................................... 6
2.3.2 流动相的配置 . .................................................................................................................. 6
2.3.3 标准曲线的制作 . ............................................................................................................ 7
3 结果与分析 . .......................................................................................................................................... 8
3.1标准曲线的获得 . .......................................................................................................................... 8
3.2 筛选出的菌株 . ........................................................................................................................... 9
3.3 4-甲砜基甲苯降解实验结果..................................................................................................... 9
3.3.1温度、pH 值对4-甲砜基甲苯降解的影响 . ..................................................................... 9
3.3.2 碳源对4-甲砜基甲苯降解的影响 . ................................................................................ 10
3.3.3 氮源对4-甲砜基甲苯降解的影响 . ................................................................................ 10
3.3.4 微量元素对4-甲砜基甲苯降解的影响 . ........................................................................ 10
3.3.5 4-甲砜基甲苯降解菌的应用 . .......................................................................................... 11
3.4 邻硝基对甲砜基苯甲酸降解实验结果 .................................................................................... 11
3.4.1温度对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 .................................................................. 11
3.4.2 pH值对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 ................................................................ 12
3.4.3碳源对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 .................................................................. 12
3.4.4氮源对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 .................................................................. 13
3.4.5微量元素对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响 .......................................................... 13
3.4.6 最优条件下的降解率 . .................................................................................................... 14
4 结论 . .................................................................................................................................................... 15
致 谢 . ...................................................................................................................................................... 16
参考文献 . .................................................................................................................................................. 17
1 绪论
1.1 芳香烃生物降解的研究背景
近年来，伴随我国工农业的高速发展，污水排放和环境污染物的排放量逐年增加，它们广泛来源于造纸、化工、纺织、电力等行业生产排放，基本比例如下：
图1-1 各个行业的废水排放比重
废水的排放导致生态环境日趋恶化，而芳香烃类化合物作为一类重要的化工原料与中间体，普遍应用于食物、煤油、染料、有机合成等行业，如多氯萘（PCN ）就常作为混合物生产用于商业应用[1]。这些芳烃类化合物在环境中的化学稳定性较高，水溶性低，许多都是致癌致突变因子[2]，对人体健康和周围环境造成严重危害。所以要采取一些行之有效，经济便利的策略缓解芳香烃这类化合物对环境的污染。
1.2 芳香烃生物降解研究的意义和国内外研究状况
利用微生物净化各种有机废水具有投资少、占地小又不需特殊设备等优点，通过该方法筛选出高效降解菌株，有效的降解环境中芳香族化合物，是而今环境治理的一个重要手段，该项技术目前正处于突飞猛进阶段，以美国、西欧、日本在这方面钻研尤其活跃。生物降解发展迅速，但其研究的时间却并不短，大致可分为三个阶段：
第一阶段从二十世纪初到1940年前后，该时期主要特征为生物降解对生活污水的处理研究和应用，随着它的发展，逐步解释了有机物在生物处理过程中的降解基质，以西欧的德、英、法为主。
第二阶段从1940年开始持续到1960年，以美国为研究主流，主要原因是这段时间他们工业处在极速发展阶段，为应对工业发展所必然导致的废水污水排放增多，从而使生物降解技术得到推广，也是这一时期，工业废水中的有机物的生物降解有了较多的研究。
第三阶段是六十年代以后，工业三废的危害日益严重，生物降解技术的应用也因此越来越广泛。其中的突出表现为日本工业的迅猛发展，促使它在微生物降解方面别具一格，主要特点是开始应用工业微生物学方面成就，即培养纯种菌种分解工业废水中有机物。
总的来说，生物降解适用前景广阔，并拥有一定的发展历史，目前还处在高速发展阶段，是一种处理环境污染物切实可效的方法。近年来，利用生物降解处理芳香挺化合物已引发了许多科学家的致力探索，他们不单热衷于探索物质降解路径的多种性，而且也探究微生物引发生物降解的生化和遣传机理，为生态中芳香烃的优化降解提供了新的可能和路径[3]。
另外，对于芳烃类物质降解的研究，基本可分单环，联苯和多氯联苯，多环芳香烃的降解处理研究。其中微生物转化甲苯的路线是探究芳香类降解的典型范例。至今已有5种不同微生物进行甲苯好氧分借途径的报道，而厌氧分解只是最近才发现。联苯的降解具有一个比较清晰的生物降解路径，并且已分离和鉴定了一些符合这种路径的中间产物[4]。在多环芳香烃降解这方面，已经证明微生物及其共生生物有能力分解多环芳烃，并且分离了具有能分解蔡、菲、葱、药、荧的微生物纯种。早在30年前，就已说明了少些最简单多环芳烃如蔡、菲和葱等的微生物降解途径
[5]。对一些较复杂的多环芳烃的微生物分解途径，只到近几年才能确定。
1.3 芳香族化合物降解菌的来源及菌种
芳香族类降解菌的来源有多条途径，常见的有：①直接从污染环境中分离筛选出降解菌。②利用废水处理厂的活性污泥、沉降池底或厌氧消化池的污泥当作菌种。③纯化、驯化、筛选专性菌株。④利用基因工程技术构建菌株。
常见的芳香化合物降解菌，酵母菌，真菌是常见的白腐菌，假单胞菌，棒状杆菌属，芽孢杆菌，微球菌属，诺卡氏菌，球菌，产甲烷菌属，蓝藻等，，它们目前主要应用于造纸废水，印染废水，生活污水，残留石油、农药等领域，对芳香族污染物的降解起着相当重要的作用。
1.4 芳香族化合物的生物降解过程
苯环类芳烃降解大抵分5个阶段：①降解物质进到细胞内、②形成苯环裂解前体、③ 苯环结构裂解、④两性中间体产物形成、⑤产物被利用。芳香烃结构不同，在不同的条件下，能够由不同的微生物降解。从反应所需的条件上观察，芳烃类物质降解类别可分为好氧型与厌氧型降解；而从化学结构上看，分为单环结构的芳香烃与多环结构的芳香烃降解。
好氧型菌降解苯环化合物的路径的相同点是：先在酶和氧分子的配合作用下，苯环结构形成邻苯二酚或者其衍生物的共同代谢中间体，接着再历经开环酶和氧分子的协同作用，形成直链分子，末尾分解进入三羧酸循环。目前已发现，数量众多的杂环类芳香烃聚合物、氯代多环芳香烃
以及含氮类芳香族化合物，如硝基的芳香烃等均可通过好氧型途径进行降解。
图1-2 芳香烃化合物降解途径
如图1-2（a ）所示，苯在生物降解时通常存在两个分支路径，起初苯环是被苯双加氧酶进攻转化为邻苯二酚，之后再进一步通过邻位或间位双加氧酶的作用，产生粘康酸或粘康酸半醛。
如果苯环上存在取代基，那么它的降解会出现两种可能：先进攻苯环或先进攻侧链。实际上，如果侧脸很长，那么它的氧化就足够提供微生物生长所需的能量，导致它们不会去降解苯环。这些化合物被称作取代烷烃而不是取代芳香化合物。含2~7个碳原子的单烃基取代物的一般途径如图1-2（b ）。当碳原子数大于七时，会经由w 、β氧化先进攻取代烃侧链，之后再降解苯环。
联苯的降解路径如图1-2（c ）所示，两种方式添加联苯降解氧，分别为1，2位上加氧和3，4位上加氧，相比之下，前者占多数。联苯的降解是由两步双加氧酶作用，转化为2-羟基-6-酮基-6-苯基-2，3-己二烯酸，最后被降解成苯甲酸。
多环芳烃是一类含有两个或两个以上融合芳香环的化合物，由有机物不完全燃烧所产生[8]。萘的生物降解途径如图1-2（d ）所示。与其它芳香族化合物的降解类似，第一步中双加氧酶攻击环转化为1，2-羟基萘，然后在第一和第九个碳原子之间断裂。
1.5生物降解性的测定方法
生物降解性通常分为好氧生物降解性测定方法、厌氧条件下的生物降解性能测定方法、模拟实验法[6]。好氧生物降解性测定方法又可分为呼吸方法[7]、测定基质去除的方法、测定有机物分解产生的CO2量[8] 、分析细菌增殖情况的方法。
测定基质去除法是指直接检测微生物去除有机物的功效，它最能直观地展现出有机物的降解
情况，根据不同的指标，测定基质去除法可分特异性分析方法和综合指标法这两种，其中，综合指标法又分四种，分别为静置烧瓶筛选试验[9] 、半连续活性污泥法[10]、ATP 法[11]、（4）综合测试评价法 [12] 。
1.6影响生物降解的因素[13]
1.6.1化合物的链结构
生物降解速率与化合物的链结构息息相关，如果主链的柔顺性大，那么降解速率快，随着硬段引入主链，生物降解速率减小。另外，支链上基团的亲水疏水性和化学式的立体结构中的空间位阻同样对其具有影响。
1.6.2 分子量及其分布
通常情况下，生物降解的顺序由端基最先开始，分子量高的聚合物，因为它端基数量不多，所以它的降解速率较小，对于一些分布宽的聚合物，通常是低分子量部分先被降解。
1.6.3降解试验条件
环境条件如温度，pH 值，溶解氧，湿度，光，土壤，盐，或其他微生物生存所需要营养条件，如真菌在酸性环境中生长，细菌生长在微碱性条件。细菌与真菌的类型、数量及相互作用的方式，试验的时间与微生物（或酶）触碰的形式、样品的浓度等方面都会对化合物的降解产生诸多影响。
1.7 本文研究内容
本文针对4-甲砜基甲苯和邻硝基对甲砜基苯甲酸筛选对其有效降解的活性菌株，采取控制环境因素中的温度、pH 值、碳源、氮源、微量元素等来考察微生物在不同条件下的降解性能，运用液相色谱得出各个条件下底物剩余浓度，再根据已知初始浓度计算得到生物降解率，分析降解率的大小从而获得到最适温度、pH 值，以及最适微生物生存的营养条件，使工艺得到优化。
2 实验部分
2.1 实验材料与仪器
主要实验材料如表2-1所列。
表 2-1 主要实验材料
药品名称 制造商或产地
4-甲砜基甲苯 浙江嘉化能源化工股份有限公司
邻硝基对甲砜基甲苯 浙江嘉化能源化工股份有限公司
邻硝基对甲砜基苯甲酸 浙江嘉化能源化工股份有限公司
乙腈 国药集团化学试剂有限公司
磷酸 华东医药股份有限公司
主要实验材料如表2-2所列。
表 2-2 主要仪器和设备
电子天平AL204
冰箱JinsongBCD-kk204
全温空气摇床QYZ-211
生物显微镜YS100
液相色谱仪1200
超声波清洗机SK3300H
生化培养箱SHP-150
立式压力蒸汽灭菌锅YSQ-LS-75 梅特勒-托利多仪器有限公司 杭州金松优诺电器有限公司 上海福玛实验设备有限公司 上海长方光学仪器有限公司 上海精宏实验设备有限公司 上海科导超声仪器有限公司 上海博迅实业有限公司 上海福玛实验设备有限公司
2.2 实验内容
2.2.1 降解菌株的培养筛选
从化工厂中分别获得含有几种特定芳香烃有机物的未处理废水，从中筛选出能降解该芳香烃的活性菌株。具体方法如下：将具有特定芳香烃的工业废水经适当稀释，在牛肉膏蛋白胨固体培养基或土豆固体培养基（含有0.5‰的某种特定芳香烃）平板涂布，放置在35℃或28℃培养箱中培养72h 。将有生长的菌种分别标记，并在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线纯化。
图2-2 降解筛选过程流程图
纯化好的菌种，分别接于50mL 无糖无机盐培养基（含有1‰的同种特定芳香烃）中，放置在35℃或28℃恒温摇床中，130r/min，初筛培养48h/72h。初筛了的菌种再次转接到50mL 无糖无机盐培养基（含有2‰的同种芳香烃）中，放置在35℃或28℃恒温摇床中，130r/min，驯化培养48h/72h，得到芳香烃有机物的耐受菌。分别考察所得菌种对该类芳香烃的降解性能，从而获得该芳香烃的降解菌。
2.2.2 芳香烃有机物的降解处理
芳香烃有机物的降解处理以4-甲砜基甲苯为例：在灭菌无机盐培养基中加入4-甲砜基甲苯储备液，配成50mL 培养基体系，分别调节体系初始pH 值、环境温度、微量元素、碳源、氮源，于130 r/min条件下培养，在48 h后取样测定甲砜甲苯残余量，考察以上因素对降解菌降解4-甲砜基甲苯的影响。邻硝基对甲砜基苯甲酸的降解处理方法类似。
2.3 实验测量及优化方法
2.3.1 分析方法
论文采取的生物降解性检测方法是测定基质去除的方法，它是用特殊仪器或方法测定反应前、后受试验物浓度的变化，用于分析受试物的降解性，例如，甲砜甲苯降解率(%)=甲砜甲苯残余量/初始甲砜甲苯量*100%。本论文使用的特殊仪器是液相色谱仪，运用时首先需要制定出用于检测的标准曲线，得到一条峰面积对应样品浓度的标准曲线方程。在检测样品中组分含量时，只要在与标准曲线相同的色谱条件下测得峰面积，就可以运用标准曲线方程直接计算出注入色谱柱中的样品组分浓度。
2.3.2 流动相的配置
液相色谱中使用的流动相主要由超纯水，乙腈、磷酸等几种溶剂配制而成。通常所说的去离子水，实际上它并不是完全的纯物质，它还含有一些有机物，因此不适合高效液相色谱分析使用，而所谓的超纯水是指普通去离子水经由超纯水仪去除有机物后的二次蒸馏水。
配置时用250ml 的量筒量取250ml 超纯水，倒入500ml 的试剂瓶中，再量取220ml 的乙腈，倒入相同试剂瓶中，最后用移液管向试剂瓶中加入0.15ml 磷酸。轻轻摇匀，将试剂瓶放入超声波清洗机进行脱气，脱气完全后流动相即可使用。
2.3.3 标准曲线的制作
论文主要以4-甲砜基甲苯、邻硝基-4-甲砜基甲苯等芳香化合物为检测对象，已知检测时它们的大约浓度范围在千分之二左右，围绕这一范围称取标准样品，加蒸馏水制成不同浓度梯度的标准溶液，再与待测组分在相同的色谱条件，既波长254nm 、流速0.5ml/min下，相同体积精确进样，测量各峰的峰面积，用峰面积对样品浓度的关系，绘制标准曲线。实验测量时，待测物在相同色谱下，测到其峰面积，就可以直接利用标准曲线方程求得浓度。
具体步骤如下：得4-甲砜基甲苯标准样品，用电子天平精确称取0.4g 、0.8g 、 1.0g 、1.6g 、
3.2g 甲砜甲苯标准样品，分别放入五个50ml 容量瓶中，加蒸馏水置刻度线、定容，等到固体药品全部溶解后，启动液相色谱，调节波长和流速，使其控制在254nm ，0.5ml/min的测量条件下，待基线稳定后，用进样针以每针25微升的进样量进样，出峰后，得到峰面积，根据峰面积对样品的浓度的关系绘制出标准曲线图。以此类推，邻硝基对甲砜基苯甲酸也是用这种方法得到相应的标准曲线。
3 结果与分析
3.1标准曲线的获得
按照2.3.3介绍的标准曲线制作方法，用峰面积对样品浓度的关系绘制标准曲线，具体见图3-1和图3-2。
S 1-methyl-4-(methylsulfonyl)-Benzene(g/ml)
图3-1 4-甲砜基甲苯标准曲线
Y p e a k a r e a (m v . s e c ) X BA concentration(g/ml)
X BA concentration(g/ml)
图3-2 邻硝基对甲砜基苯甲酸标准曲线
经测得的两条标准曲线方程分别为4-甲砜基甲苯：Y=321.86+5750000X,R=0.999；邻硝基对甲砜基苯甲酸:Y=46469800*X-26.25343,R=0.99984。
3.2 筛选出的菌株
筛选得到的降解菌经纯化培养，进行微生物形态学观察。如图3-3和3-4所示。
图3-3 4-甲砜基甲苯降解菌株 图3-4 邻硝基对甲砜基苯甲酸镜检结果
4-甲砜基甲苯的降解菌经革兰氏染色镜检发现为球状革兰氏阴性菌。邻硝基对甲砜基苯甲酸的镜检结果发现该类菌落生长迅速，呈致密丛束状或不定型棉絮状，表面呈绿色。
3.3 4-甲砜基甲苯降解实验结果
3.3.1温度、pH 值对4-甲砜基甲苯降解的影响
以温度为例，50mL 培养基体系调节体系初始pH 值为7，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下，130r/min条件下培养48h ，测定4-甲砜基甲苯残余量，得到4-甲砜基甲苯的降解率。pH 的实验设计与之类似，即控制温度不变，设置一系列不同pH 值的培养基，其他培养条件不变，一段时间后，考察pH 值对4-甲砜基甲苯降解的影响。实验结果如表3-1、3-2所示。
表3-1温度对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌株 温度℃ 降解率（%）
20 20
25 30
降解菌株A 30 30
35 35
40 25
表3-2体系初始pH 对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌种 PH （℃） 降解率（%）
4 5
5 5
降解菌株A 6 15
7 15
8 20
9 10
实验结果表明，菌种降解4-甲砜基甲苯的最适温度为35℃，这可能是由于菌种为细菌，在35℃条件下，最适于菌种生长，对4-甲砜基甲苯的降解率最大，而该种菌的最适pH 值为8。
3.3.2 碳源对4-甲砜基甲苯降解的影响
50 mL4-甲砜基甲苯水溶液中（2‰）分别加入0.05 g 葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，再设置一组无碳源空白对照组，均接入菌种。调节pH 值为8，在35℃下，130 r/min条件下培养48 h，测定4-甲砜基甲苯残余量，得到甲砜甲苯的降解率。
表3-3 体系碳源对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌种 碳源 降解率（%）
葡萄糖 71
降解菌株A 果糖 66
麦芽糖 65
蔗糖 63
空白对照 56
由表3-3可知，在培养基中适当加入葡萄糖最有助于4-甲砜基甲苯的降解。理论上细菌有机碳源有多种，而以葡萄糖作为最理想化的碳源。
3.3.3 氮源对4-甲砜基甲苯降解的影响
50 mL 甲砜甲苯水溶液中（2‰）分别加入0.05 g 过硫酸铵，氯化铵，硝酸铵，硫酸铵，再设置一组无氮源空白对照组，均接入菌种。调节pH 值为8，在35℃下，130 r/min条件下培养48h ，测定4-甲砜基甲苯残余量，得到4-甲砜基甲苯的降解率。
表3-4 体系氮源对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌种 无机氮源 降解率（%）
过硫酸铵 61
氯化铵 60
绿色木霉菌 硝酸铵 67
硫酸铵 61
空白对照 56
实验结果（见表3-4）表明，适当加入氮源能加强菌种对4-甲砜基甲苯的降解效果。其中硝酸铵对降解效果的影响最为明显。
3.3.4 微量元素对4-甲砜基甲苯降解的影响
50mL 培养基体系分别加入1*10-5mol/L的微量元素Fe 2(SO4) 3 · XH 2O 、MnSO 4· H 2O 、CuSO 4· 5H2O 、ZnSO 4· 7H2O 、MgSO 4· 7H2O ，再设置一组无微量元素的空白对照组，均接入菌种。调节pH 值为8，在35℃下，130r/min条件下培养48h ，测定4-甲砜基甲苯残余量，得到4-甲砜基甲苯的降解率，实验结果如表3-5所示。
表3-5 体系微量元素对4-甲砜基甲苯降解的影响
菌种 微量元素 降解率(%)
Fe 2(SO4) 3 · XH2O 70.9
MnSO 4· H2O 72.9
降解菌株A CuSO 4· 5H2O 59.4
ZnSO 4· 7H2O 58.41
MgSO 4· 7H2O 57.77
空白对照 56
结论：结果表明，这5种微量元素对降解菌降解4-甲砜基甲苯均有降解作用，尤以MnSO 4。
3.3.5 4-甲砜基甲苯降解菌的应用
将降解体系配成10%，20%，30%，40%，50%, 60%体积比的废水培养液，130r/min条件下培养48h 后，测定4-甲砜基甲苯残余量，考察其对降解菌降解甲砜甲苯的影响，实验结果如表3-6所示。
表3-6 不同废水体积比下甲砜甲苯的降解率
菌种 废水量 降解率(%)
10 74.6
20 71.9
降解菌株A 30 65.8
40 63.6
50 62.3
60 60.2
结论：实验结果表明，甲砜甲苯降解菌在10%废水量时降解作用最大，降解率达74.6%，条件最优。
3.4 邻硝基对甲砜基苯甲酸降解实验结果
3.4.1温度对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制4个液体培养基，调节体系pH 值在相同条件下，分别取10mL 样品标记保存，再接入降解菌，分别置于20℃，30℃，40℃，50℃下培养72 h。72小时后再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-7所示。
菌种 温度（℃） 降解率（%）
20 18.72
绿色木霉菌 30 24.33
40 11.09
50 4.5
由表可知，该种菌的最适温度为30℃。猜测这种菌可能为霉菌，因为霉菌培养的最适温度为28℃，故该菌在30℃生长状况最佳，使得BA 降解的量最多。当温度过高时，会抑制或杀死该菌，造成降解率明显降低。
3.4.2 pH值对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制5个液体培养基，分别通过加HCL 或NaOH 调节PH 为3、4、6、7、9，分别取10mL 样品标记保存。再接入降解菌，置于相同温度下培养72 h。72小时后再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-6所示。
表3-8不同pH 值下菌种的降解效果
菌种 pH 降解率（%）
3 3.99
4 14.66
绿色木霉菌 6 17.8
7 7.82
9 0.95
由表3-8可知，该种菌最适pH 在6左右。由于PH 值为6有助于霉菌的生长，故使得降解率最大。PH 过酸或过碱条件下，会抑制该菌株的生长，使得降解率大幅度降低甚至起不到降解效果。
3.4.3碳源对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制4个液体培养基，分别加入1%的葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖。调节PH 至6。各取10mL 样品标记保存。再接入降解菌，置于30℃下培养72 h。72小时后再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-7所示。
菌种 碳源 降解率（%）
葡萄糖 22.78
绿色木霉菌 果糖 16.12
麦芽糖 19.11
蔗糖 18.93
由表3-9可知，在培养基中适当加入葡萄糖有助于BA 的降解。理论上霉菌的有机碳源有多种，而以葡萄糖作为最理想化的碳源。
3.4.4氮源对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制4个液体培养基，分别加入0.5%的过硫酸铵，硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，甘氨酸，L-组氨酸，DL-丙氨酸，L-白氨酸。取10mL 样品标记保存。再接入降解菌，置于30℃下培养72 h。72小时后再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-8和表3-9所示。42.13
表3-10不同无机氮源下菌种的降解效果
菌种 无机氮源 降解率（%）
过硫酸铵 15.80
绿色木霉菌 硫酸铵 16.21
硝酸铵 24.95
氯化铵 23.29
表3-11不同有机氮源下菌种的解效果
菌种 有机氮源 降解率（%）
甘氨酸 16.98
绿色木霉菌 组氨酸 17.86
丙氨酸 26.45
白氨酸 24.83
由以上2个表可知，适当加入无机氮和有机氮能加强该种菌对BA 的降解效果。其中无机氮中硝酸铵和有机氮中丙氨酸对降解效果的影响最为明显。对于菌体，以还原氮形式存在的铵盐是最先被利用的，已知菌体可以直接利用铵盐，参与细胞内含氮化合物的形成，使得菌体生长迅速，提高了降解的效果。
3.4.5微量元素对邻硝基对甲砜基苯甲酸降解的影响
配制4个液体培养基，分别加入0.1%的硫酸铁，硫酸锌，硫酸锰。取10mL 样品标记保存。再接入降解菌，置于30℃下培养72 h 。再分别取10mL 样品，经离心收集上清液，进行液相色谱分析，分别测定空白对照组和实验组中BA 的浓度，计算降解率，实验结果如表3-10所示。
表3-12不同微量元素下菌种的降解效果
菌种 微量元素 降解率
Fe 3+ 15.19
绿色木霉菌 Zn 2+ 20.56
Mn 2+ 15.14
由表3-10可知，该种菌在培养基中加入Zn 2+，对菌株的降解效果起到一定的帮助。在微生物体能Zn 2+能激活多种酶活性，能帮助BA 的降解。
3.4.6 最优条件下的降解率
通过上述实验找出最优条件为，温度30℃，PH 6,加入1%葡萄糖，0.5%硝酸铵，0.1%硫酸锌。在最优条件下BA 的降解率为31.44%
4 结论
本文就以芳香烃的生物降解处理展开一系列研究，绪论部分着重介绍了芳香烃有机物的研究背景、意义和国内外研究状况，芳香烃化合物降解菌的来源、菌种以及它的生物降解过程，此外还介绍了生物降解的测定方法和影响生物降解的因素。实验部分的主要内容包含不同细菌或霉菌的筛选获得，选择4-甲砜基甲苯、邻硝基-4-甲砜基苯甲酸等芳香化合物，进行生物降解处理，利用液相色谱测定处理前后有机物的含量，并进行工艺优化。
利用液相色谱检测过程中需要配置一定比例的流动相，制定标准曲线，本文中所列举的两条标准曲线均在与待测物相同色谱条件下测定，既254nm 、0.5ml/min,进料量25微升下，曲线相关系数均达到0.999以上，说明这两条曲线都具有一定的测量准确性。
已经阐明生物降解受降解试验条件的影响，如环境中的温度、pH 值、碳源、氮源、微量元素、以及样品浓度等。本文就采取控制变量法研究各个环境条件对微生物降解的影响。研究结果表明：4-甲砜基甲苯降解菌在35℃、pH=8，10%废水量时降解率最大，达74.6%，邻硝基对甲砜基苯甲酸降解菌在温度30℃，PH 6，1%葡萄糖，0.5%硝酸铵，0.1%硫酸锌时，降解率最大, 为31.44%。生物降解对污水中芳香烃污染物的处理具有广泛的应用前景。
当然实验仍存在许多不足之处，譬如本次实验采取的测定方法是标准曲线法，它除了具有应用简单快捷，可直接读取测量数据等优点外，也存在难以控制每次待测物一定在相同的色谱条件下，导致结果存在较大的测量误差。就实验本身上，我们是特别列举了几种芳香烃有机物，以及它们降解菌的筛选获得，而实际上，自然界中还存在许多未发现的降解菌株和不了解许多已发现的降解菌的降解路径。因此，未来对于芳香烃的生物降解处理研究还需要我们更加深入的探索和发现。
致 谢
毕业论文暂告收尾，这也意味着我在嘉院的四年的学习生活既将结束。回首既往，这四年里，我在学习上和思想上都受益非浅。这些进步除了自身努力外，与各位老师、同学和朋友的关心、支持和鼓励是分不开的。
论文的写作和实验操作是枯燥艰辛而又富有挑战的。芳香烃污染物的生物降解一直环境治理方面的热门话题，本论文实验由此展开一系列的降解研究和工艺优化，在这过程中，我特别要感谢我的导师缪程平老师，因为从一开始的论文的选题、到文献的采集、框架的设计、结构的布局，以及最终的论文定稿，缪老师都对我提供了最大的支持和鼓励，并教导我过程出现问题的原因，以及最后完善论文结构。没有缪老师的辛勤栽培、孜孜教诲，就没有我论文的顺利完成。
此外，我还要感谢与本实验有关的几位生物班同学，与他们的交流使我受益颇多。最后要感谢我周围朋友们对我的鼓励和帮助，正是因为有了他们，我才有了更多追求进步的勇气和信心。时间的仓促及自身专业水平的不足，整篇论文肯定存在尚未发现的缺点和错误。恳请阅读此篇论文的老师、同学，多予指正，不胜感激！
参考文献
[1] Falandysz J (1998) Polychlorinated napthalenes:an environmental update. Environ Pollut101:77-90
[2]Blumer M, Youngblood WW, scence, 1975,(13):53,188
[3]Zylstra G.J.,Molecular Environmental Biology(Garte SJ eg,).CRC Pree.BocaRaton.Florida. 1994,(32):83-115
[4]Yates J.R.,Modello.FJ.Molecular Envirmmntal Biology(Gart SJ ed.) ，CRC Press,Boca Raton Flo -rida. 1994,(8):65-82
[5]何德文, 等. 白腐真菌处理难降解的有机废水研究[J] . 工业水处理, 2000,20(3):14-17
[6]王宏, 叶常明. 天然水中有机污染物的生物降解性模拟试验方法[J].环境化学,1994,12(3):161-171
[7]安虎仁, 钱易, 顾夏声. 关于有机物生物降解性能测定方法选择的几点探讨[J].环境科学与技术, 1994, (4):47-49
[8] 王昆, 方建华, 等. 润滑油生物降解性快速测定方法的研究[J].石油学报(石油加工),2004,20(6): 74-78
[9] Tabak H H. Biodeg radability studies with organic priority pollutant compounds. WPCF,1981 53(10): 1503-1518
[10]李遵峰, 张立勇, 等. 半连续活性污泥法测定表面活性剂的好氧生物降解度[J].日用化学工业，2007,37(2):85-87,96
[11]孙立新, 蒋展鹏, 师绍其.ATP 法测定有机物好氧生物降解性的研究. 环境科学,1996,17(1):1-4
[12]蒋展鹏, 杨宏伟, 等. 有机物好氧降解性的综合测试评价方法[J].环境科学,1999,20(6):10-13
[13] 王昆, 方建华, 等. 润滑油生物降解性快速测定方法的研究[J].石油学报(石油加工),2004,20(6): 74-78