第22卷 第6期
2002年12月湛江海洋大学学报JournalofZhanjiangOceanUniversityVol.22No.6Dec.2002
氨基多糖的研究方法
范秀萍 吴红棉
(湛江海洋大学食品科学与工程系,广东 湛江 524025)
关键词:氨基多糖 提取方法 分离纯化方法 分析测定方法 结构研究方法
中图分类号:TS201123 文献标识码:A文章编号:1007-7995(2002)12-0073-08
氨基多糖,又称糖胺聚糖(Glycosominoglycan,GAG)、粘多糖(Mucopolysaccharides),是蛋白聚糖(Proteoglycan,PG)分子结构中的/含糖片段0,通过共价键(糖肽键)与蛋白聚糖的核心蛋白连接,是动物体内特有的含有氨基的生物大分子物质。GAG具有抗肿瘤、抗凝血、降血脂、增强免疫等多种生物活性,已引起了世界医药界和食品界的广泛关注。但由于GAG的结构复杂及以往研究技术的不足,直到近20~30年,人们才从多种海洋动物中提取分离GAG,对其分离纯化方法、理化性质、结构与功能等方面进行了深入的研究,并取得了一些突破性的进展。目前人们利用现代生化技术和一些先进的仪器分析检测方法可以推测出GAG的主要糖链结构,这为研究GAG的构效关系及其应用提供了基础。本文主要对GAG的提取与分离纯化、化学成分分析测定以及糖链结构分析三个方面的研究方法及其进展作一综述。[1]
1 GAG的提取与分离纯化方法
GAG的提取分离的关键问题是在多糖不被显著降解的条件下将与其结合的蛋白质除去。在动物体内,GAG与蛋白质是共存的。GAG长链之间、GAG链与核心蛋白链间都通过共价键连接,因此要分离提取GAG,不仅要破坏PG聚集体间的次级键(分离出PG),还要降解核心蛋白链,破坏GAG链与核心蛋白的结合(糖肽键),从而释放出GAG链,再经过分离纯化得到所需的GAG。
1.1 GAG的提取方法
最早采取的提取方法是用水(冷水或热水)、中性盐溶液(如:氯化钠、乙酸钠或三氯乙酸)浸提,通过沉淀离心后得到GAG的粗制品。这种方法较为温和,适用于不含SO4
透明质酸(HA)的提取,但该法得率低,且所得的GAG样品中蛋白质含量高。
20世纪50年代以后,主要采取碱提取法和蛋白酶水解法。
1.1.1 碱提取法 最早应用于硫酸软骨素(CS)的分离中。主要是根据PG中糖肽键对碱不稳定性而使糖苷键断裂。这种方法简便,得率较浸提法高,粗制品中蛋白质的含量较少。但必¹2-[2]的GAG,如:收稿日期:2002-10-14(),女,
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2-须在温和条件下进行,防止发生Walden转化或脱硫现象。因此,碱降解法不适用于含SO4
GAG的提取。另外,近年来人们也采用其它的提取方法,如:盐酸胍(Gdn-HCl)抽提法[3~5]的。
1.1.2 蛋白酶水解法 近年来蛋白酶水解法己取代碱提取法,成为从动物组织中提取GAG
[6][5]的最常用也是最理想的方法。常用的水解酶有:胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉
菌蛋白酶等,后两种酶作用肽键最广,应用最为广泛。胰蛋白酶消化产物氨基酸含量高。但由于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键,因此为去除生成物中较长的肽段,在不改变糖链结构的前提下,可先采用碱提法或Gdn-HCl抽提法,再用两种或两种以上的酶水解,能有效地提高GAG的得率。RodolphoM.Albano对海鞘Styelaplicata膜中的GAG进行研究时,分别采取不同浓度Gdn-HCl抽提和木瓜酶水解法,能取得较好的分离效果。
[6,8,9]多酶水解工艺在GAG提取中的应用已有一定的研究。常见的是将胃酶与胰酶组合。
动物组织经提取后所得的提取液中常杂有大分子蛋白质,可通过调节等电点、三氯乙酸
[4]沉淀法、Sevag脱蛋白法等除去。对于一些水小分子组分可通过透析法、超滤法等膜分离技
术除去。
1.2 分离纯化方法
分离纯化方法主要有沉淀法、离子交换色谱法以及其它的一些方法。
1.2.1 沉淀法 是一类最简便常用的方法。主要是根据GAG所含的极性基团及相对分子质量的不同,在不同浓度的溶剂中溶解度不同而将其分离。常用的沉淀剂有:乙醇、钡盐或锌盐、乙酸钾(用于肝素)。
乙醇沉淀法是制备GAG中最常用的一种方法,既可以从溶液中定量回收GAG,也可用于不同GAG组分的分级分离。在GAG的盐溶液中(如含Ca、Ba、Zn等)加入不同浓度的乙醇沉淀,经离心后可得到不同组份的GAG。对CS-A、CS-C及DS的分离效果较好,在工业生产中也比较实用,但需要的样品量大,且对于很相似的多种组份不能完全分级分离。
另外由于去垢剂季铵盐的发现,用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)及氯化十六烷基吡啶(CPC)作为沉淀剂,采取季铵盐络合法也可进行GAG的分离及纯化。目前CTAB络合法已用
[8][10]于扇贝和珍珠贝GAG的分离提纯中,分离产物经检测分析纯度较高。
1.2.2 离子交换层析法 离子交换层析技术是20世纪40年代未发展起来的,并应用于GAG的分离提纯中。离子交换柱的分离原理是根据溶液中带电粒子与交换剂之间结合力的差异而进行分离的。GAG在溶液中以聚阴离子存在,且不同的GAG中己糖醛酸的)COO、)SO4
[1]-2-2+2+2+[9][5][7]的取向、类型及数量不同,采用阴离子交换剂,利用不同离子浓度的盐溶液可将不同的组分洗脱下来,从而使GAG得到分离。使用离子交换层析法的一大优点是离子交换剂可反复使
用,并具有从稀溶液中吸附多糖的能力,样品上柱前可不必浓缩,因此在工业化生产中得到广泛应用。
用于GAG分离的阴离子交换剂种类较多,如Dowex树脂、DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex凝胶等。一般认为DEAE-Sephadex、QEAE-Sephadex在以离子梯度洗脱时,凝胶颗粒发生收缩而使得率降低,另外GAG相对分子质量的分散性使洗脱峰形分散,而DEAE-纤维素无此现象。因此常用DEAE-纤维素作为交换剂。但迄今为止尚无一种层析法能将GAG完全分开。因此人们想到将多种交换剂联合使用。Pearce(1968)将CPC-纤维素、DEAE-52-纤维素、Dowex1@2、ECTEOTA-纤维素结合起来使用,分离效果较好(回收率达90%)。,[4,5]
第6期 范秀萍等:氨基多糖的研究方法75P.Vieria在研究海参Ludwigothureagrisea体壁中的GAG时,将DEAE-Cellulose与凝胶柱Sepha-roseCL-4B结合,分离产物经琼脂糖电泳分析显示单一区带[11]。RodolphoM.Albano将DEAE-纤维素、SepharoseCL-4B和SephadexG-150结合起来用于海鞘膜中GAG的分离提取,得到三种
[5]均一组分,相对分子质量分别为100000以上、20000和8000。
1.2.3 其它方法 文献报道还有许多其它方法,如:凝胶过滤法、电泳法、亲和色谱技术等。
凝胶过滤法,又称凝胶色谱法或分子筛色谱法,主要是利用分子筛的原理进行分离纯化的。20世纪60年代以后,凝胶过滤法在GAG的分离纯化中得到广泛应用。PavaoMauroSG将SepharoseCL-4B与SephadexG-200结合对海鞘Ascidiannigra、S1plicata中的GAG进行分离纯化,纯化产物经电泳分析显示为单一区带。
-2-GAG是聚阴离子()COO、)SO4),在电场作用下可发生定向移动,因此采用电泳技术
也可进行分离。如:纸电泳、乙酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、带状电泳等。PauloA.S,etal(1987)从海参体壁中分离提取GAG时,经SepharoseCL-4B柱可得到两种级分:F-1与F-2,F-1再经DEAE-cellulose柱后可得到a、b、c、d四种级分,而其中的d级分经琼脂糖电泳中显示两条明显区带:F-1-d-x相对分子质量很高(>40000),含有氨基己糖和硫酸岩藻糖,F-1-d-y相对分子质量为5000~30000,只含有硫酸岩藻糖。另外,等电聚焦技术也在GAG的分离纯化中得到应用。
[14]70年代亲和色谱技术的应用也为GAG的分离纯化提供了新的方法。最早是用于肝素
的研究中。另外还有酶法[15][13][12]、超离心法[16]、高效液相色谱法(HPLC)等。
目前的研究报道中,大多是采用多种分离方法结合,这样可提高产物的相对纯度。如:Karamanos离子交换柱层析法、凝胶过滤法和密度梯度离心法结合起来用于乌贼皮肤中软骨素
[3,17]的分离。
2 GAG的分析测定方法
2.1 纯度鉴定方法
对GAG的性质、结构和活性的研究,首先必须得到GAG的均一组分。而GAG是大分子物质,微观上是不均一的,因此它的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均分布,它的统一标准不能用通常小分子化合物的统一标准来衡量,通常所说的GAG纯品是指一定分子量范围的均一组分。纯度鉴定的方法有:比旋度法、超离心法、高压电泳法及凝胶过滤法等。凝胶过滤法效果较好,但必须得到单一对称狭窄的峰。叶振南(2000)建议应用三种以上的色谱系统证明样品的纯度较为可靠[19][2][8][18]。
2.2 相对分子质量测定
GAG是一类多聚阴离子,由糖醛酸与乙酰氨基己糖组成的二糖基本单位经重复聚合而成,因此分离得到的二糖单位重复数不同,测出的相对分子质量也会有所变化,另外采用不同的测定方法得到的值也并不相同。GAG的相对分子质量变化范围在4000~8000000之间,不同相对分子质量范围的GAG其性质、如:粘度,生物活性等不同。因此研究GAG的性质和应用时,都必须涉及到相对分子质量的测定。如:低相对分子质量肝素的抗凝血活性只有未分级肝素(193IUPmg)的1P6[20]。[21]:、[18]
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滤法[22]湛江海洋大学学报 第22卷等。另外凝胶电泳法也可用于GAG相对分子质量的测定,如:PSGE、SDS-PAGE等,但
[23]电泳区带一般较宽。近年来,也有人将高效凝胶渗透色谱法(HPGPG)、小角激光散射法(LALLS)用于GAG的纯度和分子量的测定中
2.3 GAG化学组成的鉴定与检测。
2.3.1 总GAG的分析与检测 总GAG的测定(定性、定量)产要是采取一些化学方法,如:组织化学和物理化学方法。组织化学方法常用的是染色法,如:阿利新蓝(Alicanblue)染色法、天青I染色(azureA)、甲苯胺蓝等。由于GAG的染色没有特异性,所以难以得到准确的结果。比
[20]色法和分光光度法常用于GAG的共同定性定量分析中。另外还有同位素标记法、凝胶色谱
法、电泳法等。
2.3.2 单糖组分的测定 GAG的二糖重复单位是由氨基己糖、己糖醛酸通过糖苷键连接而
2--成,在氨基己糖与己糖醛酸上还带有一些取代基团,如:硫酸基()SO4)、乙酰基()NH)等。
在进行单糖组分的测定之前,必须先用酸、碱或酶进行水解,将GAG大分子分解成单糖片断、取代基团和氨基酸片段三部分。其中的单糖片断可分为碱性单糖(HexNH)、中性单糖和酸性单糖(HexUA)。
碱性单糖包括游离的氨基己糖和N-乙酰氨基己糖,最常用的检测方法有Elson-Morgan法和Morgan-Elson法和Wanger法及其改进方法。
中性单糖的测定常用的方法有比色法,如:苯酚)硫酸法、蒽酮比色法、L-半胱氨酸)硫酸法等。现在已有多种自动分析仪器出现,给中性单糖的测定带来了方便,如:气相色谱。
酸性单糖(己糖醛酸)的测定方法有Dische法及其改进方法Bitter法和Nelly法。常用的还有咔唑)硫酸法[24]。
2.3.3 取代基的测定 对于GAG中的硫酸基,通常采用明胶)氯化钡法进行鉴定,另外还有:比重法、滴定法、电导率法和比浊法等,但都不如用4.-氯-4-联苯胺进行分光光度法灵敏度高。电泳法也可用于完整GAG分子中O-和N-硫酸酯基的测定(低于1Lg),主要是根据电泳迁移率与硫酸基组成成比例来进行分析的。
对于乙酰基的测定,可采取气相色谱法(GC)、[H]核磁共振光谱法(NMR)等。1
3 糖链结构研究方法
对GAG结构的分析测定是研究其生物活性的基础。而糖的高级结构是以一级结构为基础的,但与蛋白质或其它大分子不同的是,糖链的一级结构包括更广泛的内容,要分析GAG的一级结构必须包括以下几个内容:相对分子质量、糖基组成及各种组成单糖的分子数比例、单糖构型、单糖的连接次序、异头构型、取代基情况、以及糖链与非糖链的连接等。GAG结构分析的方法也有很多。测定糖链一级结构的方法见表1。
第6期 范秀萍等:氨基多糖的研究方法
表1 测定糖链一级结构的常用方法
Fig.1 Theanalysismethodsofsaccharide.sstructure
解决的问题相对分子质量的测定
单糖组成和分子比例
吡喃环或呋喃环形式
连接次序
A-,B-异头异构体
羟基被取代情况
糖链-肽链连结方式常用的方法凝胶过滤法,MS,蒸气压法等部分酸水解,完全酸水解,纸色谱,GCIR部分酸水解,糖苷酶顺序水解,NMR糖苷酶水解,NMR,IR甲基化反应-气相色谱,高碘酸氧化,NMR,IR单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应77
3.1 化学方法
水解法:在进行多糖链分析时,水解法是最基本的方法。水解法包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。完全酸水解是将多糖与强酸(硫酸、盐酸)在一定温度(80~100e)进行水解(4~10h)。水解后可采有纸层析(PC)、薄层层析(TLC)、气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)和离子色谱法进行分析。水解的难易程度与组成多糖的单糖性质、单糖环的形状和糖苷键的构型有关。一般呋喃糖苷键较吡喃型易水解,A型较B型易水解,含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解。部分酸水解是利用多糖链中部分糖苷键如呋喃型糖苷键、位于链末端的糖苷键和支链中的糖苷键易水解脱落,而构成糖链的主链重复结构的部分和糖醛酸等对酸水解相对稳定的特点,将多糖进行部分酸水解后,经醇沉、离心,将上清液与沉淀物分别进行分析,根据所得到的一些小片段可推测多糖链的一些结构特点。乙酰解主要是将多糖乙酰化,可进行单糖组成分析。目前应用较好的是甲醇水解,多糖在HC-lCH3OH溶液中甲基化,形成甲基糖苷,经GC或HPLC分析,可得到单糖的组成。甲醇水解虽然得到不同形式的单糖,但得率高,所得图谱清晰,分辨率高。
高碘酸氧化法:高碘酸可以选择性地断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处,生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸,根据反应的定量进行,通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、支链多糖的分支数目等。但反应必须在控制条件下进行,以防止发生超氧化反应。
Smith降解:将高碘酸氧化产物用硼氢化钾或硼氢化钠还原成稳定的多羟基化合物,经酸水解后,用纸层析或GC鉴定水解产物,由降解产物可推断糖苷键的位置。甲基化反应(改良Hakomori法):多糖在无水二甲亚砜(DMSO)作用下,各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化,从而将糖苷键水解,水解后得到的化合物其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例可以推测出这种连接键型在多糖重复结构中的比例。水解产物经GC或GC-MS分析。由于GAG中含有酸性单糖(不溶于DMSO),进行甲基化之前必须先将其乙酰化,乙酰基在反应过程中会自动脱落而不影响结果。一般是将多种方法结合起来进行推定糖苷键的位置和糖链上取代基的位置。
3.2 生物学方法
氨基多糖裂解酶法在GAG的结构研究与组成分析中已得到了广泛的应用。这主要是由于糖苷酶的底物高度专一性。其中外切酶主要是针对糖链的非还原端单糖及其糖苷键的构型[5]
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[16]层析等可分析测定所释放的寡糖。另外还可用同位素标记寡糖
(PC、凝胶电泳、凝胶过滤层析
[4,13,26][25][25],观察消化前后产物的变化等),可推测糖基数。常用的糖苷酶有:软骨素裂解酶(AC、ABC、AC-II)、B-半乳糖苷酶等,如:软骨素酶AC或ABC只裂解N-乙酰氨基己糖B1y4糖醛酸,肝素裂解酶只裂解N-硫酸氨基己糖A1y4糖醛酸。酶法一般要借助于其它的分析方法共同分析,如:在研究海鞘S.plicata和H.pyriformis中GAG二糖重复单位时,就将酶法与HPLC结合[27]。KazuyukiSugahara(1996)在研究巨蟹软骨中CS-K时,用软骨素酶AC-II降解后,
1[28]结合快速离子轰击法、HPLC和HNMR(500MHz)色谱法分析其四糖重复单位。
免疫学方法:抗原与抗体会相互结合,一定结构的多糖会抑制抗体)抗原的相互结合,不同的糖(半抗原)有不同的抑制常数。当某种未知结构的糖链对抗原和抗体的结合产生了抑制,通过测定其抑制常数,再与已知结构的糖链相比较,有相近抑制常数的多糖,其结构也相
[3,29]似。
3.3 物理学方法
3.3.1 红外光谱法 IR是有机化学元素和高分子化学研究中不可缺少的工具。50年代开始应用于糖类的研究中,如不同糖的鉴定、定量测定(可达微克级)、取代基的识别等。随着人
-1们在研究中发现,还可识别糖的构型(D-、L-型)。如:B-糖苷键890cm有吸收峰,而A-糖苷
键在840cm有吸收峰;吡喃糖苷键在1100~1010cm有三个吸收峰,而呋喃糖苷键只出现两个吸收峰;1260cm与1730cm是酯基或O-乙酰基的特征峰-1-1[30]-1-1[16]。
3.3.2 核磁共振光谱法(NuckearMagneticResonance,NMR) 核磁共振方法是70年代才引入到多糖结构的研究中的,随着NMR技术的发展和高磁场NMR仪的出现,尤其是80年代发展起来的2DNMR技术,使得其在多糖结构的研究中得到广泛应用,且所得到的NMR谱的质量也越来越高。HNMR谱图主要解决多糖结构中糖苷键构型问题,根据各峰的面积之比可求得多糖中不同糖苷键的相对含量或各种残基的比例。如:通常A型吡喃己糖C-1质子的D值超过5.0@10,而B型则小于5.0@10
131-6-6[29][45]1。-41CNMR谱的化学位移的范围较HNMR谱广,可达2.0@10,分辩率高,与HNMR谱不同的是,各不同残基的相对比例与峰的相对高度成正比。糖链上如发生取代,取代位置的碳的化学位移将向低场移动,即出现/苷化位移0。通过与已知单糖的碳的化学位移相对照,从而可确定糖链的连接位置。另外还可由谱图上的信号确定某些单糖的种类,如:D170-176范围内的低场信号反映有己糖醛酸的羧基或乙酰基的存在,D16-18范围内的高场信号表明有6-位脱氧糖的甲基存在。除此之外还可根据异头碳上A异构体比B异构体高场D2-3确定异头碳的构型。
80年代后期,随着2DNMR甚至多维谱的出现,500MHz甚至600MHz的核磁共振仪的投入使用,使得NMR技术在多糖的结构研究中起着越来越重要的作用。如:COSY谱、NOESY
[31]谱、TOCSY谱以及HOHAHA谱等都已用于糖链的结构分析中。
3.3.3 质谱(MS) 质谱技术由于其高度的灵敏性,而使其在多糖的结构分析中占有十分重要的位置,可用于了解多糖的相对分子质量、结构片段、反应活性等多种信息。MS,尤其是GC-MS已广泛用于糖组成分析及甲基化分析中以确定糖残基的连接方式。80年代出现的FAB-MS(快速原子轰击质谱)使得高极性、难挥发且热不稳定的糖及其混合物可直接进行分析,在测定相对分子质量的同时,可根据糖的相对分子质量计算糖残基如己糖、己糖胺等的组成和数:
第6期 范秀萍等:氨基多糖的研究方法79飞行时间质谱(MALDI-MS)、串联质谱(MS)n[32]等。
[33]另外还有高效阴离子交换)脉冲安培法检测技术(HPAE-PAD)、X-衍射技术等。
4 结语
21世纪是海洋的世纪,海洋动物的研究与开发已引起了广大的关注,尤其是在医药界和食品界。作为动物体内活性成分之一的氨基多糖,由于其结构的特异性和多种生物活性,具有巨大的研究和应用前景,其中唯一的一种中性氨基多糖)))甲壳素及其衍生物已广泛应用于医药、食品、化工及农业等各方面。目前,人们在GAG的提取纯化、理化性质、结构与活性等方面都已展开了大量的研究。随着现代生化技术和高科技的发展,各种先进仪器、包括各种自动化检测仪器不断出现并应用于GAG的研究与应用中,这不仅为GAG的研究带来了方便,使得研究更为深入,同时也为人们开发和利用海洋资源提供了工具。
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第22卷 第6期
2002年12月湛江海洋大学学报JournalofZhanjiangOceanUniversityVol.22No.6Dec.2002
氨基多糖的研究方法
范秀萍 吴红棉
(湛江海洋大学食品科学与工程系,广东 湛江 524025)
关键词:氨基多糖 提取方法 分离纯化方法 分析测定方法 结构研究方法
中图分类号:TS201123 文献标识码:A文章编号:1007-7995(2002)12-0073-08
氨基多糖,又称糖胺聚糖(Glycosominoglycan,GAG)、粘多糖(Mucopolysaccharides),是蛋白聚糖(Proteoglycan,PG)分子结构中的/含糖片段0,通过共价键(糖肽键)与蛋白聚糖的核心蛋白连接,是动物体内特有的含有氨基的生物大分子物质。GAG具有抗肿瘤、抗凝血、降血脂、增强免疫等多种生物活性,已引起了世界医药界和食品界的广泛关注。但由于GAG的结构复杂及以往研究技术的不足,直到近20~30年,人们才从多种海洋动物中提取分离GAG,对其分离纯化方法、理化性质、结构与功能等方面进行了深入的研究,并取得了一些突破性的进展。目前人们利用现代生化技术和一些先进的仪器分析检测方法可以推测出GAG的主要糖链结构,这为研究GAG的构效关系及其应用提供了基础。本文主要对GAG的提取与分离纯化、化学成分分析测定以及糖链结构分析三个方面的研究方法及其进展作一综述。[1]
1 GAG的提取与分离纯化方法
GAG的提取分离的关键问题是在多糖不被显著降解的条件下将与其结合的蛋白质除去。在动物体内,GAG与蛋白质是共存的。GAG长链之间、GAG链与核心蛋白链间都通过共价键连接,因此要分离提取GAG,不仅要破坏PG聚集体间的次级键(分离出PG),还要降解核心蛋白链,破坏GAG链与核心蛋白的结合(糖肽键),从而释放出GAG链,再经过分离纯化得到所需的GAG。
1.1 GAG的提取方法
最早采取的提取方法是用水(冷水或热水)、中性盐溶液(如:氯化钠、乙酸钠或三氯乙酸)浸提,通过沉淀离心后得到GAG的粗制品。这种方法较为温和,适用于不含SO4
透明质酸(HA)的提取,但该法得率低,且所得的GAG样品中蛋白质含量高。
20世纪50年代以后,主要采取碱提取法和蛋白酶水解法。
1.1.1 碱提取法 最早应用于硫酸软骨素(CS)的分离中。主要是根据PG中糖肽键对碱不稳定性而使糖苷键断裂。这种方法简便,得率较浸提法高,粗制品中蛋白质的含量较少。但必¹2-[2]的GAG,如:收稿日期:2002-10-14(),女,
74湛江海洋大学学报 第22卷
2-须在温和条件下进行,防止发生Walden转化或脱硫现象。因此,碱降解法不适用于含SO4
GAG的提取。另外,近年来人们也采用其它的提取方法,如:盐酸胍(Gdn-HCl)抽提法[3~5]的。
1.1.2 蛋白酶水解法 近年来蛋白酶水解法己取代碱提取法,成为从动物组织中提取GAG
[6][5]的最常用也是最理想的方法。常用的水解酶有:胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉
菌蛋白酶等,后两种酶作用肽键最广,应用最为广泛。胰蛋白酶消化产物氨基酸含量高。但由于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键,因此为去除生成物中较长的肽段,在不改变糖链结构的前提下,可先采用碱提法或Gdn-HCl抽提法,再用两种或两种以上的酶水解,能有效地提高GAG的得率。RodolphoM.Albano对海鞘Styelaplicata膜中的GAG进行研究时,分别采取不同浓度Gdn-HCl抽提和木瓜酶水解法,能取得较好的分离效果。
[6,8,9]多酶水解工艺在GAG提取中的应用已有一定的研究。常见的是将胃酶与胰酶组合。
动物组织经提取后所得的提取液中常杂有大分子蛋白质,可通过调节等电点、三氯乙酸
[4]沉淀法、Sevag脱蛋白法等除去。对于一些水小分子组分可通过透析法、超滤法等膜分离技
术除去。
1.2 分离纯化方法
分离纯化方法主要有沉淀法、离子交换色谱法以及其它的一些方法。
1.2.1 沉淀法 是一类最简便常用的方法。主要是根据GAG所含的极性基团及相对分子质量的不同,在不同浓度的溶剂中溶解度不同而将其分离。常用的沉淀剂有:乙醇、钡盐或锌盐、乙酸钾(用于肝素)。
乙醇沉淀法是制备GAG中最常用的一种方法,既可以从溶液中定量回收GAG,也可用于不同GAG组分的分级分离。在GAG的盐溶液中(如含Ca、Ba、Zn等)加入不同浓度的乙醇沉淀,经离心后可得到不同组份的GAG。对CS-A、CS-C及DS的分离效果较好,在工业生产中也比较实用,但需要的样品量大,且对于很相似的多种组份不能完全分级分离。
另外由于去垢剂季铵盐的发现,用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)及氯化十六烷基吡啶(CPC)作为沉淀剂,采取季铵盐络合法也可进行GAG的分离及纯化。目前CTAB络合法已用
[8][10]于扇贝和珍珠贝GAG的分离提纯中,分离产物经检测分析纯度较高。
1.2.2 离子交换层析法 离子交换层析技术是20世纪40年代未发展起来的,并应用于GAG的分离提纯中。离子交换柱的分离原理是根据溶液中带电粒子与交换剂之间结合力的差异而进行分离的。GAG在溶液中以聚阴离子存在,且不同的GAG中己糖醛酸的)COO、)SO4
[1]-2-2+2+2+[9][5][7]的取向、类型及数量不同,采用阴离子交换剂,利用不同离子浓度的盐溶液可将不同的组分洗脱下来,从而使GAG得到分离。使用离子交换层析法的一大优点是离子交换剂可反复使
用,并具有从稀溶液中吸附多糖的能力,样品上柱前可不必浓缩,因此在工业化生产中得到广泛应用。
用于GAG分离的阴离子交换剂种类较多,如Dowex树脂、DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex凝胶等。一般认为DEAE-Sephadex、QEAE-Sephadex在以离子梯度洗脱时,凝胶颗粒发生收缩而使得率降低,另外GAG相对分子质量的分散性使洗脱峰形分散,而DEAE-纤维素无此现象。因此常用DEAE-纤维素作为交换剂。但迄今为止尚无一种层析法能将GAG完全分开。因此人们想到将多种交换剂联合使用。Pearce(1968)将CPC-纤维素、DEAE-52-纤维素、Dowex1@2、ECTEOTA-纤维素结合起来使用,分离效果较好(回收率达90%)。,[4,5]
第6期 范秀萍等:氨基多糖的研究方法75P.Vieria在研究海参Ludwigothureagrisea体壁中的GAG时,将DEAE-Cellulose与凝胶柱Sepha-roseCL-4B结合,分离产物经琼脂糖电泳分析显示单一区带[11]。RodolphoM.Albano将DEAE-纤维素、SepharoseCL-4B和SephadexG-150结合起来用于海鞘膜中GAG的分离提取,得到三种
[5]均一组分,相对分子质量分别为100000以上、20000和8000。
1.2.3 其它方法 文献报道还有许多其它方法,如:凝胶过滤法、电泳法、亲和色谱技术等。
凝胶过滤法,又称凝胶色谱法或分子筛色谱法,主要是利用分子筛的原理进行分离纯化的。20世纪60年代以后,凝胶过滤法在GAG的分离纯化中得到广泛应用。PavaoMauroSG将SepharoseCL-4B与SephadexG-200结合对海鞘Ascidiannigra、S1plicata中的GAG进行分离纯化,纯化产物经电泳分析显示为单一区带。
-2-GAG是聚阴离子()COO、)SO4),在电场作用下可发生定向移动,因此采用电泳技术
也可进行分离。如:纸电泳、乙酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、带状电泳等。PauloA.S,etal(1987)从海参体壁中分离提取GAG时,经SepharoseCL-4B柱可得到两种级分:F-1与F-2,F-1再经DEAE-cellulose柱后可得到a、b、c、d四种级分,而其中的d级分经琼脂糖电泳中显示两条明显区带:F-1-d-x相对分子质量很高(>40000),含有氨基己糖和硫酸岩藻糖,F-1-d-y相对分子质量为5000~30000,只含有硫酸岩藻糖。另外,等电聚焦技术也在GAG的分离纯化中得到应用。
[14]70年代亲和色谱技术的应用也为GAG的分离纯化提供了新的方法。最早是用于肝素
的研究中。另外还有酶法[15][13][12]、超离心法[16]、高效液相色谱法(HPLC)等。
目前的研究报道中,大多是采用多种分离方法结合,这样可提高产物的相对纯度。如:Karamanos离子交换柱层析法、凝胶过滤法和密度梯度离心法结合起来用于乌贼皮肤中软骨素
[3,17]的分离。
2 GAG的分析测定方法
2.1 纯度鉴定方法
对GAG的性质、结构和活性的研究,首先必须得到GAG的均一组分。而GAG是大分子物质,微观上是不均一的,因此它的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均分布,它的统一标准不能用通常小分子化合物的统一标准来衡量,通常所说的GAG纯品是指一定分子量范围的均一组分。纯度鉴定的方法有:比旋度法、超离心法、高压电泳法及凝胶过滤法等。凝胶过滤法效果较好,但必须得到单一对称狭窄的峰。叶振南(2000)建议应用三种以上的色谱系统证明样品的纯度较为可靠[19][2][8][18]。
2.2 相对分子质量测定
GAG是一类多聚阴离子,由糖醛酸与乙酰氨基己糖组成的二糖基本单位经重复聚合而成,因此分离得到的二糖单位重复数不同,测出的相对分子质量也会有所变化,另外采用不同的测定方法得到的值也并不相同。GAG的相对分子质量变化范围在4000~8000000之间,不同相对分子质量范围的GAG其性质、如:粘度,生物活性等不同。因此研究GAG的性质和应用时,都必须涉及到相对分子质量的测定。如:低相对分子质量肝素的抗凝血活性只有未分级肝素(193IUPmg)的1P6[20]。[21]:、[18]
76
滤法[22]湛江海洋大学学报 第22卷等。另外凝胶电泳法也可用于GAG相对分子质量的测定,如:PSGE、SDS-PAGE等,但
[23]电泳区带一般较宽。近年来,也有人将高效凝胶渗透色谱法(HPGPG)、小角激光散射法(LALLS)用于GAG的纯度和分子量的测定中
2.3 GAG化学组成的鉴定与检测。
2.3.1 总GAG的分析与检测 总GAG的测定(定性、定量)产要是采取一些化学方法,如:组织化学和物理化学方法。组织化学方法常用的是染色法,如:阿利新蓝(Alicanblue)染色法、天青I染色(azureA)、甲苯胺蓝等。由于GAG的染色没有特异性,所以难以得到准确的结果。比
[20]色法和分光光度法常用于GAG的共同定性定量分析中。另外还有同位素标记法、凝胶色谱
法、电泳法等。
2.3.2 单糖组分的测定 GAG的二糖重复单位是由氨基己糖、己糖醛酸通过糖苷键连接而
2--成,在氨基己糖与己糖醛酸上还带有一些取代基团,如:硫酸基()SO4)、乙酰基()NH)等。
在进行单糖组分的测定之前,必须先用酸、碱或酶进行水解,将GAG大分子分解成单糖片断、取代基团和氨基酸片段三部分。其中的单糖片断可分为碱性单糖(HexNH)、中性单糖和酸性单糖(HexUA)。
碱性单糖包括游离的氨基己糖和N-乙酰氨基己糖,最常用的检测方法有Elson-Morgan法和Morgan-Elson法和Wanger法及其改进方法。
中性单糖的测定常用的方法有比色法,如:苯酚)硫酸法、蒽酮比色法、L-半胱氨酸)硫酸法等。现在已有多种自动分析仪器出现,给中性单糖的测定带来了方便,如:气相色谱。
酸性单糖(己糖醛酸)的测定方法有Dische法及其改进方法Bitter法和Nelly法。常用的还有咔唑)硫酸法[24]。
2.3.3 取代基的测定 对于GAG中的硫酸基,通常采用明胶)氯化钡法进行鉴定,另外还有:比重法、滴定法、电导率法和比浊法等,但都不如用4.-氯-4-联苯胺进行分光光度法灵敏度高。电泳法也可用于完整GAG分子中O-和N-硫酸酯基的测定(低于1Lg),主要是根据电泳迁移率与硫酸基组成成比例来进行分析的。
对于乙酰基的测定,可采取气相色谱法(GC)、[H]核磁共振光谱法(NMR)等。1
3 糖链结构研究方法
对GAG结构的分析测定是研究其生物活性的基础。而糖的高级结构是以一级结构为基础的,但与蛋白质或其它大分子不同的是,糖链的一级结构包括更广泛的内容,要分析GAG的一级结构必须包括以下几个内容:相对分子质量、糖基组成及各种组成单糖的分子数比例、单糖构型、单糖的连接次序、异头构型、取代基情况、以及糖链与非糖链的连接等。GAG结构分析的方法也有很多。测定糖链一级结构的方法见表1。
第6期 范秀萍等:氨基多糖的研究方法
表1 测定糖链一级结构的常用方法
Fig.1 Theanalysismethodsofsaccharide.sstructure
解决的问题相对分子质量的测定
单糖组成和分子比例
吡喃环或呋喃环形式
连接次序
A-,B-异头异构体
羟基被取代情况
糖链-肽链连结方式常用的方法凝胶过滤法,MS,蒸气压法等部分酸水解,完全酸水解,纸色谱,GCIR部分酸水解,糖苷酶顺序水解,NMR糖苷酶水解,NMR,IR甲基化反应-气相色谱,高碘酸氧化,NMR,IR单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应77
3.1 化学方法
水解法:在进行多糖链分析时,水解法是最基本的方法。水解法包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。完全酸水解是将多糖与强酸(硫酸、盐酸)在一定温度(80~100e)进行水解(4~10h)。水解后可采有纸层析(PC)、薄层层析(TLC)、气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)和离子色谱法进行分析。水解的难易程度与组成多糖的单糖性质、单糖环的形状和糖苷键的构型有关。一般呋喃糖苷键较吡喃型易水解,A型较B型易水解,含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解。部分酸水解是利用多糖链中部分糖苷键如呋喃型糖苷键、位于链末端的糖苷键和支链中的糖苷键易水解脱落,而构成糖链的主链重复结构的部分和糖醛酸等对酸水解相对稳定的特点,将多糖进行部分酸水解后,经醇沉、离心,将上清液与沉淀物分别进行分析,根据所得到的一些小片段可推测多糖链的一些结构特点。乙酰解主要是将多糖乙酰化,可进行单糖组成分析。目前应用较好的是甲醇水解,多糖在HC-lCH3OH溶液中甲基化,形成甲基糖苷,经GC或HPLC分析,可得到单糖的组成。甲醇水解虽然得到不同形式的单糖,但得率高,所得图谱清晰,分辨率高。
高碘酸氧化法:高碘酸可以选择性地断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处,生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸,根据反应的定量进行,通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、支链多糖的分支数目等。但反应必须在控制条件下进行,以防止发生超氧化反应。
Smith降解:将高碘酸氧化产物用硼氢化钾或硼氢化钠还原成稳定的多羟基化合物,经酸水解后,用纸层析或GC鉴定水解产物,由降解产物可推断糖苷键的位置。甲基化反应(改良Hakomori法):多糖在无水二甲亚砜(DMSO)作用下,各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化,从而将糖苷键水解,水解后得到的化合物其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例可以推测出这种连接键型在多糖重复结构中的比例。水解产物经GC或GC-MS分析。由于GAG中含有酸性单糖(不溶于DMSO),进行甲基化之前必须先将其乙酰化,乙酰基在反应过程中会自动脱落而不影响结果。一般是将多种方法结合起来进行推定糖苷键的位置和糖链上取代基的位置。
3.2 生物学方法
氨基多糖裂解酶法在GAG的结构研究与组成分析中已得到了广泛的应用。这主要是由于糖苷酶的底物高度专一性。其中外切酶主要是针对糖链的非还原端单糖及其糖苷键的构型[5]
78湛江海洋大学学报 第22卷
[16]层析等可分析测定所释放的寡糖。另外还可用同位素标记寡糖
(PC、凝胶电泳、凝胶过滤层析
[4,13,26][25][25],观察消化前后产物的变化等),可推测糖基数。常用的糖苷酶有:软骨素裂解酶(AC、ABC、AC-II)、B-半乳糖苷酶等,如:软骨素酶AC或ABC只裂解N-乙酰氨基己糖B1y4糖醛酸,肝素裂解酶只裂解N-硫酸氨基己糖A1y4糖醛酸。酶法一般要借助于其它的分析方法共同分析,如:在研究海鞘S.plicata和H.pyriformis中GAG二糖重复单位时,就将酶法与HPLC结合[27]。KazuyukiSugahara(1996)在研究巨蟹软骨中CS-K时,用软骨素酶AC-II降解后,
1[28]结合快速离子轰击法、HPLC和HNMR(500MHz)色谱法分析其四糖重复单位。
免疫学方法:抗原与抗体会相互结合,一定结构的多糖会抑制抗体)抗原的相互结合,不同的糖(半抗原)有不同的抑制常数。当某种未知结构的糖链对抗原和抗体的结合产生了抑制,通过测定其抑制常数,再与已知结构的糖链相比较,有相近抑制常数的多糖,其结构也相
[3,29]似。
3.3 物理学方法
3.3.1 红外光谱法 IR是有机化学元素和高分子化学研究中不可缺少的工具。50年代开始应用于糖类的研究中,如不同糖的鉴定、定量测定(可达微克级)、取代基的识别等。随着人
-1们在研究中发现,还可识别糖的构型(D-、L-型)。如:B-糖苷键890cm有吸收峰,而A-糖苷
键在840cm有吸收峰;吡喃糖苷键在1100~1010cm有三个吸收峰,而呋喃糖苷键只出现两个吸收峰;1260cm与1730cm是酯基或O-乙酰基的特征峰-1-1[30]-1-1[16]。
3.3.2 核磁共振光谱法(NuckearMagneticResonance,NMR) 核磁共振方法是70年代才引入到多糖结构的研究中的,随着NMR技术的发展和高磁场NMR仪的出现,尤其是80年代发展起来的2DNMR技术,使得其在多糖结构的研究中得到广泛应用,且所得到的NMR谱的质量也越来越高。HNMR谱图主要解决多糖结构中糖苷键构型问题,根据各峰的面积之比可求得多糖中不同糖苷键的相对含量或各种残基的比例。如:通常A型吡喃己糖C-1质子的D值超过5.0@10,而B型则小于5.0@10
131-6-6[29][45]1。-41CNMR谱的化学位移的范围较HNMR谱广,可达2.0@10,分辩率高,与HNMR谱不同的是,各不同残基的相对比例与峰的相对高度成正比。糖链上如发生取代,取代位置的碳的化学位移将向低场移动,即出现/苷化位移0。通过与已知单糖的碳的化学位移相对照,从而可确定糖链的连接位置。另外还可由谱图上的信号确定某些单糖的种类,如:D170-176范围内的低场信号反映有己糖醛酸的羧基或乙酰基的存在,D16-18范围内的高场信号表明有6-位脱氧糖的甲基存在。除此之外还可根据异头碳上A异构体比B异构体高场D2-3确定异头碳的构型。
80年代后期,随着2DNMR甚至多维谱的出现,500MHz甚至600MHz的核磁共振仪的投入使用,使得NMR技术在多糖的结构研究中起着越来越重要的作用。如:COSY谱、NOESY
[31]谱、TOCSY谱以及HOHAHA谱等都已用于糖链的结构分析中。
3.3.3 质谱(MS) 质谱技术由于其高度的灵敏性,而使其在多糖的结构分析中占有十分重要的位置,可用于了解多糖的相对分子质量、结构片段、反应活性等多种信息。MS,尤其是GC-MS已广泛用于糖组成分析及甲基化分析中以确定糖残基的连接方式。80年代出现的FAB-MS(快速原子轰击质谱)使得高极性、难挥发且热不稳定的糖及其混合物可直接进行分析,在测定相对分子质量的同时,可根据糖的相对分子质量计算糖残基如己糖、己糖胺等的组成和数:
第6期 范秀萍等:氨基多糖的研究方法79飞行时间质谱(MALDI-MS)、串联质谱(MS)n[32]等。
[33]另外还有高效阴离子交换)脉冲安培法检测技术(HPAE-PAD)、X-衍射技术等。
4 结语
21世纪是海洋的世纪,海洋动物的研究与开发已引起了广大的关注,尤其是在医药界和食品界。作为动物体内活性成分之一的氨基多糖,由于其结构的特异性和多种生物活性,具有巨大的研究和应用前景,其中唯一的一种中性氨基多糖)))甲壳素及其衍生物已广泛应用于医药、食品、化工及农业等各方面。目前,人们在GAG的提取纯化、理化性质、结构与活性等方面都已展开了大量的研究。随着现代生化技术和高科技的发展,各种先进仪器、包括各种自动化检测仪器不断出现并应用于GAG的研究与应用中,这不仅为GAG的研究带来了方便,使得研究更为深入,同时也为人们开发和利用海洋资源提供了工具。
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