双水相萃取分离技术的研究进展
双水相萃取与传统的萃取分离技术不同, 有其独特的优点, 是一种新型的分离技术。因此, 双水相萃取获得了较好的成果, 受到越来越多研究者的青睐。双水相萃取在诸多方面有着广泛的应用, 具有良好的应用前景。
1、双水相萃取技术的简介
与传统的分离技术相比，双水相技术作为一种新型的分离技术，因其体积小，处理能力强，成相时间短，适合大规模化操作等特点，已经越来越受到人们的重视。
Beijeronck 在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象。双水相萃取(Aqueous two-phase extraction, ATPE) 技术真正应用是在20世纪60年代，1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson 将双水相体系成功用于分离叶绿素，这解决了蛋白质变性和沉淀的问题[1]。1979年德国Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离，为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础[2]。迄今为止看，双水相萃取技术已被成功应用于生物工程、药物提取、金属离子分离等方面。尽管其已发展成为一种相对比较成熟的技术，但仍然有值得深入研究与完善的方面。作者在此主要介绍了双水相萃取的基本要点及应用特点，综述了双水相萃取技术在生物工程、药物成分提取分离等方面的应用。
2、双水相萃取技术的原理
2.1双水相体系的形成
当一定浓度的某种有机物水溶液与其它有机物水溶液, 或者有机物水溶液与无机盐水溶液以一定体积比混合时, 能够自然分相并形成互不相溶的双水相或者多水相体系, 这就是双水相体系。从溶液理论来说, 当2种有机物或者有机物与无机盐混合时, 是分相还是混合成一相, 取决于混合时的熵变和分子间的相互作用力。由于双水相体系本身的复杂性, 体系的熵很难准确计算, 分子间的相互作用力也不清楚, 所以双水相的形成机理很复杂。
对于高聚物/ 高聚物双水相体系[4], 用传统的理论来解释, 是由于界面张力等因素形成两相之间的不对称, 使得在空间上产生阻隔效应, 使两相之间无法相
互渗透, 不能形成均一相, 从而具有分离倾向, 一般这种分离倾向的大小和形成双水相的2种物质的疏水性成线性关系。对于有无机盐存在的双水相体系, 以及新开发的表面活性剂双水相体系, 这种解释就无能为力了。表1是各种双水相体系的成相原理。
表1 双水相体系的分类以及成相原理
双水相体系的种类
高聚物/ 高聚物
高聚物/ 无机盐
低分子有机物/无机盐
表面活性剂双水相[5]
2.2双水相萃取的基本原理
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的原理相似, 都是依据物质在两相间的选择性分配[3]。当萃取体系的性质不同, 物质进入双水相体系后, 由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的浓度不同, 从而达到分离的目的。溶质(包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等) 在双水相体系中服从Nernst 分配定律: K= Ct/ Cb. 其中Ct 、Cb 分别代表溶质在上相、下相中的浓度。
系统固定时, 分配系数为一常数, 与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后, 在上相和下相间进行选择性分配, 这种分配关系与常规的萃取分配关系相比, 表现出更大或更小的分配系数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0101, 因此为物质分离提供了可能。
2.3双水相萃取体系的特点
(1)整个体系的含水量高(70%～90%)。(2)单级分离提纯效率高。(3)传质速率快, 分相时间短。(4)操作条件温和, 所需设备简单。(5)过程易于放大和进行连续化操作。(6)不存在有机溶剂残留问题。(7)双水相萃取处理容量大, 能耗低。
2.4影响物质分配平衡的因素
影响物质在双水相体系中分配的因素有很多, 其中主要包括体系有机相组成(如有机物的类型、平均分子量等) 、盐类(包括离子类型和浓度、电荷数、电解质成相基本原理 空间上产生的空间阻隔效应 盐析作用 盐相、有机相与水分子缔合竞争 胶束平衡共存的结果
强度、酸碱性等) 、相比R [6] (上下相的体积比) 、溶质即目标物质的物理化学性质(包括分子量, 等电点), 以及体系的温度、压力等。而这些参数并不是独立起作用的, 所以要预测双水相体系间的分配系数是相当困难的。目前最常用的方法是用试验的方法来确定满足分配要求的操作条件。
3、双水相萃取技术的应用
3. 1 生物工程技术中物质的提取与纯化
双水相萃取技术最先应用的领域是生物产品的分离，目前，双水相萃取技术已应用于蛋白质、生物酶、菌体、细胞以及氨基酸、抗生素等生物小分子物质的分离、纯化。朱自强[7]等用PEG2000 8%(质量分数) 、(NH4) 2SO 4 20%(质量分数) 在pH=5. 0，20 ℃时直接处理青霉素G 发酵液，得出分配系数K=58. 39，浓缩倍数为3. 53，回收率为93. 67%，青霉素G 对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因子分别为13. 36和21. 9。在此基础上，再安排了青霉素G 的实验小试流程，得到了青霉素G 的结晶，纯度为88. 48%，总收率达76. 56%。 Babu [10]等用18%的PEG1500与14%的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取菠萝蛋白酶和多酚氧化酶, 菠萝蛋白的纯化倍数为410, 酶活回收率达到228%,而多酚氧化酶的纯化倍数为2107, 酶活回收率达到90%。Chethana [11]等用PEG6000 与(NH4) 2SO 4组成的双水相从甜菜根中萃取甜菜色素,70%～75%甜菜色素被萃取到上相,90%以上的糖类被萃取到下相。
3.2药物及其有效成分的分离与提取
双水相萃取技术在医药工业中的应用主要表现在药物及其有效成分的分离与提取。如可用于天然植物药用有效成分的分离与提取，具有代表性的工作是对黄芩苷和黄芩素的分离。黄芩苷是黄芩的主要有效成分，用PEG6000- K 2HPO 4-水的双水相系统对黄芩苷和黄芩素进行分配实验，由于黄芩苷和黄芩素都有一定的憎水性，被主要分配在富含PEG 的上相，两种物质的分配系数最大可达到30和35，若能通过一定的手段去掉溶液中的PEG ，则经浓缩结晶后可得到黄芩苷和黄芩素产品。
3.3金属离子的测定与分离
除了传统的用于生物分离领域外，双水相萃取还可用于其它一些领域，如测定金属离子的含量及实现金属离子的分离。在聚乙二醇2000/ 硫酸按/ 偶氮胂( Ⅲ) 双水相体系中，实现了Ti( Ⅳ) 与Zr( Ⅳ) 的分离；在聚乙二醇2000/硫酸钠/ 硫氰酸
钾双水相体系中，实现了Co( Ⅱ) 、Ni(Ⅱ) 、Mo( Ⅵ) 等金属离子的定量分离。在聚乙二醇/ 硫酸钠双水相体系中，实现了从碱性氰化液中萃取分离金。在溴化钾/ 乙醇/ 硫酸铵双水相体系中，实现了AuB 与AlB 、NiA 、MnA 、CrB 、CoA 、FeB 、ZnA 、CuA 、MoE 、UC 的分离。
3.4在发酵工程中的应用
由于发酵液中成分比较复杂，目标产物含量低，而传统的分离纯化方法步骤繁琐, 导致产品回收率低，成本居高不下。目前国内外已经有利用双水相体系从发酵液萃取分离目标产物的报道和研究，并取得了一些成绩。Pan [9]等利用PEG1500/ NaH2PO 4 体系从Trichoderma koningii 发酵液中分离纯化β-木糖苷酶, 该酶主要分配在下相, 下相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。
4、双水相萃取技术的评价
双水相萃取技术作为一种新型的分离技术, 可以利用不复杂的设备、并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分, 克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用, 在萃取过程中保持生物物质的活性及构象等明显的技术优势, 并且取得了一些阶段性的成果, 在生物工程、药物分析、金属分离等方面有着广阔的应用前景。然而, 有关双水相的应用和研究还不够, 一些技术难题还有待于解决。如: 易乳化、相分离时间长, 成相聚合物的成本较高, 水溶性高聚物大多数粘度较大, 不易定量控制; 水溶性的高聚物难以挥发, 使反萃必不可少, 高聚物回收困难等等。
今后, 随着对双水相体系研究的深入, 以及其他双水相体系的不断开发, 例如离子液体双水相体系, 其形成机理, 热力学模型、动力学模型以及工艺技术等方面的问题最终会被突破和解决, 其应用领域将进一步拓宽, 双水相萃取将会成为一种优良的分离技术。
目前, 双水相萃取技术已被用于众多生物产品的分离提纯, 并显示出众多其他分离技术不具备的优点, 是一种应用前景广阔的新型生物分离技术。但是, 要将这一技术开发应用到大规模生产过程, 还有许多理论和实践方面的技术问题有待解决。主要表现在如下几个方面:
(1)聚合物/ 聚合物构成的双水相体系具有良好的分离性能, 但用于构造双水相体系的成相聚合物的价格都比较昂贵, 对于一般的生物产品, 分离成本过高,
在经济上是不合理的。
(2) 虽然通过选择适宜的双水相体系和操作条件, 可获得被分离物质在两相间较大的分配系数和较高的纯化倍数, 但目标产物与成相物质的分离比较困难。
(3)双水相体系界面张力较小, 虽有利于提高传质效率, 但是较小的界面张力易导致乳化现象的产生, 使相分离时间延长, 分离效率降低。
(4)双水相体系中组分间的作用非常复杂, 目前没有建立一套较为完整的理论和方法解释和预测物质在双水相体系中的相行为和被分配物质在两相中的分配行为。
(5)缺乏对双水相过程的工程放大及设备方面的研究, 在体系流体力学, 相际间的传质, 传递过程方面研究很少。研究的方法基本上还是通过实验的方法, 研究的结果只是建立在实验的基础上, 大部分情况下不能外延, 缺乏对过程规律的认识。
(6)对双水相萃取工艺整体的集成优化研究还不足, 对分离过程中产生的大量含成相物质的稀溶液, 还没有找到一条科学合理的利用及处理途径, 大量含盐或含成相组分的废水溶液难以回收及处理。
生物技术的发展, 必将促进双水相萃取体系的完善, 包括新萃取体系的开发、工艺优化、萃取剂回收、体系分相技术、萃取设备和基础理论研究等, 从而更显示出双水相分离技术在生物物质分离的独特优点。
参考文献：
[1] Anita Jain, Johri B N. Partitioning of an extracellular xylanase produced by a therm ophilic fungus Melanocarp us albomyces IIS 68 in an aqueous two-phase system[J]. Biore source Technology,1999, 67(2): 205207.
[2] Zijlstra Gerben M, de Gooijer Cornelis D, T ramper Johannes. ExTractive bioconversions in a queous two-phase systems[J]. CurrentOpinionin Biotechnology , 1998, 9(2): 171176.
[3] 郑楠, 刘杰. 双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究[J]. 化学与生物工程, 2006, 23(10): 7—9.
[4] 谭平华, 林金清, 肖春妹, 等. 双水相萃取技术研究进展及应用[J]. 化工生产与技术,2003, 10( 1) :19225.
[5]朱慎林, 朴香兰, 沈刚. 表面活性剂萃取分离氨基酸的研究[J]. 化学工程,2006,34( 3) :426.
[6]修志龙, 姜伟, 苏志国. 用聚乙二醇沉淀法清除细胞碎片[ J] . 化工学报, 1993,44(6): 7572760.
[7] 李勉, 朱自强, 梅乐和. 聚合物2聚合物双水相系统相平衡的计算[ J] . 化学工程,1996, 24(2): 60264.
[8] Pan I H, Y ao HJ ,Li YK. Effective exraction and purification of xylosidase from trichoderma koningii fermentation culture by aqueous two-phase partitioning[J ]. Enzyme and Microbial Technology. 2001, (28) :196～201.
[9] 王雯娟. 双水相萃取菠萝蛋白酶的研究[D]. 广西:广西大学化学化工学院,2004, (5～6) :14～15.
[10] Babu BR, Rastogi NK, Raghavarao KSMS1Liquid liquid extraction of bromelain and polypHenol oxidase using aqueous two-phase system[J] 1 Chemical Engineering andProcessing,2008,47:83289.
[11] Chethana S, NayakCA, et al1 Aqueous two phase extraction for purification and concentration of betalains [J] .Journal of Food Engineering, 2007, 81:67926871
双水相萃取分离技术的研究进展
双水相萃取与传统的萃取分离技术不同, 有其独特的优点, 是一种新型的分离技术。因此, 双水相萃取获得了较好的成果, 受到越来越多研究者的青睐。双水相萃取在诸多方面有着广泛的应用, 具有良好的应用前景。
1、双水相萃取技术的简介
与传统的分离技术相比，双水相技术作为一种新型的分离技术，因其体积小，处理能力强，成相时间短，适合大规模化操作等特点，已经越来越受到人们的重视。
Beijeronck 在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象。双水相萃取(Aqueous two-phase extraction, ATPE) 技术真正应用是在20世纪60年代，1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson 将双水相体系成功用于分离叶绿素，这解决了蛋白质变性和沉淀的问题[1]。1979年德国Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离，为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础[2]。迄今为止看，双水相萃取技术已被成功应用于生物工程、药物提取、金属离子分离等方面。尽管其已发展成为一种相对比较成熟的技术，但仍然有值得深入研究与完善的方面。作者在此主要介绍了双水相萃取的基本要点及应用特点，综述了双水相萃取技术在生物工程、药物成分提取分离等方面的应用。
2、双水相萃取技术的原理
2.1双水相体系的形成
当一定浓度的某种有机物水溶液与其它有机物水溶液, 或者有机物水溶液与无机盐水溶液以一定体积比混合时, 能够自然分相并形成互不相溶的双水相或者多水相体系, 这就是双水相体系。从溶液理论来说, 当2种有机物或者有机物与无机盐混合时, 是分相还是混合成一相, 取决于混合时的熵变和分子间的相互作用力。由于双水相体系本身的复杂性, 体系的熵很难准确计算, 分子间的相互作用力也不清楚, 所以双水相的形成机理很复杂。
对于高聚物/ 高聚物双水相体系[4], 用传统的理论来解释, 是由于界面张力等因素形成两相之间的不对称, 使得在空间上产生阻隔效应, 使两相之间无法相
互渗透, 不能形成均一相, 从而具有分离倾向, 一般这种分离倾向的大小和形成双水相的2种物质的疏水性成线性关系。对于有无机盐存在的双水相体系, 以及新开发的表面活性剂双水相体系, 这种解释就无能为力了。表1是各种双水相体系的成相原理。
表1 双水相体系的分类以及成相原理
双水相体系的种类
高聚物/ 高聚物
高聚物/ 无机盐
低分子有机物/无机盐
表面活性剂双水相[5]
2.2双水相萃取的基本原理
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的原理相似, 都是依据物质在两相间的选择性分配[3]。当萃取体系的性质不同, 物质进入双水相体系后, 由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的浓度不同, 从而达到分离的目的。溶质(包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等) 在双水相体系中服从Nernst 分配定律: K= Ct/ Cb. 其中Ct 、Cb 分别代表溶质在上相、下相中的浓度。
系统固定时, 分配系数为一常数, 与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后, 在上相和下相间进行选择性分配, 这种分配关系与常规的萃取分配关系相比, 表现出更大或更小的分配系数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0101, 因此为物质分离提供了可能。
2.3双水相萃取体系的特点
(1)整个体系的含水量高(70%～90%)。(2)单级分离提纯效率高。(3)传质速率快, 分相时间短。(4)操作条件温和, 所需设备简单。(5)过程易于放大和进行连续化操作。(6)不存在有机溶剂残留问题。(7)双水相萃取处理容量大, 能耗低。
2.4影响物质分配平衡的因素
影响物质在双水相体系中分配的因素有很多, 其中主要包括体系有机相组成(如有机物的类型、平均分子量等) 、盐类(包括离子类型和浓度、电荷数、电解质成相基本原理 空间上产生的空间阻隔效应 盐析作用 盐相、有机相与水分子缔合竞争 胶束平衡共存的结果
强度、酸碱性等) 、相比R [6] (上下相的体积比) 、溶质即目标物质的物理化学性质(包括分子量, 等电点), 以及体系的温度、压力等。而这些参数并不是独立起作用的, 所以要预测双水相体系间的分配系数是相当困难的。目前最常用的方法是用试验的方法来确定满足分配要求的操作条件。
3、双水相萃取技术的应用
3. 1 生物工程技术中物质的提取与纯化
双水相萃取技术最先应用的领域是生物产品的分离，目前，双水相萃取技术已应用于蛋白质、生物酶、菌体、细胞以及氨基酸、抗生素等生物小分子物质的分离、纯化。朱自强[7]等用PEG2000 8%(质量分数) 、(NH4) 2SO 4 20%(质量分数) 在pH=5. 0，20 ℃时直接处理青霉素G 发酵液，得出分配系数K=58. 39，浓缩倍数为3. 53，回收率为93. 67%，青霉素G 对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因子分别为13. 36和21. 9。在此基础上，再安排了青霉素G 的实验小试流程，得到了青霉素G 的结晶，纯度为88. 48%，总收率达76. 56%。 Babu [10]等用18%的PEG1500与14%的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取菠萝蛋白酶和多酚氧化酶, 菠萝蛋白的纯化倍数为410, 酶活回收率达到228%,而多酚氧化酶的纯化倍数为2107, 酶活回收率达到90%。Chethana [11]等用PEG6000 与(NH4) 2SO 4组成的双水相从甜菜根中萃取甜菜色素,70%～75%甜菜色素被萃取到上相,90%以上的糖类被萃取到下相。
3.2药物及其有效成分的分离与提取
双水相萃取技术在医药工业中的应用主要表现在药物及其有效成分的分离与提取。如可用于天然植物药用有效成分的分离与提取，具有代表性的工作是对黄芩苷和黄芩素的分离。黄芩苷是黄芩的主要有效成分，用PEG6000- K 2HPO 4-水的双水相系统对黄芩苷和黄芩素进行分配实验，由于黄芩苷和黄芩素都有一定的憎水性，被主要分配在富含PEG 的上相，两种物质的分配系数最大可达到30和35，若能通过一定的手段去掉溶液中的PEG ，则经浓缩结晶后可得到黄芩苷和黄芩素产品。
3.3金属离子的测定与分离
除了传统的用于生物分离领域外，双水相萃取还可用于其它一些领域，如测定金属离子的含量及实现金属离子的分离。在聚乙二醇2000/ 硫酸按/ 偶氮胂( Ⅲ) 双水相体系中，实现了Ti( Ⅳ) 与Zr( Ⅳ) 的分离；在聚乙二醇2000/硫酸钠/ 硫氰酸
钾双水相体系中，实现了Co( Ⅱ) 、Ni(Ⅱ) 、Mo( Ⅵ) 等金属离子的定量分离。在聚乙二醇/ 硫酸钠双水相体系中，实现了从碱性氰化液中萃取分离金。在溴化钾/ 乙醇/ 硫酸铵双水相体系中，实现了AuB 与AlB 、NiA 、MnA 、CrB 、CoA 、FeB 、ZnA 、CuA 、MoE 、UC 的分离。
3.4在发酵工程中的应用
由于发酵液中成分比较复杂，目标产物含量低，而传统的分离纯化方法步骤繁琐, 导致产品回收率低，成本居高不下。目前国内外已经有利用双水相体系从发酵液萃取分离目标产物的报道和研究，并取得了一些成绩。Pan [9]等利用PEG1500/ NaH2PO 4 体系从Trichoderma koningii 发酵液中分离纯化β-木糖苷酶, 该酶主要分配在下相, 下相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。
4、双水相萃取技术的评价
双水相萃取技术作为一种新型的分离技术, 可以利用不复杂的设备、并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分, 克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用, 在萃取过程中保持生物物质的活性及构象等明显的技术优势, 并且取得了一些阶段性的成果, 在生物工程、药物分析、金属分离等方面有着广阔的应用前景。然而, 有关双水相的应用和研究还不够, 一些技术难题还有待于解决。如: 易乳化、相分离时间长, 成相聚合物的成本较高, 水溶性高聚物大多数粘度较大, 不易定量控制; 水溶性的高聚物难以挥发, 使反萃必不可少, 高聚物回收困难等等。
今后, 随着对双水相体系研究的深入, 以及其他双水相体系的不断开发, 例如离子液体双水相体系, 其形成机理, 热力学模型、动力学模型以及工艺技术等方面的问题最终会被突破和解决, 其应用领域将进一步拓宽, 双水相萃取将会成为一种优良的分离技术。
目前, 双水相萃取技术已被用于众多生物产品的分离提纯, 并显示出众多其他分离技术不具备的优点, 是一种应用前景广阔的新型生物分离技术。但是, 要将这一技术开发应用到大规模生产过程, 还有许多理论和实践方面的技术问题有待解决。主要表现在如下几个方面:
(1)聚合物/ 聚合物构成的双水相体系具有良好的分离性能, 但用于构造双水相体系的成相聚合物的价格都比较昂贵, 对于一般的生物产品, 分离成本过高,
在经济上是不合理的。
(2) 虽然通过选择适宜的双水相体系和操作条件, 可获得被分离物质在两相间较大的分配系数和较高的纯化倍数, 但目标产物与成相物质的分离比较困难。
(3)双水相体系界面张力较小, 虽有利于提高传质效率, 但是较小的界面张力易导致乳化现象的产生, 使相分离时间延长, 分离效率降低。
(4)双水相体系中组分间的作用非常复杂, 目前没有建立一套较为完整的理论和方法解释和预测物质在双水相体系中的相行为和被分配物质在两相中的分配行为。
(5)缺乏对双水相过程的工程放大及设备方面的研究, 在体系流体力学, 相际间的传质, 传递过程方面研究很少。研究的方法基本上还是通过实验的方法, 研究的结果只是建立在实验的基础上, 大部分情况下不能外延, 缺乏对过程规律的认识。
(6)对双水相萃取工艺整体的集成优化研究还不足, 对分离过程中产生的大量含成相物质的稀溶液, 还没有找到一条科学合理的利用及处理途径, 大量含盐或含成相组分的废水溶液难以回收及处理。
生物技术的发展, 必将促进双水相萃取体系的完善, 包括新萃取体系的开发、工艺优化、萃取剂回收、体系分相技术、萃取设备和基础理论研究等, 从而更显示出双水相分离技术在生物物质分离的独特优点。
参考文献：
[1] Anita Jain, Johri B N. Partitioning of an extracellular xylanase produced by a therm ophilic fungus Melanocarp us albomyces IIS 68 in an aqueous two-phase system[J]. Biore source Technology,1999, 67(2): 205207.
[2] Zijlstra Gerben M, de Gooijer Cornelis D, T ramper Johannes. ExTractive bioconversions in a queous two-phase systems[J]. CurrentOpinionin Biotechnology , 1998, 9(2): 171176.
[3] 郑楠, 刘杰. 双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究[J]. 化学与生物工程, 2006, 23(10): 7—9.
[4] 谭平华, 林金清, 肖春妹, 等. 双水相萃取技术研究进展及应用[J]. 化工生产与技术,2003, 10( 1) :19225.
[5]朱慎林, 朴香兰, 沈刚. 表面活性剂萃取分离氨基酸的研究[J]. 化学工程,2006,34( 3) :426.
[6]修志龙, 姜伟, 苏志国. 用聚乙二醇沉淀法清除细胞碎片[ J] . 化工学报, 1993,44(6): 7572760.
[7] 李勉, 朱自强, 梅乐和. 聚合物2聚合物双水相系统相平衡的计算[ J] . 化学工程,1996, 24(2): 60264.
[8] Pan I H, Y ao HJ ,Li YK. Effective exraction and purification of xylosidase from trichoderma koningii fermentation culture by aqueous two-phase partitioning[J ]. Enzyme and Microbial Technology. 2001, (28) :196～201.
[9] 王雯娟. 双水相萃取菠萝蛋白酶的研究[D]. 广西:广西大学化学化工学院,2004, (5～6) :14～15.
[10] Babu BR, Rastogi NK, Raghavarao KSMS1Liquid liquid extraction of bromelain and polypHenol oxidase using aqueous two-phase system[J] 1 Chemical Engineering andProcessing,2008,47:83289.
[11] Chethana S, NayakCA, et al1 Aqueous two phase extraction for purification and concentration of betalains [J] .Journal of Food Engineering, 2007, 81:67926871