基因重组技术
工具酶
Cohen and his colleagues completed the first gene recombinant experiment in 1973. Hybrid DNA obtained by gene recombination and transformation in vitro was transformed into E.coli in vitro. Necessary material ：endonuclease Ligase Vector host cells
Gene cloning （molecular cloning）
----通过体外重组技术, 将一段目的DNA 经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。
基因克隆的核心-----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA 插入一个载体的过程。
限制酶的特点
（a ）识别顺序和酶切位点 识别４-8个相连的核苷酸； 呈回文结构； 对称性；
切点大多数在识别顺序之内，也有例外。
限制酶切后产生两个末端，５’-Ｐ和３’-ＯＨ
相容性末端: 可连接在一起。如：BamHI （ＧＧＡＴＣＣ）与MboI （ＮＧＡＴＣＮ）酶切产生的末端，相连后MboI 仍可识别，但BamHI 的识别只有十六分之一的可能性。
又如: BamHI 和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。 （b ）末端种类
Three kind terminals after digested by endonucleases a) 5’projected stick terminal （突出的粘性末端） For example, EcoR I 5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’ b) 3’ projected stick terminal（突出的粘性末端） For example, Pst I 5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’ c) Blunted terminal (平末端)
For example, Sma I 5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5 异源同序酶 (isoschizomer，同裂酶 )
定义：能识别相同顺序但来源不同的两种限制性内切酶。 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同，如Asp718--KpnI ；
SacI —SstI
(6) 限制酶的星号反应活性（star activity） (a)特点: 限制酶识别序列特异性降低 (b)发生星反应的限制酶和条件 (c)星反应的利用和避免
同裂酶（Isoschizomers ):是指来源不同的核酸内切酶，识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，这类酶称～。
同尾酶 ( Isocaudamers ) :是指识别核酸序列不同，但有相关序列，切割的粘端序列相同
远距离裂解酶 (Distant cleavage) :识别位点与切割位点不一致，但其切割位点与识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。 如：Mbo II 的识别序列为5‘-GAAGA-3’切割位点在识别位点下游第8个核苷酸。 可变酶：识别序列中有几个核苷酸是可变的，识别序列通常大于6个碱基对。 λ-Terminase 是识别λ-噬菌体DNA 的cos 序列 (100 bp)，并形成附带12 base的5'-末端的用以切断双链DNA 的酶, 出现的频率约412 。
本酶能够有效地切断cos 序列。因此，不仅能够用于Cosmid mapping，还能作为cos 序列特异性的限制酶使用。 Omega 核酸酶（I-SceI ）：由内含子编码，用于rRNA 的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp
限制性内切酶的用途 a.DNA 重组
b. 限制酶（物理）图谱绘制 c. 突变分析（RFLP 分析）
d. 限制酶的部分酶切与完全酶切 2. DNA甲基化酶 Methylase (1) 甲基化酶的种类与识别顺序
a. 限制修饰系统I 、II 、III 型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA 分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA 重组实验中，常用的甲基化酶属于II 型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。 b. E．coli 的dam 、dcm 甲基化酶
这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。 dam G mATC， dcm C mCA/TGG c. 哺乳动物的甲基化酶
该酶可使CG 中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA 复制、基因转录等过程有关。
d. E．coli 中依赖于甲基化的限制修饰系统 mrr （mA/A）、mcrAm5CG 、merB （Pum5C ） (2)甲基化酶活性对限制酶活性的影响 a. dcm 和dam 甲基化酶对限制酶的影响
抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识 别顺序是完全重叠还是边界重叠
如：完全重叠 BclI--dam ； ScrFI--dcm
边界重叠 ClaI--dam ； Sau96I--dcm
不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠。 如： dam--BamHI ，Sau3AI ，BglII ，PvuI ； dcm--BstNI b. II型甲基化酶对限制酶活性的影响
*下横线字母表示限制酶识别序列, 蓝色字母表示dam 甲基化酶识别序列, 红色字母表示dcm 甲基化酶识别序列
（a ）RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min 仍具活性）, 用于除去DNA 样品中的RNA 分子。
（b ）核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA 敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA 。 （10）RNase H
作用于DNA-RNA 杂交分子中的RNA 链，用于cDNA 文库建立时除去DNA 链以便第二条链cDNA 链的合成。
（11）DNase I
（a ）特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P 低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值
当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 4 DNA聚合酶 DNA Polymerase
（1）E.coli DNA聚合酶I （polymerase I） （a ）E.coli 的DNA 聚合酶系统
Pol I参与DNA 修复 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 pol II同上 具3’→5’外切酶活性
pol III参与DNA 复制 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 （b ）E.coli polI的特点
具两种外切酶活性和DNA 聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow 片段, polIK) （b ） 用途：
（1）将双链DNA 的末端转化成平端； （2）标记用作探针的DNA 片断；
（3）对带有3’凸出端或平端DNA 分子进行末端标记，分两步进行；
（4）补平或标记限制性内切酶消化DNA 所产生的3’凹末端；必须在高浓度的4dNTP 存在下，抑制3’→5’外切酶活性； RNA 聚合酶
（1）SP6 RNA聚合酶 和 T7 RNA聚合酶
（a ）特点：依赖于DNA 的RNA 聚合酶，具SP6启动子特异型
（b ）用途：主要用于RNA 分子的体外合成，合成的RNA 分子可用于： ※RNA 分子的拼接研究
※标记的RNA 常用于杂交，RNA-DNA 比DNA-DNA 分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA 具高放射比活性
※基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置 ※还可以用于蛋白质的合成研究 （3）T3 RNA聚合酶 （4）E.coli RNA聚合酶 连接酶 Ligase
（1）T4 DNA连接酶
（a ）特点：只连接ds -DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基团。 （b ）用途：用于不同DNA 分子的连接，形成重组DNA 分子 ※相同或相容粘性末端的连接 ※平整末端的相连
※ DNA 平端来源：限制酶作用结果; 限制酶与其它酶共同作用结果 ※平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多 ※抑制剂PO43->5mM, NaCl>25mM, Ca++>0.1mM （2）E.coli DNA连接酶
只能连接具粘性末端DNA 分子，以NAD 作辅助因子
（3） T4 RNA连接酶
※参与单链RNA 分子的连接
※主要用于提高T4 DNA连接酶在连接反应中的连接效率（20倍）
基因重组技术
工具酶
Cohen and his colleagues completed the first gene recombinant experiment in 1973. Hybrid DNA obtained by gene recombination and transformation in vitro was transformed into E.coli in vitro. Necessary material ：endonuclease Ligase Vector host cells
Gene cloning （molecular cloning）
----通过体外重组技术, 将一段目的DNA 经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。
基因克隆的核心-----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA 插入一个载体的过程。
限制酶的特点
（a ）识别顺序和酶切位点 识别４-8个相连的核苷酸； 呈回文结构； 对称性；
切点大多数在识别顺序之内，也有例外。
限制酶切后产生两个末端，５’-Ｐ和３’-ＯＨ
相容性末端: 可连接在一起。如：BamHI （ＧＧＡＴＣＣ）与MboI （ＮＧＡＴＣＮ）酶切产生的末端，相连后MboI 仍可识别，但BamHI 的识别只有十六分之一的可能性。
又如: BamHI 和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。 （b ）末端种类
Three kind terminals after digested by endonucleases a) 5’projected stick terminal （突出的粘性末端） For example, EcoR I 5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’ b) 3’ projected stick terminal（突出的粘性末端） For example, Pst I 5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’ c) Blunted terminal (平末端)
For example, Sma I 5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5 异源同序酶 (isoschizomer，同裂酶 )
定义：能识别相同顺序但来源不同的两种限制性内切酶。 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同，如Asp718--KpnI ；
SacI —SstI
(6) 限制酶的星号反应活性（star activity） (a)特点: 限制酶识别序列特异性降低 (b)发生星反应的限制酶和条件 (c)星反应的利用和避免
同裂酶（Isoschizomers ):是指来源不同的核酸内切酶，识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，这类酶称～。
同尾酶 ( Isocaudamers ) :是指识别核酸序列不同，但有相关序列，切割的粘端序列相同
远距离裂解酶 (Distant cleavage) :识别位点与切割位点不一致，但其切割位点与识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。 如：Mbo II 的识别序列为5‘-GAAGA-3’切割位点在识别位点下游第8个核苷酸。 可变酶：识别序列中有几个核苷酸是可变的，识别序列通常大于6个碱基对。 λ-Terminase 是识别λ-噬菌体DNA 的cos 序列 (100 bp)，并形成附带12 base的5'-末端的用以切断双链DNA 的酶, 出现的频率约412 。
本酶能够有效地切断cos 序列。因此，不仅能够用于Cosmid mapping，还能作为cos 序列特异性的限制酶使用。 Omega 核酸酶（I-SceI ）：由内含子编码，用于rRNA 的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp
限制性内切酶的用途 a.DNA 重组
b. 限制酶（物理）图谱绘制 c. 突变分析（RFLP 分析）
d. 限制酶的部分酶切与完全酶切 2. DNA甲基化酶 Methylase (1) 甲基化酶的种类与识别顺序
a. 限制修饰系统I 、II 、III 型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA 分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA 重组实验中，常用的甲基化酶属于II 型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。 b. E．coli 的dam 、dcm 甲基化酶
这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。 dam G mATC， dcm C mCA/TGG c. 哺乳动物的甲基化酶
该酶可使CG 中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA 复制、基因转录等过程有关。
d. E．coli 中依赖于甲基化的限制修饰系统 mrr （mA/A）、mcrAm5CG 、merB （Pum5C ） (2)甲基化酶活性对限制酶活性的影响 a. dcm 和dam 甲基化酶对限制酶的影响
抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识 别顺序是完全重叠还是边界重叠
如：完全重叠 BclI--dam ； ScrFI--dcm
边界重叠 ClaI--dam ； Sau96I--dcm
不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠。 如： dam--BamHI ，Sau3AI ，BglII ，PvuI ； dcm--BstNI b. II型甲基化酶对限制酶活性的影响
*下横线字母表示限制酶识别序列, 蓝色字母表示dam 甲基化酶识别序列, 红色字母表示dcm 甲基化酶识别序列
（a ）RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min 仍具活性）, 用于除去DNA 样品中的RNA 分子。
（b ）核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA 敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA 。 （10）RNase H
作用于DNA-RNA 杂交分子中的RNA 链，用于cDNA 文库建立时除去DNA 链以便第二条链cDNA 链的合成。
（11）DNase I
（a ）特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P 低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值
当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 4 DNA聚合酶 DNA Polymerase
（1）E.coli DNA聚合酶I （polymerase I） （a ）E.coli 的DNA 聚合酶系统
Pol I参与DNA 修复 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 pol II同上 具3’→5’外切酶活性
pol III参与DNA 复制 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 （b ）E.coli polI的特点
具两种外切酶活性和DNA 聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow 片段, polIK) （b ） 用途：
（1）将双链DNA 的末端转化成平端； （2）标记用作探针的DNA 片断；
（3）对带有3’凸出端或平端DNA 分子进行末端标记，分两步进行；
（4）补平或标记限制性内切酶消化DNA 所产生的3’凹末端；必须在高浓度的4dNTP 存在下，抑制3’→5’外切酶活性； RNA 聚合酶
（1）SP6 RNA聚合酶 和 T7 RNA聚合酶
（a ）特点：依赖于DNA 的RNA 聚合酶，具SP6启动子特异型
（b ）用途：主要用于RNA 分子的体外合成，合成的RNA 分子可用于： ※RNA 分子的拼接研究
※标记的RNA 常用于杂交，RNA-DNA 比DNA-DNA 分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA 具高放射比活性
※基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置 ※还可以用于蛋白质的合成研究 （3）T3 RNA聚合酶 （4）E.coli RNA聚合酶 连接酶 Ligase
（1）T4 DNA连接酶
（a ）特点：只连接ds -DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基团。 （b ）用途：用于不同DNA 分子的连接，形成重组DNA 分子 ※相同或相容粘性末端的连接 ※平整末端的相连
※ DNA 平端来源：限制酶作用结果; 限制酶与其它酶共同作用结果 ※平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多 ※抑制剂PO43->5mM, NaCl>25mM, Ca++>0.1mM （2）E.coli DNA连接酶
只能连接具粘性末端DNA 分子，以NAD 作辅助因子
（3） T4 RNA连接酶
※参与单链RNA 分子的连接
※主要用于提高T4 DNA连接酶在连接反应中的连接效率（20倍）