・193・
・综述・
基因打靶技术及其发展和应用
窦薇
摘要 通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点的基因打靶技术, 已经成为哺乳动物遗传学领域的重要工具。本文拟针对胚胎干细胞和体细胞的基因打靶的原理、技术路线及基因打靶技术的发展和应用作一综述。
关键词 基因打靶; 同源重组; 基因组; 胚胎干细胞; 体细胞
基因打靶技术是20世纪80年代后兴起的
[1～3]
]
, 、产生重组, 并在受体细胞染色体上形成有活性的基因的过程
[4]
本文拟针对胚胎干细胞和体细胞的基因打靶的原理、技术路线及进展作一综述。1 胚胎干细胞基因打靶
。基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点用于胚胎干细胞基因打靶的靶细胞目前最常用的是小鼠ES 细胞。首先是设计合成一个将要导入
ES 细胞的打靶载体(targeting vector ) , 该载体不仅含有需要插入的DNA 序列, 其两端还含有与靶基因位点上的序列相同的核甘酸片段, 将此载体用转基因技术导入靶细胞, 通过外源载体与内源靶位点相同的核甘酸顺序间的同源重组, 使外源DNA 序列定点整合到靶细胞的特定基因位点上, 从而达到对靶位点进行定点修复或定点突变的目的选择策略
[18,19]
[17]
整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术
[5]
。它克服了随机整合的盲目性和危险性, 是一
种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立, 使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确
[6,7]
, 它的发展将为发育生物学、分子
。为了便于
遗传学、免疫学及医学等学科提供一个全新的研究手段; 它的应用涉及基因功能的研究、生产具有商业价值的转基因动物和植物、异体动物器官移植和人类疾病的基因治疗等诸多方面
[8]
筛选重组阳性的细胞克隆, 目前普遍采用正负双向
, 即打靶载体上同时携带正选择基因
r r
(如G 418r ) 和负选择基因(如G ANC 、Hygro 等) , 当
。
发生定点整合(同源重组) 时, 同源臂外侧的负向选择基因被切离, 同源臂之间的正向选择基因整合入基因组, 表现型为G 418ΠG ANC ; 当随机整合时, 正
r
r
目前, 基因打靶技术在鼠胚胎干细胞(embry onic
[9,10]
stem cells ,ESCs ) 中的应用已经很成熟。由于高等牲畜的胚胎干细胞难以分离和培养靶可以用体细胞来代替
[12]
[11]
, 其基因打
向和负向选择基因都插入到基因组内,
表现型为G 418ΠG ANC 。将筛选出的已发生定点整合的ES 细
r
s
, 然后用核移植技术和胚
[13,14]
胎克隆技术来产生转基因牲畜。由于对人类胚
[15]
胞用显微注射方法导入着床前的宿主囊胚的内细胞团, 再将此胚胎移植到假孕母鼠的子宫内, 就可得到由供体ES 细胞和受体ES 细胞共同发育成的子代嵌合体小鼠。发生了定点突变或修复的供体ES 细胞既可能发育成嵌合体的体细胞, 也可能发育成嵌合体的生殖系。如果供体ES 细胞发育成嵌合体的生殖系, 通过嵌合体间的杂交, 就可获得某一基因发生了定点突变或修复的纯合子, 即双等位基因突变
胎干细胞的研究始终是一个敏感而审慎的课题,
所以基于基因治疗为目的的人类细胞的基因打靶也可用病人体细胞来取代, 以生产转基因动物的方式
基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(N o.
2001C B509904) ; 上海市科委发展基金项目(N o. 010J14003)
作者单位:200092, 上海第二医科大学发育生物学研究中心通讯作者:窦薇(e 2mail :douwei123456@Yahoo. com. cn )
・194・
(gene mutation ) 动物或敲除(gene knockout ) 动物[13]。2 体细胞基因打靶
白的作用与RecE 和RecT 蛋白类似。其中Ex o 蛋白是一种5′23′核酸外切酶, 作用于线性DNA 双链的5′端而产生3′突出末端, 而Bet 蛋白可以与3′突出末端结合并促进其与细胞内DNA 链的互补结合, 从而
实现基因重组。细菌噬菌体λ还可编码一种G am 蛋白, G am 蛋白的表达可抑制E . coli 内的RecBC D 活性。并且这种缺陷型λ噬菌体还可整合进E . coli 染色体, 其所携带的与重组有关的基因表达受一种温度敏感型的c1857抑制子(c1857repress or ) 的控制。32℃时, 和G am 蛋白的表达42℃时, 这3种蛋白, 从而极大地提高了发. coli 细胞内的重组频率。近年来, 这种缺陷型λ噬菌体重组系统主要用于对转入细胞内的质粒、细菌人工染色体(bacterial artificial chrom os omes , BACs ) 或噬菌体人工染色体(phage bacterial chrom o 2s omes ,PACs ) 核酸序列进行修饰和改造, 以获得理想
对于大型哺乳动物(如牲畜) , 始终未能获得能够进入生殖系并稳定遗传的ES 细胞限制起来
[15]
[13]
, 而对人类
ES 细胞的基因打靶研究也受到伦理、取材等方面的
, 在此背景下体细胞基因打靶技术得以发展
[20,21]
。首先也要设计合成一个将要导入体细胞
的打靶载体, 对该打靶载体的要求与ES 细胞基因打靶载体类似。将此载体导入受体细胞, 通过正负双向选择系统对打靶阳性的体细胞克隆进行筛选, 将筛选出的只发生了一次同源重组(中的一个发生了定点突变或修复) 移植到去核卵母细胞的细胞质中, 并继续发育成囊胚。可以将囊胚移植到受体动物的子宫内并诞生出某一基因发生改变的转基因动物
[22～24]
; 也可以在体
的用于真核细胞基因打靶的载体
[26,27]
。以往的基因
外分离出囊胚的ES 细胞, 并对ES 细胞进行诱导分化, 获得能够用来做移植治疗的体细胞, 并将此类体细胞输入供核动物体内, 达到基因治疗的目的。由于这类体细胞与供核动物的基因型完全相同, 就不会存在免疫排斥作用, 极大地提高了移植治疗的成功性。
3 基因打靶技术的发展及复杂调控
打靶对生物基因组的修饰缺乏可控性, 而最近几年发展起来的条件性基因打靶, 由于其对生物基因组的修饰在时间和空间上的可调控性而获得了广泛应用。它实际上是在常规基因打靶的基础上, 利用重组酶介导的位点特异性重组技术
[28～30]
。常见的重
组酶(recombinase ) 有Cre 和Flpe , 它们的识别位点分别是loxP 和FRT 核酸序列。通过在靶基因序列的两侧装上两个同向排列的loxP 或FRP 序列, 之后经过导入Cre 或Flpe 重组酶, 介导靶基因两侧的两个loxP 或FRT 位点发生重组, 结果将靶基因和其中的
基因打靶技术最先是在酵母细胞中发展起来的
[25]
, 由于对酵母菌的遗传操作较为繁琐, 后来发
掘出线性双链DNA 核酸外切酶(liner 2dsDNA ex onu 2clease, RecBC D ) 缺陷型的大肠杆菌菌株(E . coli strains ) , 使基因打靶功能在E . coli 细胞中得以实
一个loxP 或FRT 序列切除。这样, 靶基因的修饰(切除) 是以重组酶(Cre 或Flpe ) 的表达为前提的。
现。尽管某些RecBC D 突变型菌株同时具有重组酶(RecA ) 遗传背景, 但是其在抵抗外源DNA 的入侵方面具有明显缺陷, 从而阻碍了其重组功能。1988年, 法国科学家发明了一种Rac 2encoded RecET 系统, 通过激活两种蛋白RecE 和RecT 的表达以促进
E . coli 细胞内的同源重组, 但该系统同样需要在
重组酶在哪一种组织细胞中表达, 靶基因的修饰(切除) 就发生在哪种组织细胞, 所以只要控制重组酶的表达特异性就可实现对靶基因修饰的特异性。4 基因打靶技术的应用和展望
基因打靶技术具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA 稳定遗传的特点, 它是一种理想的修饰改造生物遗传物质的方法。这项新的技术无论在基础理论研究领域还是在实际应用中都有着美好而广阔的前景。如果说基因工程技术是20世纪生命科学领域的一个重大突破, 基因打靶技术则是其在应用领域的另一重大飞跃。这项技术使人们有可能
RecBC D 缺陷型E . coli 细胞株内进行。为了实现高
效的基因重组, 最近几年一种缺陷型λ噬菌体(de 2
fective λprophage ) 系统发展起来。细菌噬菌体λ(bacteriophage λ) 携带red 基因,red 基因的表达产物
是与重组密切相关的两种蛋白Ex o 和Bet , 这两种蛋
・195・
真正地按自己的设想去改造生物的遗传物质, 且使改造后的遗传物质能稳定遗传。一些复杂的生命现象如发育的分子机制有望通过此技术得以解答。人们可以利用这一技术创造出更多有利于人类的新品种
[31]
15W ertz DC. Embry o and stem cell research in the United S tates :history
and politics. G ene Therapy , 2002,9(11) :6742678.
16P orter AC , Itzhaki J E. G ene targeting in human s omatic cells :com plete
inactivation of an interferon 2inducible gene. Eur J Biochem , 1993,218(2) :2732281.
17Thomas K R , Deng C , Capecchi MR. H igh 2fidelity gene targeting in em 2bry onic stem cells by using sequence replacement vectors. M ol Cell Biol , 1992,12:291922923.
18H orie K, Nishiguchi S , M aeda S , et al. S tructures of replacement vec 2tors for efficient gene targeting. J Biochem , 1994,115:4772485. 19Sedivy JM , Sharp PA. P ositive selection for gene disruption in
mammalian by hom olog Proc Natl Acad Sci US A , ,862231.
, 还可通过这一技术了解一些疾病的分子机
制, 并解决某些遗传病的治疗问题。正如上世纪60年代PCR 技术的发明至今仍在分子生物学领域发挥着巨大作用一样, 基因打靶技术的诞生也将为人类探求生命的本质提供强有力的工具。
参 考 文 献
1 Thomas K R , Capecchi MR. S ite 2directed mutagenesis by gene targeting
in m ouse embry o 2derived stem cells. Cell , 1987,51:50322 D oetschman T , G regg RG, M aeda N , et al. T of a 2tant HPRT gene in m ouse ,330:5762578.
3 K oller BH , Smithies O. the beta 22microglobin locus in
m ouse embry onic stem cells by hom olog ous recombination. Proc Natl Acad Sci US A , 1989,86:893228935.
4 M ans our S L , Thomas K R , Deng C , et al. Introduction of a lacZ reporter
gene into the m ouse int 22locus by hom olog ous recombination. Proc Natl Acad Sci US A , 1990,87:768827692.
5 Capecchi MR. T argeted gene replacement. Scientific American , 1994,
270(3) :52259.
6 Orban PC , Chui D , M arth JD. T issue and site 2specific DNA recombina 2tion in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci US A , 1992,89:686126865. 7 Laks o M ,Pichel J G, G orman JR , et al. E fficient in viv o manipulation of
m ouse enomic sequences at the zyg ote stage. Proc Natl Acad Sci US A , 1996,93:586025865.
8 Thoms on A J , M cwhir J. Biomedical and agricultural applications of ani 2mal transgenesis. M ol Biotechnol , 2004,27(3) :2312244.
9 S oudais C , Bielinska M , Heikinheim o M , et al. T argeted mutagenesis of
the transcription factor G AT A 24gene in m ouse embry onic stem cells dis 2rupts visceral endoderm differentiation in vitro. Development , 1995,121:387723888.
10Smih F , R ouet P , R omanienko P J , et al. D ouble 2strand breaks at the
target locus stimulate gene targeting in embry onic stem cells. Nucleic Ac 2ids Res , 1995,23:501225019.
11Piedrahita JA. G ene targeting in domestic species :a new beginning.
T ransgenic Res , 2000,9(425) :2612262.
12S ikorski R , Peters R. T ransgenics on the internet. Nature Biotech ,
1997,15:289.
13Clark A J , Burl S , Denning C , et al. G ene targeting in livestock :a Pre 2view. T ransgenic Research , 2000,9(425) :2632275.
14Dinnyes A , De SP , K ing T , et al. S omatic cell nuclear trans fer :Recent
progress and challenges. Cloning S tem Cell , 2002,4(1) :81290.
J G targeting in human s omatic cells :com plete
interferon 2inducible gene. Eur J Biochem , 1993,2(8) :2732281.
21G ong M , R ong Y S. T argeting multi 2cellular organisms. Current opinion
in G enetics &Development , 2003,13(2) :2152220.
22W olf E , Schernthaner W , Z akhartchenko V , et al. T ransgenic technology
in farm animals 2progress and perspectives. Exp Physiol , 2000,85(6) :6152625.
23Phelps C J , K oike C , Vaught T D , et al. Production of
trans ferase deficient pigs. Science , 2003,299:4112414.
24M cCreath K J , H owcroft J , Cam pbell K HS , et al. Production of gene 2tar 2geted sheep by nuclear trans fer from cultured s omatic cells. Nature , 2000,405:106621069.
25Y u DG, E llis H M , Lee EC , et al. An efficient recombination system for
chrom os ome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci US A , 2000,97:597825983.
26Liu PT , Jenkins NA , C opeland NA. highly efficient recombineering 2
based method for generating conditional knockout mutations. G enome Re 2search , 2003,13:4762584.
27T ian Y, Li M , Fritzsch B , et al. Creation of a transgenic m ouse for hair 2cell gene targeting by using a m odified bacterial artificial chrom os ome containing Prestin. Dev Dyn , 2004,231(1) :1992203.
28Andreas S , Schwenk F ,
K uter 2Luks B , et al. Enhanced efficiency
through nuclear localization signal fusion on phage C312integrase :activity com paris on with Cre and F LPe recombinase in mammalian cells. Nucleic Acids Res , 2002,30:229922306.
29Frank AC , M eyers K A , W elsh LC , et al. Development of an enhanced
G FP 2based dual 2color reporter to facilitate genetic screens for the recovery of mutations in mice Proc Natl Acad Sci US A , 2003,100:[1**********]. 30K olb AF. G enome engineering using site 2specific recombinase. Cloning
S tem Cells , 2002,4(1) :65280.
31C opeland N J , Jenkins NA , C ourt D L. Recombineering :a powerful new
tool for m ouse functional genomics. Nature Review , 2001,2:7692779.
(收稿日期:2004210208)
1,32galactosyl 2
(本文编辑:孙岩伟)
・193・
・综述・
基因打靶技术及其发展和应用
窦薇
摘要 通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点的基因打靶技术, 已经成为哺乳动物遗传学领域的重要工具。本文拟针对胚胎干细胞和体细胞的基因打靶的原理、技术路线及基因打靶技术的发展和应用作一综述。
关键词 基因打靶; 同源重组; 基因组; 胚胎干细胞; 体细胞
基因打靶技术是20世纪80年代后兴起的
[1～3]
]
, 、产生重组, 并在受体细胞染色体上形成有活性的基因的过程
[4]
本文拟针对胚胎干细胞和体细胞的基因打靶的原理、技术路线及进展作一综述。1 胚胎干细胞基因打靶
。基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点用于胚胎干细胞基因打靶的靶细胞目前最常用的是小鼠ES 细胞。首先是设计合成一个将要导入
ES 细胞的打靶载体(targeting vector ) , 该载体不仅含有需要插入的DNA 序列, 其两端还含有与靶基因位点上的序列相同的核甘酸片段, 将此载体用转基因技术导入靶细胞, 通过外源载体与内源靶位点相同的核甘酸顺序间的同源重组, 使外源DNA 序列定点整合到靶细胞的特定基因位点上, 从而达到对靶位点进行定点修复或定点突变的目的选择策略
[18,19]
[17]
整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术
[5]
。它克服了随机整合的盲目性和危险性, 是一
种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立, 使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确
[6,7]
, 它的发展将为发育生物学、分子
。为了便于
遗传学、免疫学及医学等学科提供一个全新的研究手段; 它的应用涉及基因功能的研究、生产具有商业价值的转基因动物和植物、异体动物器官移植和人类疾病的基因治疗等诸多方面
[8]
筛选重组阳性的细胞克隆, 目前普遍采用正负双向
, 即打靶载体上同时携带正选择基因
r r
(如G 418r ) 和负选择基因(如G ANC 、Hygro 等) , 当
。
发生定点整合(同源重组) 时, 同源臂外侧的负向选择基因被切离, 同源臂之间的正向选择基因整合入基因组, 表现型为G 418ΠG ANC ; 当随机整合时, 正
r
r
目前, 基因打靶技术在鼠胚胎干细胞(embry onic
[9,10]
stem cells ,ESCs ) 中的应用已经很成熟。由于高等牲畜的胚胎干细胞难以分离和培养靶可以用体细胞来代替
[12]
[11]
, 其基因打
向和负向选择基因都插入到基因组内,
表现型为G 418ΠG ANC 。将筛选出的已发生定点整合的ES 细
r
s
, 然后用核移植技术和胚
[13,14]
胎克隆技术来产生转基因牲畜。由于对人类胚
[15]
胞用显微注射方法导入着床前的宿主囊胚的内细胞团, 再将此胚胎移植到假孕母鼠的子宫内, 就可得到由供体ES 细胞和受体ES 细胞共同发育成的子代嵌合体小鼠。发生了定点突变或修复的供体ES 细胞既可能发育成嵌合体的体细胞, 也可能发育成嵌合体的生殖系。如果供体ES 细胞发育成嵌合体的生殖系, 通过嵌合体间的杂交, 就可获得某一基因发生了定点突变或修复的纯合子, 即双等位基因突变
胎干细胞的研究始终是一个敏感而审慎的课题,
所以基于基因治疗为目的的人类细胞的基因打靶也可用病人体细胞来取代, 以生产转基因动物的方式
基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(N o.
2001C B509904) ; 上海市科委发展基金项目(N o. 010J14003)
作者单位:200092, 上海第二医科大学发育生物学研究中心通讯作者:窦薇(e 2mail :douwei123456@Yahoo. com. cn )
・194・
(gene mutation ) 动物或敲除(gene knockout ) 动物[13]。2 体细胞基因打靶
白的作用与RecE 和RecT 蛋白类似。其中Ex o 蛋白是一种5′23′核酸外切酶, 作用于线性DNA 双链的5′端而产生3′突出末端, 而Bet 蛋白可以与3′突出末端结合并促进其与细胞内DNA 链的互补结合, 从而
实现基因重组。细菌噬菌体λ还可编码一种G am 蛋白, G am 蛋白的表达可抑制E . coli 内的RecBC D 活性。并且这种缺陷型λ噬菌体还可整合进E . coli 染色体, 其所携带的与重组有关的基因表达受一种温度敏感型的c1857抑制子(c1857repress or ) 的控制。32℃时, 和G am 蛋白的表达42℃时, 这3种蛋白, 从而极大地提高了发. coli 细胞内的重组频率。近年来, 这种缺陷型λ噬菌体重组系统主要用于对转入细胞内的质粒、细菌人工染色体(bacterial artificial chrom os omes , BACs ) 或噬菌体人工染色体(phage bacterial chrom o 2s omes ,PACs ) 核酸序列进行修饰和改造, 以获得理想
对于大型哺乳动物(如牲畜) , 始终未能获得能够进入生殖系并稳定遗传的ES 细胞限制起来
[15]
[13]
, 而对人类
ES 细胞的基因打靶研究也受到伦理、取材等方面的
, 在此背景下体细胞基因打靶技术得以发展
[20,21]
。首先也要设计合成一个将要导入体细胞
的打靶载体, 对该打靶载体的要求与ES 细胞基因打靶载体类似。将此载体导入受体细胞, 通过正负双向选择系统对打靶阳性的体细胞克隆进行筛选, 将筛选出的只发生了一次同源重组(中的一个发生了定点突变或修复) 移植到去核卵母细胞的细胞质中, 并继续发育成囊胚。可以将囊胚移植到受体动物的子宫内并诞生出某一基因发生改变的转基因动物
[22～24]
; 也可以在体
的用于真核细胞基因打靶的载体
[26,27]
。以往的基因
外分离出囊胚的ES 细胞, 并对ES 细胞进行诱导分化, 获得能够用来做移植治疗的体细胞, 并将此类体细胞输入供核动物体内, 达到基因治疗的目的。由于这类体细胞与供核动物的基因型完全相同, 就不会存在免疫排斥作用, 极大地提高了移植治疗的成功性。
3 基因打靶技术的发展及复杂调控
打靶对生物基因组的修饰缺乏可控性, 而最近几年发展起来的条件性基因打靶, 由于其对生物基因组的修饰在时间和空间上的可调控性而获得了广泛应用。它实际上是在常规基因打靶的基础上, 利用重组酶介导的位点特异性重组技术
[28～30]
。常见的重
组酶(recombinase ) 有Cre 和Flpe , 它们的识别位点分别是loxP 和FRT 核酸序列。通过在靶基因序列的两侧装上两个同向排列的loxP 或FRP 序列, 之后经过导入Cre 或Flpe 重组酶, 介导靶基因两侧的两个loxP 或FRT 位点发生重组, 结果将靶基因和其中的
基因打靶技术最先是在酵母细胞中发展起来的
[25]
, 由于对酵母菌的遗传操作较为繁琐, 后来发
掘出线性双链DNA 核酸外切酶(liner 2dsDNA ex onu 2clease, RecBC D ) 缺陷型的大肠杆菌菌株(E . coli strains ) , 使基因打靶功能在E . coli 细胞中得以实
一个loxP 或FRT 序列切除。这样, 靶基因的修饰(切除) 是以重组酶(Cre 或Flpe ) 的表达为前提的。
现。尽管某些RecBC D 突变型菌株同时具有重组酶(RecA ) 遗传背景, 但是其在抵抗外源DNA 的入侵方面具有明显缺陷, 从而阻碍了其重组功能。1988年, 法国科学家发明了一种Rac 2encoded RecET 系统, 通过激活两种蛋白RecE 和RecT 的表达以促进
E . coli 细胞内的同源重组, 但该系统同样需要在
重组酶在哪一种组织细胞中表达, 靶基因的修饰(切除) 就发生在哪种组织细胞, 所以只要控制重组酶的表达特异性就可实现对靶基因修饰的特异性。4 基因打靶技术的应用和展望
基因打靶技术具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA 稳定遗传的特点, 它是一种理想的修饰改造生物遗传物质的方法。这项新的技术无论在基础理论研究领域还是在实际应用中都有着美好而广阔的前景。如果说基因工程技术是20世纪生命科学领域的一个重大突破, 基因打靶技术则是其在应用领域的另一重大飞跃。这项技术使人们有可能
RecBC D 缺陷型E . coli 细胞株内进行。为了实现高
效的基因重组, 最近几年一种缺陷型λ噬菌体(de 2
fective λprophage ) 系统发展起来。细菌噬菌体λ(bacteriophage λ) 携带red 基因,red 基因的表达产物
是与重组密切相关的两种蛋白Ex o 和Bet , 这两种蛋
・195・
真正地按自己的设想去改造生物的遗传物质, 且使改造后的遗传物质能稳定遗传。一些复杂的生命现象如发育的分子机制有望通过此技术得以解答。人们可以利用这一技术创造出更多有利于人类的新品种
[31]
15W ertz DC. Embry o and stem cell research in the United S tates :history
and politics. G ene Therapy , 2002,9(11) :6742678.
16P orter AC , Itzhaki J E. G ene targeting in human s omatic cells :com plete
inactivation of an interferon 2inducible gene. Eur J Biochem , 1993,218(2) :2732281.
17Thomas K R , Deng C , Capecchi MR. H igh 2fidelity gene targeting in em 2bry onic stem cells by using sequence replacement vectors. M ol Cell Biol , 1992,12:291922923.
18H orie K, Nishiguchi S , M aeda S , et al. S tructures of replacement vec 2tors for efficient gene targeting. J Biochem , 1994,115:4772485. 19Sedivy JM , Sharp PA. P ositive selection for gene disruption in
mammalian by hom olog Proc Natl Acad Sci US A , ,862231.
, 还可通过这一技术了解一些疾病的分子机
制, 并解决某些遗传病的治疗问题。正如上世纪60年代PCR 技术的发明至今仍在分子生物学领域发挥着巨大作用一样, 基因打靶技术的诞生也将为人类探求生命的本质提供强有力的工具。
参 考 文 献
1 Thomas K R , Capecchi MR. S ite 2directed mutagenesis by gene targeting
in m ouse embry o 2derived stem cells. Cell , 1987,51:50322 D oetschman T , G regg RG, M aeda N , et al. T of a 2tant HPRT gene in m ouse ,330:5762578.
3 K oller BH , Smithies O. the beta 22microglobin locus in
m ouse embry onic stem cells by hom olog ous recombination. Proc Natl Acad Sci US A , 1989,86:893228935.
4 M ans our S L , Thomas K R , Deng C , et al. Introduction of a lacZ reporter
gene into the m ouse int 22locus by hom olog ous recombination. Proc Natl Acad Sci US A , 1990,87:768827692.
5 Capecchi MR. T argeted gene replacement. Scientific American , 1994,
270(3) :52259.
6 Orban PC , Chui D , M arth JD. T issue and site 2specific DNA recombina 2tion in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci US A , 1992,89:686126865. 7 Laks o M ,Pichel J G, G orman JR , et al. E fficient in viv o manipulation of
m ouse enomic sequences at the zyg ote stage. Proc Natl Acad Sci US A , 1996,93:586025865.
8 Thoms on A J , M cwhir J. Biomedical and agricultural applications of ani 2mal transgenesis. M ol Biotechnol , 2004,27(3) :2312244.
9 S oudais C , Bielinska M , Heikinheim o M , et al. T argeted mutagenesis of
the transcription factor G AT A 24gene in m ouse embry onic stem cells dis 2rupts visceral endoderm differentiation in vitro. Development , 1995,121:387723888.
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(收稿日期:2004210208)
1,32galactosyl 2
(本文编辑:孙岩伟)