科技信息
高校理科研究
核酸扩增技术的原理及应用
董彦莉1 刘 玮2 王晓梅3 周平平1 李晓慧1
(1. 河北农业大学中兽医学院; 2. 天津武警医学院化学科研室; 3. 中国人民解放军军械工程学院理化科研室)
[摘 要]本文对核酸扩增的几个方面, 即聚合酶链式反应、连接酶链反应和Q β复制酶技术等这几种技术的原理和用途分别作了介绍。
[关键词]核酸扩增技术 聚合酶链式反应 连接酶链反应 Q β复制酶技术
最近二、三十年中, 现代生物科学迅速发展, 其中以重组
DN A 为中心的基因工程学是最引人注目的新研究领域。而核酸扩增技术作为基因工程学上重要的一个组成部分, 不仅可以扩增和分离目的基因, 并且在临床医疗诊断、基因突变监测和分子进化等方面也有重要用途。核酸扩增包括聚合酶链式反应(PCR ) 、连接酶链反应(L CR ) 和Q β复制酶技术等, 本文对这几种技术的原理和应用分别作了介绍。
1聚合酶链式反应1. 1基本原理
、引物和4种脱氧单核苷酸存在的PCR 技术是在模板DN A
条件下, 依赖于耐高温的DN A 聚合酶的酶促合成反应。PCR 以欲扩增的DN A 作为模板, 以模板正常和负链末端互补的两种寡核苷酸作为引物, 经过模板DN A 变性、模板引物复性结合, 并在DN A 聚合酶作用下发生引物链延伸反映, 来合成新的模板DN A 。每一循环的DN A 产物经变性又成为下一个循环的模板DN A 。这样, 目的DN A 数量将以2n-2n 形式累积, 在2h 内可扩增30(n) 个循环, DN A 量达原来的上百万倍。扩增产物通过凝胶电泳、So uthern 杂交或DN A 序列分析进行检测。
PCR 可扩增双链DN A 和单链RN A, 并能以RN A 为模板, 进行反转录PCR(RT -PCR) 以扩增cDN A 。此技术由于其灵敏度高、特异性好、能够区别强弱毒株, 在传染病的诊断和流行病学普查方面颇具潜力。方法是在PCR 体系中先引入反转录酶, 将RN A 反转录获得c DN A, 再以c DN A 作为PCR 的模板, 加入引物和T aqDN A 聚合酶, 按正常PCR 方式扩增cDN A 。随着科技的进步, RT -P CR 技术进一步完善, 出现了敏感性更高的多种方法。
除反转录PCR 外, 另有不对称P CR 、反向PC R 、锚定PC R 、多重PCR 、着色互补PC R 及免疫P CR 等。①不对称PC R :又称单链扩增PCR 。在这种PCR 中, 两种引物的辆相差悬殊, 一般为50:1-100:1, 这样在生成一定数量的双链产物后, 较少的引物就会被用完, 而大量生成一条单链的DN A 。②反向PCR :用于扩增位于已知序列的两侧的一段未知序列。用环化DN A 片断, 再从已知序列处切开的方法使未知序列变为位于已知序列之间。③锚定PCR :用于扩增未知序列的片段。方法是提取细胞总RN A 或m RN A 并经反转录合成cDN A , 通过DN A 末端转移酶在c DN A3端加上polyd G 尾, 通过其与互补的锚定引物po ly dC 来保证扩增反应的特异性。④多重PCR :在同一反应管中加入多对引物, 扩增同一模板的多个片段, 用来检测特定序列的存在或缺失。如果某一片段缺失或扩增该片段的引物与被检核酸同源性太低, 则在电泳图谱上就无相应的正常片段出现。⑤着色互补PC R :又称荧光PCR 。即用荧光染料分别标记不同的寡核苷酸引物, 通过多重P CR 同时扩增多个DN A 片段。反应后除去多余引物, 扩增产物在紫外灯下就能显示一种或几种荧光染料颜色的组合。如果某一DN A 区带缺失, 则会缺乏相应的颜色。⑥免疫PC R :是将高度灵敏的PCR 技术与特异的免疫学方法相结合的一种新型诊断技术。原理是将DN A 和抗体用连接分子连接, 进而使DN A 通过抗体而特异性的结合到抗原上, 形成“抗原——抗体——DN A 复合物”。再通过对作为指示系统的DN A 片段进行扩增而检验抗原存在与否。这项技术的发明者Sa no , T . 等的实验表明, 免疫PCR 的灵敏度比ELI SA 方法高10万倍, 足以检测出单个抗原分子。
另外还有一些改良R T-PCR 法:在RT-PC R 核酸扩增的
基础上, 通过再次扩增或利用特异性核酸探针联上另一检测方法, 将信号两次扩大而提高灵敏性, 进一步提高了敏感性和特异性。包括有巢氏PCR 法(即在原来的引物内侧重新设计一对引物, 再进行新一轮PCR 反应的方法) , Real-Time PC R 检测方法, 电化学发光法, RT-PC R-ELI SA 方法。其中R T-PCR-EL ISA 方法是PCR 技术与ELI SA 技术结合所产生的一种检测方法。主要应用其检测病毒样品中的特定基因。在基因扩增后, 引入EL ISA 技术替代电泳检测, 方便进行大量样品的处理, 并且其灵敏度较溴化乙锭印染琼脂糖凝胶高100倍。
1. 2用途
①快速、准确、安全地检测病原体。②制备探针和标记探针。③精确区分不同病原体或同一病原体的不同型、不同株、不同分离物。
另外, PCR 技术还广泛应用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、肿瘤基因和抗癌基因以及抗病毒药物等研究中去。
2连接酶链反应(L CR) 2. 1基本原理
L CR 技术是利用DN A 连接酶构建共价磷酸键, 特异地连接双链DN A, 经变性、退火和连接等步骤的反复温度循环, 从而使目标DN A 大量扩增的方法。反应体系需采用4个寡聚核苷酸引物, 其中两个与模板正链相结合, 另两个与负链相结合。引物长约15～20bp , 故L CR 扩增产物长约30～40bp 。由于扩增产物较短, 循环反应中的变性温度一般应比常规PCR 要低。热稳定连接酶分离自嗜热杆菌, 能精确识别与模板正确杂交的寡核苷酸引物, 作用类似于PC R 中Taq 酶的作用。
L CR 与P CR 的最根本不同点在于:前者是利用连接酶将人工合成的寡聚核苷酸链进行连接与扩增; 而后者则是利用人工合成引物片段将目的DN A 进行聚合与扩增。在L CR 中, 一旦待扩增和检测的DN A 与互补的两条寡聚核苷酸链接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配, 则连接反应就不能进行, 也就没有扩增产物。所以, 在L CR 后, 只需通过简单的电泳技术即可明确检测出待测基因的DN A 点突变。
2. 2用途
L CR 可与PCR 协同作用, 将PCR 所扩增的DN A 片段用L CR 按一定顺序连接起来, 也可联合PCR 技术, 有望成为一种很有价值的手段。主要用途如下:
①利用LC R 在识别点突变优于PCR 的长处, 可用于人类单碱基突变遗传病的实验性诊断。如诊断镰刀状细胞贫血病人珠蛋白基因的A →T 替换。②微生物病原体的检测。③定向诱变。L CR 法能够连接P CR 扩增片段, 进行多位点同时定向诱变或随机化设计, 因而是一种有效的基因改建和构造方法。
3Q β复制酶技术Q β复制酶是Q β噬菌体产生的一种依赖于RN A 的RN A 聚合酶。它能以某些单链RN A 为模板, 在体外大量复制单链
。该酶有严格的模板特异性, 能在体外充当Q RN A β复制酶模板的所有RN A 分子均含有大量二级结构, 且模板和产物RN A 必须能在复制过程中形成稳定的分子内二级结构。在Q β复制酶的天然模板M DV -1RN A 中插入一段疟原虫特异序列后, 经37℃半小时就可有1亿倍的扩增产物。
Q β复制酶能扩增经过修饰的RN A 片段, 因此可应用于诊断和检测单链RN A 或DN A 序列。虽然此项技术尚未完善, 但做一项核酸扩增技术, 亦具备可观的应用潜力。
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高校理科研究
核酸扩增技术的原理及应用
董彦莉1 刘 玮2 王晓梅3 周平平1 李晓慧1
(1. 河北农业大学中兽医学院; 2. 天津武警医学院化学科研室; 3. 中国人民解放军军械工程学院理化科研室)
[摘 要]本文对核酸扩增的几个方面, 即聚合酶链式反应、连接酶链反应和Q β复制酶技术等这几种技术的原理和用途分别作了介绍。
[关键词]核酸扩增技术 聚合酶链式反应 连接酶链反应 Q β复制酶技术
最近二、三十年中, 现代生物科学迅速发展, 其中以重组
DN A 为中心的基因工程学是最引人注目的新研究领域。而核酸扩增技术作为基因工程学上重要的一个组成部分, 不仅可以扩增和分离目的基因, 并且在临床医疗诊断、基因突变监测和分子进化等方面也有重要用途。核酸扩增包括聚合酶链式反应(PCR ) 、连接酶链反应(L CR ) 和Q β复制酶技术等, 本文对这几种技术的原理和应用分别作了介绍。
1聚合酶链式反应1. 1基本原理
、引物和4种脱氧单核苷酸存在的PCR 技术是在模板DN A
条件下, 依赖于耐高温的DN A 聚合酶的酶促合成反应。PCR 以欲扩增的DN A 作为模板, 以模板正常和负链末端互补的两种寡核苷酸作为引物, 经过模板DN A 变性、模板引物复性结合, 并在DN A 聚合酶作用下发生引物链延伸反映, 来合成新的模板DN A 。每一循环的DN A 产物经变性又成为下一个循环的模板DN A 。这样, 目的DN A 数量将以2n-2n 形式累积, 在2h 内可扩增30(n) 个循环, DN A 量达原来的上百万倍。扩增产物通过凝胶电泳、So uthern 杂交或DN A 序列分析进行检测。
PCR 可扩增双链DN A 和单链RN A, 并能以RN A 为模板, 进行反转录PCR(RT -PCR) 以扩增cDN A 。此技术由于其灵敏度高、特异性好、能够区别强弱毒株, 在传染病的诊断和流行病学普查方面颇具潜力。方法是在PCR 体系中先引入反转录酶, 将RN A 反转录获得c DN A, 再以c DN A 作为PCR 的模板, 加入引物和T aqDN A 聚合酶, 按正常PCR 方式扩增cDN A 。随着科技的进步, RT -P CR 技术进一步完善, 出现了敏感性更高的多种方法。
除反转录PCR 外, 另有不对称P CR 、反向PC R 、锚定PC R 、多重PCR 、着色互补PC R 及免疫P CR 等。①不对称PC R :又称单链扩增PCR 。在这种PCR 中, 两种引物的辆相差悬殊, 一般为50:1-100:1, 这样在生成一定数量的双链产物后, 较少的引物就会被用完, 而大量生成一条单链的DN A 。②反向PCR :用于扩增位于已知序列的两侧的一段未知序列。用环化DN A 片断, 再从已知序列处切开的方法使未知序列变为位于已知序列之间。③锚定PCR :用于扩增未知序列的片段。方法是提取细胞总RN A 或m RN A 并经反转录合成cDN A , 通过DN A 末端转移酶在c DN A3端加上polyd G 尾, 通过其与互补的锚定引物po ly dC 来保证扩增反应的特异性。④多重PCR :在同一反应管中加入多对引物, 扩增同一模板的多个片段, 用来检测特定序列的存在或缺失。如果某一片段缺失或扩增该片段的引物与被检核酸同源性太低, 则在电泳图谱上就无相应的正常片段出现。⑤着色互补PC R :又称荧光PCR 。即用荧光染料分别标记不同的寡核苷酸引物, 通过多重P CR 同时扩增多个DN A 片段。反应后除去多余引物, 扩增产物在紫外灯下就能显示一种或几种荧光染料颜色的组合。如果某一DN A 区带缺失, 则会缺乏相应的颜色。⑥免疫PC R :是将高度灵敏的PCR 技术与特异的免疫学方法相结合的一种新型诊断技术。原理是将DN A 和抗体用连接分子连接, 进而使DN A 通过抗体而特异性的结合到抗原上, 形成“抗原——抗体——DN A 复合物”。再通过对作为指示系统的DN A 片段进行扩增而检验抗原存在与否。这项技术的发明者Sa no , T . 等的实验表明, 免疫PCR 的灵敏度比ELI SA 方法高10万倍, 足以检测出单个抗原分子。
另外还有一些改良R T-PCR 法:在RT-PC R 核酸扩增的
基础上, 通过再次扩增或利用特异性核酸探针联上另一检测方法, 将信号两次扩大而提高灵敏性, 进一步提高了敏感性和特异性。包括有巢氏PCR 法(即在原来的引物内侧重新设计一对引物, 再进行新一轮PCR 反应的方法) , Real-Time PC R 检测方法, 电化学发光法, RT-PC R-ELI SA 方法。其中R T-PCR-EL ISA 方法是PCR 技术与ELI SA 技术结合所产生的一种检测方法。主要应用其检测病毒样品中的特定基因。在基因扩增后, 引入EL ISA 技术替代电泳检测, 方便进行大量样品的处理, 并且其灵敏度较溴化乙锭印染琼脂糖凝胶高100倍。
1. 2用途
①快速、准确、安全地检测病原体。②制备探针和标记探针。③精确区分不同病原体或同一病原体的不同型、不同株、不同分离物。
另外, PCR 技术还广泛应用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、肿瘤基因和抗癌基因以及抗病毒药物等研究中去。
2连接酶链反应(L CR) 2. 1基本原理
L CR 技术是利用DN A 连接酶构建共价磷酸键, 特异地连接双链DN A, 经变性、退火和连接等步骤的反复温度循环, 从而使目标DN A 大量扩增的方法。反应体系需采用4个寡聚核苷酸引物, 其中两个与模板正链相结合, 另两个与负链相结合。引物长约15～20bp , 故L CR 扩增产物长约30～40bp 。由于扩增产物较短, 循环反应中的变性温度一般应比常规PCR 要低。热稳定连接酶分离自嗜热杆菌, 能精确识别与模板正确杂交的寡核苷酸引物, 作用类似于PC R 中Taq 酶的作用。
L CR 与P CR 的最根本不同点在于:前者是利用连接酶将人工合成的寡聚核苷酸链进行连接与扩增; 而后者则是利用人工合成引物片段将目的DN A 进行聚合与扩增。在L CR 中, 一旦待扩增和检测的DN A 与互补的两条寡聚核苷酸链接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配, 则连接反应就不能进行, 也就没有扩增产物。所以, 在L CR 后, 只需通过简单的电泳技术即可明确检测出待测基因的DN A 点突变。
2. 2用途
L CR 可与PCR 协同作用, 将PCR 所扩增的DN A 片段用L CR 按一定顺序连接起来, 也可联合PCR 技术, 有望成为一种很有价值的手段。主要用途如下:
①利用LC R 在识别点突变优于PCR 的长处, 可用于人类单碱基突变遗传病的实验性诊断。如诊断镰刀状细胞贫血病人珠蛋白基因的A →T 替换。②微生物病原体的检测。③定向诱变。L CR 法能够连接P CR 扩增片段, 进行多位点同时定向诱变或随机化设计, 因而是一种有效的基因改建和构造方法。
3Q β复制酶技术Q β复制酶是Q β噬菌体产生的一种依赖于RN A 的RN A 聚合酶。它能以某些单链RN A 为模板, 在体外大量复制单链
。该酶有严格的模板特异性, 能在体外充当Q RN A β复制酶模板的所有RN A 分子均含有大量二级结构, 且模板和产物RN A 必须能在复制过程中形成稳定的分子内二级结构。在Q β复制酶的天然模板M DV -1RN A 中插入一段疟原虫特异序列后, 经37℃半小时就可有1亿倍的扩增产物。
Q β复制酶能扩增经过修饰的RN A 片段, 因此可应用于诊断和检测单链RN A 或DN A 序列。虽然此项技术尚未完善, 但做一项核酸扩增技术, 亦具备可观的应用潜力。