药物急性半数致死量（LD 50）的测定
附子急性毒性测定
一、目的：
1. 了解药物半数致死量(LD50)测定的原理和意义. 2. 通过实验掌握附子 LD50 的测定方法, 步骤和计算过程. 二、原理：
急性毒性试验是指受试动物在一次大剂量给药后所产生的毒性反应和死亡情况。药物毒性的大小，常用动物的致死量来表示，致死量的测定常以半数致死量为标准(LD50)。LD50是指在一群动物中能使半数动物死亡的剂量。由于实验动物的抽样误差，药物的致死量对数值大多在50％质反应的上下呈正态分布。在这样的质反应中药物剂量和质反应间呈S 型曲线，S 型曲线的两端处较平，而在50％质反应处曲线斜率最大，因此这里的药物剂量稍有变动，则动物的死或活的反应出现明显差异，所以测定半数致死量能比较准确地反映药物毒性的大小。
LD50的测定方法很多，例如目测机率单位法、加权机率单位法（Bliss 氏法）、寇氏法（Karber 氏法）及序贯法等，其中Bliss 氏法最常用。此法要求剂量按等比级数排列，每组小鼠数相等（不应太少，一般10-20只），剂量范围接近或等于0%-100%死亡率之间，一般分5-8个剂量组。 三、 实验材料
动物：KM 小鼠，体重18-22g ，雌雄各半。
器材：电子秤，小鼠鼠笼，1 ml注射器，5号针头，计时器，Bliss 统计法软件包。 药品与试剂：附子浸提液(1g/mL)、蒸馏水。 四、 方法与步骤 （一）预备实验
1、探索剂量范围： 先找出100%及0%死亡的剂量，此即上下限剂量（D m 及D n ）。按1：0.7的比例向上、向下调整剂量，由此找出上下限剂量。
2、确定组数，计算各组剂量：
一般分5-8个剂量组。配制等比稀释药液系列，使每只小鼠给药容量相等，一般为0.3mL/10g。按比例配出不同剂量的附子提取液。 （二）正式实验
1、分组编号：称各小鼠体重，将体重相同小鼠放一笼，分别用苦味酸做好标记。再按确定组数（4组）分层随机分组，使各组平均体重及性别分布尽可能一致，每组4只小鼠（2只雄性，2只雌性）。
2、给药：按照预实验确定的等比稀释的比例，配制不同浓度的附子浸提液给予各组小鼠灌胃。 3、观察记录：观察给药后40min 内小鼠毒性反应，记录每组小鼠死亡数量，计算每组死亡率（死亡率以小数表示）。
4. 计算LD50及95%可信限。
五、实验结果： 组别 1 2 3 4 Totle
动物数 12 12 12 12 48
剂量g/10g(d)
2.4 5.8 9.2 14 31.4
Logd(X) 0.380 0.763 0.954 1.140 3.237
（9/4）
死亡数 3 4 4 4 15
死亡率（P ） 75% 100% 100% 100% ΣP=375%
公式: LD 50=log-1 [Xm-i(ΣP-0.5)]=2.88*0.7Xm ：最大剂量组剂量的对数值
i ：相邻两组剂量（d ）对数值之差，或相邻两组高剂量与低剂量之比的对数。 P ：各组动物的死亡率，用小数表示。 ΣP：为各组动物死亡率的总和。 n ：每组动物数。 六、 讨论
1、附子中毒机制是附子生物碱刺激神经系统，先兴奋后抑制，首先兴奋感觉神经末梢、横纹肌和心肌以及中枢神经系统，继而发生对上述各部分的抑制与麻痹作用。在实验中表现为，给小鼠以灌胃方式给予附子浸提液后，大部分小鼠均出现步履蹒跚，后四肢抽搐。主要的中毒反应是：口吐白沫，呼吸困难，步履蹒跚，抽搐。
2、从实验数据可以看出，给予生理盐水的小鼠并未出现死亡的情况，而给予了一定剂量附子提取液的对照组，小鼠不仅出现死亡现象，而且死亡时间还很短。
3、从实验结果可以看出，附子提取液的浓度越来越大，小鼠的死亡率也越来越高，说明附子的毒性随浓度的增大而增大。
4、在实验的过程中，可以观察到小鼠的中毒反应主要为中枢神经反应，如：呕吐，呼吸困难，手足抽搐，大小便失禁等
5、我们在正式实验中，根据预实验中0%与100%动物死亡的剂量范围，按照等比数列设计5～7个不同剂量组，公比一般取1: 0.8 ～ 1: 0.7。
6、在预实验中，附子浸提液对小鼠的0%和100%致死剂量分别为4g/kg和14g/kg。正式实验时，最小给药浓度比预实验中0%致死剂量减小一个浓度，最大给药浓度比预实验中100%致死剂量增加一个浓度。
7、急性毒性实验并不等于LD50测定，急性毒性实验结果仅提供LD50值是不够的，实验期间应详细记录小鼠的毒性反应情况和死亡分布，尤其是中毒和死亡发生的时间，毒性反应的持续时间和恢复时间。附子中毒为急性中毒，最快可以使小鼠5min 内中毒死亡。附子浸提液毒性比较大，对雌雄小鼠的毒性没有差异。给药后，若小鼠很快恢复活泼状态，则表明其不会中毒。此外，每组小鼠体重的误差均不超过10g 。 结论：
用Bliss 法求得的LD50为7.53g/kg,其95%的可信限为5.97~9.40g/kg。 注意事项：
1、附子的毒性随炮制影响较大，自己要掌握中药化学与中药炮制学相关知识。 2、本实验为定量药物效价测定，要求较高的准确性，在实验过程中要求做到准确无误。
3、动物种类、体重范围、给药途径、实验观察时间等因素对LD50的测定结果都有影响，在报告结果时都应加以注明。
4、预试验要摸准药物引起0和100%死亡率剂量的所在范围。
5、正式试验时各剂量按等比级数分组，应避免最大剂量组的死亡小于80%，最小剂量组死亡率大于20%，否则改用其他方法计算。 6、室温应在20℃为宜。 7、应认真观察中毒症状情况。
七、 思考题
1. 什么叫LD50？测定LD50的药理学意义和依据是什么？ 1) LD50是指能引起50%的实验动物死亡的药物剂量。
2) 半数致死量（LD50）能比较准确地反映药物毒性的大小。通常将药物的半数致死量（LD50）与半数有效量（ED50）的比值称为治疗指数TI （therapeutic index ），即TI= ED50/LD50，用以表示药物安全性，通常来说，药物治疗指数越大，则越安全。
图一、剂量和死亡率的关系 图二、分组及剂量比值计算公式
药物急性半数致死量（LD 50）的测定
附子急性毒性测定
一、目的：
1. 了解药物半数致死量(LD50)测定的原理和意义. 2. 通过实验掌握附子 LD50 的测定方法, 步骤和计算过程. 二、原理：
急性毒性试验是指受试动物在一次大剂量给药后所产生的毒性反应和死亡情况。药物毒性的大小，常用动物的致死量来表示，致死量的测定常以半数致死量为标准(LD50)。LD50是指在一群动物中能使半数动物死亡的剂量。由于实验动物的抽样误差，药物的致死量对数值大多在50％质反应的上下呈正态分布。在这样的质反应中药物剂量和质反应间呈S 型曲线，S 型曲线的两端处较平，而在50％质反应处曲线斜率最大，因此这里的药物剂量稍有变动，则动物的死或活的反应出现明显差异，所以测定半数致死量能比较准确地反映药物毒性的大小。
LD50的测定方法很多，例如目测机率单位法、加权机率单位法（Bliss 氏法）、寇氏法（Karber 氏法）及序贯法等，其中Bliss 氏法最常用。此法要求剂量按等比级数排列，每组小鼠数相等（不应太少，一般10-20只），剂量范围接近或等于0%-100%死亡率之间，一般分5-8个剂量组。 三、 实验材料
动物：KM 小鼠，体重18-22g ，雌雄各半。
器材：电子秤，小鼠鼠笼，1 ml注射器，5号针头，计时器，Bliss 统计法软件包。 药品与试剂：附子浸提液(1g/mL)、蒸馏水。 四、 方法与步骤 （一）预备实验
1、探索剂量范围： 先找出100%及0%死亡的剂量，此即上下限剂量（D m 及D n ）。按1：0.7的比例向上、向下调整剂量，由此找出上下限剂量。
2、确定组数，计算各组剂量：
一般分5-8个剂量组。配制等比稀释药液系列，使每只小鼠给药容量相等，一般为0.3mL/10g。按比例配出不同剂量的附子提取液。 （二）正式实验
1、分组编号：称各小鼠体重，将体重相同小鼠放一笼，分别用苦味酸做好标记。再按确定组数（4组）分层随机分组，使各组平均体重及性别分布尽可能一致，每组4只小鼠（2只雄性，2只雌性）。
2、给药：按照预实验确定的等比稀释的比例，配制不同浓度的附子浸提液给予各组小鼠灌胃。 3、观察记录：观察给药后40min 内小鼠毒性反应，记录每组小鼠死亡数量，计算每组死亡率（死亡率以小数表示）。
4. 计算LD50及95%可信限。
五、实验结果： 组别 1 2 3 4 Totle
动物数 12 12 12 12 48
剂量g/10g(d)
2.4 5.8 9.2 14 31.4
Logd(X) 0.380 0.763 0.954 1.140 3.237
（9/4）
死亡数 3 4 4 4 15
死亡率（P ） 75% 100% 100% 100% ΣP=375%
公式: LD 50=log-1 [Xm-i(ΣP-0.5)]=2.88*0.7Xm ：最大剂量组剂量的对数值
i ：相邻两组剂量（d ）对数值之差，或相邻两组高剂量与低剂量之比的对数。 P ：各组动物的死亡率，用小数表示。 ΣP：为各组动物死亡率的总和。 n ：每组动物数。 六、 讨论
1、附子中毒机制是附子生物碱刺激神经系统，先兴奋后抑制，首先兴奋感觉神经末梢、横纹肌和心肌以及中枢神经系统，继而发生对上述各部分的抑制与麻痹作用。在实验中表现为，给小鼠以灌胃方式给予附子浸提液后，大部分小鼠均出现步履蹒跚，后四肢抽搐。主要的中毒反应是：口吐白沫，呼吸困难，步履蹒跚，抽搐。
2、从实验数据可以看出，给予生理盐水的小鼠并未出现死亡的情况，而给予了一定剂量附子提取液的对照组，小鼠不仅出现死亡现象，而且死亡时间还很短。
3、从实验结果可以看出，附子提取液的浓度越来越大，小鼠的死亡率也越来越高，说明附子的毒性随浓度的增大而增大。
4、在实验的过程中，可以观察到小鼠的中毒反应主要为中枢神经反应，如：呕吐，呼吸困难，手足抽搐，大小便失禁等
5、我们在正式实验中，根据预实验中0%与100%动物死亡的剂量范围，按照等比数列设计5～7个不同剂量组，公比一般取1: 0.8 ～ 1: 0.7。
6、在预实验中，附子浸提液对小鼠的0%和100%致死剂量分别为4g/kg和14g/kg。正式实验时，最小给药浓度比预实验中0%致死剂量减小一个浓度，最大给药浓度比预实验中100%致死剂量增加一个浓度。
7、急性毒性实验并不等于LD50测定，急性毒性实验结果仅提供LD50值是不够的，实验期间应详细记录小鼠的毒性反应情况和死亡分布，尤其是中毒和死亡发生的时间，毒性反应的持续时间和恢复时间。附子中毒为急性中毒，最快可以使小鼠5min 内中毒死亡。附子浸提液毒性比较大，对雌雄小鼠的毒性没有差异。给药后，若小鼠很快恢复活泼状态，则表明其不会中毒。此外，每组小鼠体重的误差均不超过10g 。 结论：
用Bliss 法求得的LD50为7.53g/kg,其95%的可信限为5.97~9.40g/kg。 注意事项：
1、附子的毒性随炮制影响较大，自己要掌握中药化学与中药炮制学相关知识。 2、本实验为定量药物效价测定，要求较高的准确性，在实验过程中要求做到准确无误。
3、动物种类、体重范围、给药途径、实验观察时间等因素对LD50的测定结果都有影响，在报告结果时都应加以注明。
4、预试验要摸准药物引起0和100%死亡率剂量的所在范围。
5、正式试验时各剂量按等比级数分组，应避免最大剂量组的死亡小于80%，最小剂量组死亡率大于20%，否则改用其他方法计算。 6、室温应在20℃为宜。 7、应认真观察中毒症状情况。
七、 思考题
1. 什么叫LD50？测定LD50的药理学意义和依据是什么？ 1) LD50是指能引起50%的实验动物死亡的药物剂量。
2) 半数致死量（LD50）能比较准确地反映药物毒性的大小。通常将药物的半数致死量（LD50）与半数有效量（ED50）的比值称为治疗指数TI （therapeutic index ），即TI= ED50/LD50，用以表示药物安全性，通常来说，药物治疗指数越大，则越安全。
图一、剂量和死亡率的关系 图二、分组及剂量比值计算公式