核酸、核苷酸的基本换算
DNA电泳基本参数
Pfu DNA聚合酶
BCIP/NBT & BCIP/INTHistoChoice MBHistoChoice Clearing Agent
核酸、核苷酸的基本换算
1． 核酸的换算：
(1) 摩尔数与质量：
1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol
1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol
1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol
1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol
1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol
1 μg M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 0.21 pmol
1 μg l phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol 1 pmol
1,000bp DNA = 0.66 μg
1 pmol pUC18/19 DNA (2,688bp) = 1.77 μg
1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 μg
1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 μg
1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 μg
1 pmol M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 4.78 μg
1 pmol l phage DNA (48,502bp) = 32.01 μg
(2) 光吸收值与浓度：
1 OD260 dsDNA = 50 μg/ml = 0.15 mmol/L
1 OD260 ssDNA = 33 μg/ml = 0.10 mmol/L
1 OD260 ssRNA = 40 μg/ml = 0.12 mmol/L
1 mmol/L dsDNA = 6.7 OD260
1 mmol/L ssDNA = 10.0 OD260
1 mmol/L ssRNA = 8.3 OD260
(3) 分子量：
1个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons
1个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons
(4) 核酸末端浓度：
环状DNA pmol ends = pmol DNA × number of cuts ×2
线性DNApmol ends = pmol DNA ×(number of cuts ×2 + 2)
1 μg 1,000 bp DNA = 3.04 pmol ends
1 μg pUC18/19 DNA (2,688 bp) = 1.14 pmol ends
1 μg pBR322 DNA (4,361 bp) = 0.7 pmol ends
1 μg SV40 DNA (5,243 bp) = 0.58 pmol ends
1 μg FX174 DNA (5,386 bp) = 0.56 pmol ends
1 μg M13mp18/19 DNA (7.250 bp) = 0.42 pmol ends
1 μg l phage DNA (48,502 bp) = 0.06 pmol ends
2． 核苷酸的换算：
(1) 分子量：MW (Da) = 333 × N (number of bases)
(2) 浓度：C (μmol/L or pmol/ml) = OD260 / (0.01 × N)C (ng/ml) = OD260´ MW / (0.01
× N)
MW -- molecular ；weightN -- number of bases；OD260 -- absorbance at 260 nm
(3) 双链DNA与寡核苷酸的熔点
短于25bp的双链寡核苷酸Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
长于25bp的双链寡核苷酸Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC) - (600/N) - 0.63 (%formamide)N -- 引物的长度(以碱基数计算)J+ -- 单价阳离子浓度
(4) DNA与表达蛋白之间分子量换算
1 kb DNA = 333 amino acid ≈3.7 × 104 Da
10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA
30,000 Da Protein≈ 810 bp DNA
50,000 Da Protein ≈2701 bp DNA
100,000 Da Protein ≈ 27 kb DNA
3．DNA电泳基本参数1．琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA迁移率（线性DNA分离建议凝胶浓
度）分离范围(bp) 琼脂糖浓度 分离范围(bp) PAGE浓度
1,000～30,000 0.5% 100～1,000 3.5%
800～12,000 0.7% 80～500 5.0%
500～10,000 1.0% 60～400 8.0%
400～7,000 1.2% 40～200 12.0%
200～4,000 1.5% 5～100 20.0%
50～2,000 2.0%
4． 性、非变性PAGE胶中染料迁移率PAGE浓度 溴酚蓝 二甲苯青
（相当核苷酸片段大小，bp）
3.5% 100 460
5.0% 65 260
8.0% 45 160
12.0% 20 70
15.0% 15 60
20.0% 12 45
5．
Pfu DNA聚合酶
一、简介： Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA Polymerase，Pfu)是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis
分离出的高保真（High Fidelity）耐高温DNA聚合酶。Pfu酶能纠正DNA扩增（PCR）过程中产生的错误，而传统的Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase，Taq)，Tth DNA
聚合酶及它们的变体如AmpliTaq，KlenTaq等都不能。高温DNA聚合酶Vent、
DeepVent、Tli、Pwo、Pfu、UlTma等都具有校正功能（Proof reading），但Pfu酶是迄今发现的所有高温DNA聚合酶中在扩增DNA时出错率（error rate）最低的。它比Taq及变体低近10倍，比Vent和Pwo低2-4倍。Pfu酶的超常纠错特性是由该酶本身的性质决定的。其它高温DNA聚合酶与Pfu酶混合使用，可以部分降低产品的错误率，但效果却达不到单独使用Pfu酶时的高保真率。在基因克隆、表达和基因突变分析等现代分子生物学实验操作中，由于对DNA扩增产物的正确率要求非常高，，一般认为Pfu酶可取代Taq成为首选高保真高温DNA聚合酶。
二、浓度: 2.5-5U/μl三、活性定义： 1单位Pfu酶定义为在72℃，30分钟内将10nmol同位素标记的4×dNTP掺入到DE81纸不溶物质中所需Pfu酶的量。四、10′PCR 反应缓冲液： 100mM KCl，160mM (NH4),2SO4，20mM MgSO4，200mM Tris·HCl，pH8.8，1% Triton X-100，1 mg/ml BSA五、质量控制： 经过检测无外源核酸酶活性；SDS-PAGE检测纯度大于95%；PCR方法检测无外源DNA；能从100ng lambda模板中扩增出1kb和2kb的单拷贝基因。六、储存条件： Pfu酶成品保存于50mM Tris·HCl，pH8.2，0.1 mM EDTA，0.1% Tween-20，0.1% NP-40，1 mM DTT和50% glycerol，-20℃，一年以上。七、主要应用领域：1、常规PCR2、基因的高保真扩增、克隆和表达3、基因的定点突变4、细胞内基因突变分析八、主要技术参数： Pfu酶来源于高温嗜热菌Pyrococcus furiosis。分子量为90KD；PCR产物为平端，无3'端的单个dA；有3'?5'外切核酸酶活性（高保真）；无5'→3'外切核酸酶活性；DNA聚合时的延伸速度为每分钟600个碱基；最佳温度65-75℃；dNTP的工作浓度为100-300μM，最佳Mg2+浓度为2-3mM，最佳pH为8.1-9.1；供应浓度为2.5-5U/μl；-20℃保存至少一年。
九、Pfu DNA 聚合酶的使用方法：Pfu酶的使用方法基本同Taq酶。DNA扩增（PCR）时，50μl标准反应体系需2.5U左右。十、注意事项：(1) Pfu酶扩增效率通常比Taq酶差，这是由于Pfu酶具有3'→5'的外切酶活性（高保真性）所引起的，不是由于Pfu酶的质量不稳定所致。Pfu酶在扩增２kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别。(2) 10×Pfu PCR Buffer中已含有Mg2+，该缓冲液能保证扩增产物的保真性。提高反应体系的pH和Mg2+浓度能部分提高DNA扩增的产率，但产物的保真性将有所下降。不提倡用Taq PCR反应缓冲液代替Pfu酶缓冲液进行高保真扩增。(3) 用Pfu酶扩增时，引物的纯度要求较高，长度要求大于18 base，Tm在55-80℃之间。引物的浓度在0.1-0.5μM之间，比Taq酶略高。Pfu酶具有3'→5'的外切酶活性可能会降解引物，特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以，Pfu酶必须最后加入到反应体系中，并立即进行PCR反应。(4) Pfu酶的热稳定性比Taq酶高，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃，不会影响Pfu酶的活性。(5) PCR产物为平端，不能直接用T/A克隆方式克隆。可选用其它相关产品克隆Pfu酶扩增的PCR产物。 BCIP/NBT & BCIP/INT BCIP/NBT 可与碱性磷酸酶反应生成深蓝色不溶性氮兰四唑formazan终产物。进行DNA印迹实验时，是偶联到链酶亲和素、抗地高辛抗体或其它二抗上的碱性磷酸酶的反应底物。当组织要用苏木精对比染色时，与蓝色苏木精背景相对比，BCIP/INT与碱性磷酸酶反应生成的砖红色终产物清晰可见，可避免了在同样情况下观察氮兰四唑formazan时可能产生的误导结果。这两种底物具有性能稳定、敏感度高、使用方便等优点，与碱性磷酸酶反应后在浅色的背景下生成色彩鲜亮的不溶性产物，是进行印迹和杂交实验时的理想底物。HistoChoice MB HistoChoice MB作为一种分子生物学固定剂，具有安全无毒的优点。它不含甲醛、戊二醛或汞，完全无味，可通过排水管道进行排放处理。该种组织固定剂是专为分子生物学应用而设计，其设计独特的分子结构可以保护抗原决定簇或核酸位点。HistoChoice MB替代了醛基、醇基、Zenders、B-5、B-3、Bouin及其他固定剂。采用HistoChoice MB固定的组织染色后可充分显示组织内部结构特点，可观察到细胞核和细胞质的更细微情况。甚至在长时间固定后仍能保持新鲜组织的外部形象。由于其分子结构是专门为分子生物学应用设计的，被HistoChoice MB固定的组织部位无需使用预消化或其它复原手段去获得重要位点。HistoChoice MB可使抗原或核酸保持它们的状态并与特定的抗体或探针结合。由于被保护的抗原决定簇的数量增加，原使用量的抗体通常可被稀释数倍后使用，降低了单个切片的处理费用。 HistoChoice MB固定的组织更软，保留了更多的自然形态。与福尔马林固定的硬化组织相比，较软的组织可以被切得更薄，切面更光滑。定色时间：细胞，15－20分钟；组织切片，45分钟；组织块(1cm3)，2-3小时。HistoChoice Clearing Agent 二甲苯的替代物，不燃，并有以下特征:安全性 无味、无毒、不致癌、不可燃烧；局部使用方便，不刺激皮肤；可按汽油的衍生物的常规处理方法来处理废弃的试剂。性能 与有机封固剂互溶；溶化蜡比二甲苯快，挥发慢；在自动操作程序中与异丙醇共同使用发挥作用；浸在HistoChoice Clearing Agent中，粘贴纸片易于除掉。经济 费用与使用二甲苯以及甲苯差不多；可采用蒸发回流的方法回收反复使用。
核酸、核苷酸的基本换算
DNA电泳基本参数
Pfu DNA聚合酶
BCIP/NBT & BCIP/INTHistoChoice MBHistoChoice Clearing Agent
核酸、核苷酸的基本换算
1． 核酸的换算：
(1) 摩尔数与质量：
1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol
1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol
1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol
1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol
1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol
1 μg M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 0.21 pmol
1 μg l phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol 1 pmol
1,000bp DNA = 0.66 μg
1 pmol pUC18/19 DNA (2,688bp) = 1.77 μg
1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 μg
1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 μg
1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 μg
1 pmol M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 4.78 μg
1 pmol l phage DNA (48,502bp) = 32.01 μg
(2) 光吸收值与浓度：
1 OD260 dsDNA = 50 μg/ml = 0.15 mmol/L
1 OD260 ssDNA = 33 μg/ml = 0.10 mmol/L
1 OD260 ssRNA = 40 μg/ml = 0.12 mmol/L
1 mmol/L dsDNA = 6.7 OD260
1 mmol/L ssDNA = 10.0 OD260
1 mmol/L ssRNA = 8.3 OD260
(3) 分子量：
1个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons
1个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons
(4) 核酸末端浓度：
环状DNA pmol ends = pmol DNA × number of cuts ×2
线性DNApmol ends = pmol DNA ×(number of cuts ×2 + 2)
1 μg 1,000 bp DNA = 3.04 pmol ends
1 μg pUC18/19 DNA (2,688 bp) = 1.14 pmol ends
1 μg pBR322 DNA (4,361 bp) = 0.7 pmol ends
1 μg SV40 DNA (5,243 bp) = 0.58 pmol ends
1 μg FX174 DNA (5,386 bp) = 0.56 pmol ends
1 μg M13mp18/19 DNA (7.250 bp) = 0.42 pmol ends
1 μg l phage DNA (48,502 bp) = 0.06 pmol ends
2． 核苷酸的换算：
(1) 分子量：MW (Da) = 333 × N (number of bases)
(2) 浓度：C (μmol/L or pmol/ml) = OD260 / (0.01 × N)C (ng/ml) = OD260´ MW / (0.01
× N)
MW -- molecular ；weightN -- number of bases；OD260 -- absorbance at 260 nm
(3) 双链DNA与寡核苷酸的熔点
短于25bp的双链寡核苷酸Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
长于25bp的双链寡核苷酸Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC) - (600/N) - 0.63 (%formamide)N -- 引物的长度(以碱基数计算)J+ -- 单价阳离子浓度
(4) DNA与表达蛋白之间分子量换算
1 kb DNA = 333 amino acid ≈3.7 × 104 Da
10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA
30,000 Da Protein≈ 810 bp DNA
50,000 Da Protein ≈2701 bp DNA
100,000 Da Protein ≈ 27 kb DNA
3．DNA电泳基本参数1．琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA迁移率（线性DNA分离建议凝胶浓
度）分离范围(bp) 琼脂糖浓度 分离范围(bp) PAGE浓度
1,000～30,000 0.5% 100～1,000 3.5%
800～12,000 0.7% 80～500 5.0%
500～10,000 1.0% 60～400 8.0%
400～7,000 1.2% 40～200 12.0%
200～4,000 1.5% 5～100 20.0%
50～2,000 2.0%
4． 性、非变性PAGE胶中染料迁移率PAGE浓度 溴酚蓝 二甲苯青
（相当核苷酸片段大小，bp）
3.5% 100 460
5.0% 65 260
8.0% 45 160
12.0% 20 70
15.0% 15 60
20.0% 12 45
5．
Pfu DNA聚合酶
一、简介： Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA Polymerase，Pfu)是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis
分离出的高保真（High Fidelity）耐高温DNA聚合酶。Pfu酶能纠正DNA扩增（PCR）过程中产生的错误，而传统的Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase，Taq)，Tth DNA
聚合酶及它们的变体如AmpliTaq，KlenTaq等都不能。高温DNA聚合酶Vent、
DeepVent、Tli、Pwo、Pfu、UlTma等都具有校正功能（Proof reading），但Pfu酶是迄今发现的所有高温DNA聚合酶中在扩增DNA时出错率（error rate）最低的。它比Taq及变体低近10倍，比Vent和Pwo低2-4倍。Pfu酶的超常纠错特性是由该酶本身的性质决定的。其它高温DNA聚合酶与Pfu酶混合使用，可以部分降低产品的错误率，但效果却达不到单独使用Pfu酶时的高保真率。在基因克隆、表达和基因突变分析等现代分子生物学实验操作中，由于对DNA扩增产物的正确率要求非常高，，一般认为Pfu酶可取代Taq成为首选高保真高温DNA聚合酶。
二、浓度: 2.5-5U/μl三、活性定义： 1单位Pfu酶定义为在72℃，30分钟内将10nmol同位素标记的4×dNTP掺入到DE81纸不溶物质中所需Pfu酶的量。四、10′PCR 反应缓冲液： 100mM KCl，160mM (NH4),2SO4，20mM MgSO4，200mM Tris·HCl，pH8.8，1% Triton X-100，1 mg/ml BSA五、质量控制： 经过检测无外源核酸酶活性；SDS-PAGE检测纯度大于95%；PCR方法检测无外源DNA；能从100ng lambda模板中扩增出1kb和2kb的单拷贝基因。六、储存条件： Pfu酶成品保存于50mM Tris·HCl，pH8.2，0.1 mM EDTA，0.1% Tween-20，0.1% NP-40，1 mM DTT和50% glycerol，-20℃，一年以上。七、主要应用领域：1、常规PCR2、基因的高保真扩增、克隆和表达3、基因的定点突变4、细胞内基因突变分析八、主要技术参数： Pfu酶来源于高温嗜热菌Pyrococcus furiosis。分子量为90KD；PCR产物为平端，无3'端的单个dA；有3'?5'外切核酸酶活性（高保真）；无5'→3'外切核酸酶活性；DNA聚合时的延伸速度为每分钟600个碱基；最佳温度65-75℃；dNTP的工作浓度为100-300μM，最佳Mg2+浓度为2-3mM，最佳pH为8.1-9.1；供应浓度为2.5-5U/μl；-20℃保存至少一年。
九、Pfu DNA 聚合酶的使用方法：Pfu酶的使用方法基本同Taq酶。DNA扩增（PCR）时，50μl标准反应体系需2.5U左右。十、注意事项：(1) Pfu酶扩增效率通常比Taq酶差，这是由于Pfu酶具有3'→5'的外切酶活性（高保真性）所引起的，不是由于Pfu酶的质量不稳定所致。Pfu酶在扩增２kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别。(2) 10×Pfu PCR Buffer中已含有Mg2+，该缓冲液能保证扩增产物的保真性。提高反应体系的pH和Mg2+浓度能部分提高DNA扩增的产率，但产物的保真性将有所下降。不提倡用Taq PCR反应缓冲液代替Pfu酶缓冲液进行高保真扩增。(3) 用Pfu酶扩增时，引物的纯度要求较高，长度要求大于18 base，Tm在55-80℃之间。引物的浓度在0.1-0.5μM之间，比Taq酶略高。Pfu酶具有3'→5'的外切酶活性可能会降解引物，特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以，Pfu酶必须最后加入到反应体系中，并立即进行PCR反应。(4) Pfu酶的热稳定性比Taq酶高，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃，不会影响Pfu酶的活性。(5) PCR产物为平端，不能直接用T/A克隆方式克隆。可选用其它相关产品克隆Pfu酶扩增的PCR产物。 BCIP/NBT & BCIP/INT BCIP/NBT 可与碱性磷酸酶反应生成深蓝色不溶性氮兰四唑formazan终产物。进行DNA印迹实验时，是偶联到链酶亲和素、抗地高辛抗体或其它二抗上的碱性磷酸酶的反应底物。当组织要用苏木精对比染色时，与蓝色苏木精背景相对比，BCIP/INT与碱性磷酸酶反应生成的砖红色终产物清晰可见，可避免了在同样情况下观察氮兰四唑formazan时可能产生的误导结果。这两种底物具有性能稳定、敏感度高、使用方便等优点，与碱性磷酸酶反应后在浅色的背景下生成色彩鲜亮的不溶性产物，是进行印迹和杂交实验时的理想底物。HistoChoice MB HistoChoice MB作为一种分子生物学固定剂，具有安全无毒的优点。它不含甲醛、戊二醛或汞，完全无味，可通过排水管道进行排放处理。该种组织固定剂是专为分子生物学应用而设计，其设计独特的分子结构可以保护抗原决定簇或核酸位点。HistoChoice MB替代了醛基、醇基、Zenders、B-5、B-3、Bouin及其他固定剂。采用HistoChoice MB固定的组织染色后可充分显示组织内部结构特点，可观察到细胞核和细胞质的更细微情况。甚至在长时间固定后仍能保持新鲜组织的外部形象。由于其分子结构是专门为分子生物学应用设计的，被HistoChoice MB固定的组织部位无需使用预消化或其它复原手段去获得重要位点。HistoChoice MB可使抗原或核酸保持它们的状态并与特定的抗体或探针结合。由于被保护的抗原决定簇的数量增加，原使用量的抗体通常可被稀释数倍后使用，降低了单个切片的处理费用。 HistoChoice MB固定的组织更软，保留了更多的自然形态。与福尔马林固定的硬化组织相比，较软的组织可以被切得更薄，切面更光滑。定色时间：细胞，15－20分钟；组织切片，45分钟；组织块(1cm3)，2-3小时。HistoChoice Clearing Agent 二甲苯的替代物，不燃，并有以下特征:安全性 无味、无毒、不致癌、不可燃烧；局部使用方便，不刺激皮肤；可按汽油的衍生物的常规处理方法来处理废弃的试剂。性能 与有机封固剂互溶；溶化蜡比二甲苯快，挥发慢；在自动操作程序中与异丙醇共同使用发挥作用；浸在HistoChoice Clearing Agent中，粘贴纸片易于除掉。经济 费用与使用二甲苯以及甲苯差不多；可采用蒸发回流的方法回收反复使用。