L-色氨酸的研究进展
陈荣庆 刘伟 皮雄娥 王欣
11222，* （浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004；浙江省农业科学院植物保护与
微生物研究所，浙江杭州 310021）
摘要：L-色氨酸在医药、食品、饲料添加剂以及环境监测等方面的应用越来越广泛。详细介介绍了酶法，直接发酵法，微生物转化法等生产L-色氨酸的方法。随着市场需求的增大，L-色氨酸的应用研究逐渐成为一项新的热点。
关键词： L-色氨酸； 应用； 生产方法
中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：
The study progress of L–tryptophan
CHEN Rong-qing1， LIU Wei2 ，PI Xiong-e2 ，W ANG Xin2，* 2
（1College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal Univeristy，Jinhua 1 321004，China ；2Institute of Plant Protection and Microbiology ，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences ，Hangzhou 310021，China ）
Abstract: L-tryptophan has more and more application in medicine，food ，feed additives， and the environmental monitoring ，etc. There are some detail introduces about the production method of L – tryptophan，such as the enzymatic，direct fermentation， microbial reforming process. With the increase of market demand, the application of L-tryptophan study gradually become a new hot spot.
Key words: L-tryptophan ；Application ； Production methods ；
1作者简介:陈荣庆( 1988－ ) ，男，山东人，硕士研究生，主要从事
微生物与分子生物学的研究。Tel:[1**********] E-mail: chenrongqing69@
163.com
*通讯作者：王欣，Tel: 0571－86415126；E-mail: [email protected]
色氨酸的化学名称为α-氨基-β-吲哚丙酸，有三种同分异构体：L 型、D 型和消旋体DL 型[1]。1825年，色氨酸首次被发现，1902年，由Hokinst 首次从酪蛋白中分离获得。其分子式为C 11H 12N 2O 2，分子量为204.23，白色晶体或者微黄色片状晶体或粉末。无味，右旋体或有特殊甜味，溶于水或者热乙醇，不溶于氯仿、乙醚，在稀酸或稀碱中较稳定。与水一起加热，会产生少量吲哚，在有NaOH 、CuSO 4存在的条件下加热，则会分解产生大量吲哚。若迅速加热至210℃时颜色会变黄，290℃时发生分解反应，长时间光照则会发生着色反应。L -色氨酸结构图式:
图1 色氨酸结构式
Fig.1 the Structure of tryptophan
L -色氨酸是人体和动物所必需的8种必需氨基酸之一，不能通过自身合成。所以，人和动物只能通过食物来摄取L-色氨酸。D -色氨酸主要存在于植物和微生物之中，动物中含量极少, 而且在人体内几乎不发生代谢作用, 也无毒性[2]。
L -色氨酸又被称为第二必需氨基酸，目前广泛应用医药，食品、饲料添加剂以及农业环境检测等行业[3]。近年来，随着国内饲料工业发展迅速，以及L-色氨酸及其代谢产物研究的越来越深入，尤其是随着我国老龄化程度不断加重，其在医药行业上的用途也不断扩大，L-色氨酸逐渐成为一种国际市场发展潜力巨大、国内市场需求较大的产品。本文就L-色氨酸在各行业的应用，生产方法, 高产菌构建策略以及市场现状和前景作一综述。
1 L-色氨酸的应用
1.1 L-色氨酸在医药研究的应用
L -色氨酸在医药行业的应用一直是医药界的研究热点。L -色氨酸及其代谢产物能够广泛参与到生物体内的新陈代谢过程, 在L-色氨酸的分解代谢过程中可以产生多种生理活性物质，如5-羟色胺(5-HT )
、色素、烟酸、吲哚乙酸、生
物碱、辅酶、褪黑素和植物激素等[4]。这些代谢产物能够广泛参与到人体的各项生理活动，同时会参与众多的生理调节。近年来研究发现，L-色氨酸不只用来制作氨基酸注射液，对于抑郁症、高血压及止痛都有良好的效果，在欧美一些国家已经广泛应用于临床治疗[5]。
作为L -色氨酸的重要代谢产物之一，5-HT 是人体中枢神经系统的重要神经递质, 能够调节人体精神活动, 同时控制神经系统的兴奋表达。如果人体内血液中L -色氨酸水平下降, 就会引起脑部5-HT 供应不足, 使人们产生抑郁、自责等情绪, 所以在抑郁症患者体内通常会发现5-HT 供应不足的现象，所以在抑郁症患者的治疗过程中，积极补充L-色氨酸，患者大脑内5-HT 的含量会相对应的提高, 患者情绪会得到良好的控制，病情得到明显缓解[6-7]。L -色氨酸在英国已经被列为抗抑郁剂。
临床研究发现，L -色氨酸与铁剂、维生素合用可增强它们治疗运动性贫血的疗效；与组氨酸一起使用还可以治疗消化道溃疡[8]。
1.2 L-色氨酸在饲料添加剂行业的应用
L -色氨酸是饲料市场上的除酪氨酸和蛋氨酸之外的三大氨基酸饲料添加剂之一。如果禽类体内L -色氨酸供应不足时, 动物体内会出现一系列不适应症状，如脂肪积累速度减缓、机体生长缓慢、而且公畜有时候会出现睾丸发育不良等现象[9]。而且，在饲料中添加微量的L -色氨酸就可以达到促进动物体体重增加的目的，具有良好的效果。
L -色氨酸可以参与体内脂肪代谢、降低动物肝脏脂肪含量, 从而达到提高禽畜肉类的瘦肉比例的目的[10]，还可以降低禽畜发生攻击性行为的可能性[11]。作为L-色氨酸中间代谢产物之一的尼克酰胺, 将其制成饲料添加剂，能够显著提高家禽的生长速度，同时可以预防动物体发生尼克酸胺缺乏症[12]。另外一种代谢中间物5-羟色胺可以促进动物体产生γ-球蛋白、增强禽畜的抗病能力等[13]。虽然L -色氨酸作为饲料添加剂的效果良好，但是在大规模应用方面还是有其不足之处。主要是因为目前色氨酸生产工艺水平不高，不能大规模的生产L -色氨酸，所以存在成本限制。所以现在只是应用到仔猪饲料添加剂中。日本市场的L -色
氨酸年需求量已经从前几年的不到10t 提高到现在的30t 以上。目前饲用氨基酸的开发主要是在日本市场。
1.3 L-色氨酸在食品行业的应用
人体也不能自身合成L -色氨酸，为了满足自身需要，需要从外界获取L -色氨酸，而这个来源主要就是食物来源。L-色氨酸在人及动物的体内代谢过程发挥着重要的作用，所以L -色氨酸又称为第二必需氨基酸。L -色氨酸在食物添加剂的应用方面现在越来越受到人们的重视。在国内外很多地方，已经将L -色氨酸制作为食品添加剂，人体摄入之后会对人体生理活动有许多积极作用，比如可以提高机体对植物蛋白的利用效率，加速蛋白分解利用[14]。另外，L -色氨酸容易与金属离子发生作用, 作为一种螯合剂来使用时，经常用作防腐剂，添加到奶粉中防止变质或用作鱼类保鲜剂[15]。
1.4 L-色氨酸在农业以及环境监测方面的应用
L -色氨酸在农业害虫防治方面也有一定应用，例如L -色氨酸可以使南方毛虫拒食死亡。L -色氨酸还可以加入到水杨酸和环磷酸中作为稳定剂, 能够增强其杀虫效果[8]。色氨酸具有吲哚环, 具有良好的荧光吸收性, 是荧光性最强的氨基酸, 因此可用于检测生物生态系统及自然环境中有毒金属离子(如Cu 2+,As 3+,Pb 2+) 。色氨酸对环境有高度敏感性，某些物质极微小的极性变化也可以使吸收光谱发生变化，因此, 将色氨酸作为极性探针, 可以检测环境中某些成分的极性变化[16]。 2 L-色氨酸的生产方法研究
传统生产L -色氨酸的方法主要是化学合成法和蛋白质水解法，但是这些方法有不足之处，主要表现在周期长、原材料成本较高、产物不宜分离提纯等[17]。随着生产技术的不断进步，现在占据市场主导地位的方法是很多公司采用的微生物法生产L -色氨酸。微生物法主要包括酶法、直接发酵法和微生物转化法。
2.1 酶法
酶法主要是指利用微生物中的L -色氨酸生物合成酶系的催化功能来生产L -色氨酸。酶法生产L -色氨酸的方法主要用到的酶包括色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。根据提供所需酶的微生物种类数，酶法主要分为单菌酶法和双菌酶法。
现在工业生产L -色氨酸的工程菌包括大肠杆菌、透明无色杆菌、谷氨酸棒状杆菌、恶臭假单胞菌等。该方法是在发酵过程中直接加入细胞壁溶解酶，破坏其细胞壁，然后直接使用菌体裂解出来的酶, 同样也可以将所需的酶固定提纯化后再使用。而且酶法生产L -色氨酸过程中需要的前体物不是必须是自然原始材料，即使是化工合成的前体物也可以作为生产原料，这就大大降低了生产成本，与此同时，酶法合成还具有例如产物纯度高、副产物少、收率高、易操作等优点
[18]。
目前日本三井化学公司是世界色氨酸生产市场最大的公司之一。三井公司利用酶法来生产L -色氨酸所需要的原料主要是吲哚和丝氨酸。但是因为L -色氨酸合成酶和丝氨酸消旋酶活性较低，所以此法生产L -色氨酸的效率不高。不过以丙酮酸、吲哚和氨作为原料的酶法途径生产L -色氨酸, 由于丙氨酸的价格低廉，而且底物之一的吲哚对酶活性影响较小。所以此法有具有一定的应用前景和发展潜力。
2.2直接发酵法
直接发酵法的碳源供体是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为主, 采用高效的色氨酸生产菌株，控制发酵条件，直接积累L -色氨酸，因此直接发酵法也是微生物法的一种。但是因为在微生物体内，葡萄糖逐步代谢直至合成L -色氨酸的调控机制也比较复杂，一直以来都难以直接从自然界中获得高产的色氨酸生产菌株。所以，选育优良的菌种是直接发酵法能否成功的关键。另外，在微生物体内， L -色氨酸的生物合成途径代谢流很弱, 合成过程需要持续添加多种前体物L -丝氨酸、L -谷氨酰胺等, 若要获得可观的L -色氨酸产量只有将前体物维持在较高的比例才能达到目的。在L -色氨酸的生物合成过程中存在多种调节机制，不仅有反馈阻遏和反馈抑制等粗调节系统, 还有一种细调系统—弱化子系统[19]。近年来，
随着DNA 重组技术在微生物育种方面应用的越来越广泛，为构建高效的基因工程菌和产酸水平的提高提供了良好的技术支持，使直接发酵法逐渐成为了一种低成本的工业化生产方法。
利用直接发酵法来生产L -色氨酸也有其自身不足之处，主要表现在产物复杂，造成后期目的产物分离提纯困难、工艺复杂等。不过随着代谢工程理论的发展，并且不断改善发酵工艺水平，直接发酵法生产L -色氨酸的效能越来越高，现在逐步进入产业化阶段。
2.3 微生物转化法
微生物转化法也可以称为前体转化法，主要是指利用葡萄糖作为碳源供体，然后培养微生物中，在培养过程中会不断产生L -色氨酸合成所需要的各种前体物，例如邻氨基苯甲酸、L -丝氨酸、吲哚等等。然后微生物会利用这些前体物在自身色氨酸合成酶的作用下合成色氨酸。工业化生产L-色氨酸企业最早就是利用这种方法来大规模获得L -色氨酸。日本昭和电工公司利用芽袍杆菌和汉逊氏酵母菌种，在其培养环境中添加邻氨基苯甲酸，来获得L-色氨酸。为了使L-色氨酸过量积累，需要解除芳香族氨基酸代谢过程中多种底物的反馈抑制。此法生产L-色氨酸的过程中不宜添加过多的前体物，容易产生反馈抑制，因此厂家大多采用分批补料的方法来持续不断的添加前体物。微生物前体转化法也存在不足之处，前体物的价格昂贵，不利于控制成本[20]。而且当前体物浓度过高时，会反馈抑制合成过程中酶的活性，影响色氨酸的的积累效率。
3 L-色氨酸高产色氨酸菌株的构建策略
3.1 增加前体物
如图2所示，以大肠杆菌为例，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP ）和4-磷酸赤藓糖（E4P ）是L -色氨酸合成过程中最重要的两种前体物质。在中心代谢途径中，ppsA 基因和tktA 基因分别对PEP 和E4P 的合成具有非常关键的作用，其中PEP 的积累主要通过磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(pps ) 催化一部分丙酮酸重新转化为 PEP ，而E4P 的合成则通过转醛酶（tal ）和转酮酶（tkt ）的催化。在大肠杆菌中，转酮酶有两个同工酶，分别由tktA 和tktB 编码，其中tktA 同工酶对E4P 的合成
反应起主要作用。
图2. 大肠杆菌中 L-色氨酸的合成途径及相关调控[25]
Fig.2 L-tryptophan synthesis pathway in E.coli and related regulation
2008年，王静[21]等克隆的tktA 和ppsA 基因序列, 构建重组质粒
pZA31-ppsA-tktA ，工程菌ppsA 和tktA 酶活性（U ）与对照菌株比较，分别提高了3和3.5倍；L -色氨酸的产量则比对照菌株的产量提高了1.3倍。
3.2 切断代谢支路及降解途径
大肠杆菌的芳香族氨基酸的代谢途径中，从PEP 和E4P 在DAHP 合成酶的催化作用下进行一系列反应，经过分支酸，然后开始分别合成L -色氨酸、L -苯丙氨酸和L -酪氨酸。作为L -色氨酸合成的竞争途径，在L -苯丙氨酸/L -酪氨酸的合成过程中，需要预苯酸脱水酶和预苯酸脱氢酶的参与，这两个酶分别有
pheA
基因和tyrA 基因编码。如果敲除这两个基因，会使芳香族氨基酸代谢过程中的碳循环流向L -色氨酸合成的方向，进而能够达到提高L-色氨酸产量的目的。在微生物体内，L -色氨酸可以在色氨酸酶的作用下，降解为吲哚，而且这是微生物体内色氨酸降解的主要途径，色氨酸酶是由tnaA 基因编码合成，采取基因敲除策略，敲除tnaA 基因，可以消除色氨酸的降解反应，同样可以达到提高色氨酸产量的目的。
2008年，于金龙[22]等首先敲除trpR 基因, 去除基因组上色氨酸合成过程中受到的反馈阻遏调控, 然后又进一步敲除tnaA 基因, 阻断了色氨酸分解代谢, 工程菌经过这两次改造后,L-色氨酸产量有了不同程度的提高。
3.3 转运途径的改造
在大肠杆菌中，aroP 、pheP 、tyrP 、mtr 和tnaB 基因控制了L-苯丙氨酸、L -酪氨酸和L-色氨酸在细胞内外的转运机制。其中，L-色氨酸的转运由mtr 和tnaB 基因控制，苯丙氨酸和酪氨酸的转运由pheP 和tyrP 控制，不过aroP 可以同时转运这三种芳香族氨基酸。同时有研究表明，如果微生物体内L -色氨酸的合成量升高，其所受到的调控作用就会越强[23]。
赵志军[24]等分别构建双基因敲除菌和三基因敲除菌，双基因敲除菌分别敲除mtr 、tnaB 和mtr 、aroP ，三基因敲除菌是敲除mtr 、tnaB 、aroP 三个基因，分别进行发酵检测，观察转运基因对于色氨酸产量的影响，最终得到以下结果：双基因缺失菌相对于原始菌的L -色氨酸产量分别上升了17%和9%,不过三个基因都缺失的突变菌株无法正常生长。
4 L-色氨酸的产业现状及其发展前景
目前, 国外大规模工业化生产L -色氨酸的企业主要有德国德固赛、日本协和发酵工业公司、日本三井化学公司和日本昭和电工等。其中德国德固赛采用微生物法和合成法相结合来生产L-色氨酸, 而日本的三家公司则都采用微生物法来生产L -色氨酸。日本将生物技术应用于L -色氨酸的生产, 目的是推广L -色氨酸在饲料添加剂方面的应用，并于1989年批准将重组菌株用于L -色氨酸的生产。
2005年国际市场对L-色氨酸的需求量是1800吨/年，其中医药行业的需求量为500吨/年。由于L-色氨酸在医药、饲料、食品、农业等方面的应用越来越广泛，目前L-色氨酸市场一千吨左右的年产量远远不能满足国际市场约为120
万吨/年的L-色氨酸需求量，而且主要产地集中在欧美、日本等少数地方, 因此，L -色氨酸具有非常大的市场发展潜力。但是由于技术水平的限制，我国生产L -色氨酸的能力还不能与国际先进厂家相比。目前国内能够小规模提供L -色氨酸厂家主要有鲁抗医药、升华拜克、丰原生物等，而且主要是应用于医药行业，相当大的一部分还是依赖于国外进口。另外，由于成本高昂的缘故，我国还没有将L -色氨酸应用到饲料添加剂行业。
L -色氨酸的重要性也越来越受到人们的重视。而且现在L -色氨酸的应用不仅局限在传统的医药，食品，饲料添加剂行业，在一些新领域也逐渐有了更多应用，例如氨基酸美白剂逐渐应用到化妆品行业；作为健康饮品的许多氨基酸饮料不仅在欧美等发达国家流行，现在也逐渐开始进入我国的饮料市场，并为大众所接受。
随着科学技术的进步，相信人们对色氨酸的用途会有更多的探究和发现。而且随着基因工程，代谢工程以及定向进化技术的发展，我们可以更好地了解色氨酸的生物合成途径及调控机制，进一步加强优良的产酸菌株的构建，结合发酵工艺的不断完善，L -色氨酸的市场前景令人乐观。
参考文献：
[1] 李剑欣，张绪梅，徐琪寿. 色氨酸的生理生化作用及其应用[J].氨基酸和生物资源.2005,27(3):58-62.
[2] 宋文霞，王瑞明. L-色氨酸的研究[J]. 农业品加工,2005,34(3):18-21.
[3] Wolfgang Leuchtenberger, Klau Huthmacher. Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69(10):1-8.
[4] 陈涛, 陈宁. L-色氨酸的生产及其代谢控制育种[J].生物技术通讯. 2000，11(2):141-145.
[5] 翁辉康，周路德，L-色氨酸的临床应用[J]:广州医药，1990(3)49-50.
[6] Ray JM, Bauerle R. Purification and properties of tryptophan-sensitive 3-deoxy- D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase from Escherichia coli [J]. Journal of bacteriology. 1991,173 (6) :1894-1901.
[7] Sloan MJ, Phillips RS. Effects of alpha-deuteration and of aza and thia analogs of L-tryptophan on formation of intermediates in the reaction of Escherichia coli trypto- phan indole-lyase [J]. Biochemistry. 1996,35(50):16165-16173.
[8] 宋波. 色氨酸的合成及其应用[J]. 广东化工.1989，(4):11-17.
[9] 张伟国, 钱和. 氨基酸生产技术及其应用[J].中国轻工业出版社.1997.
[10] 崔芹, 崔山. 色氨酸营养研究进展[J].中国词料.2003,15:20-23.
[11] Chung JW, Webster DA,Pagilla KR, et al. Chromosomal integration of the Wreoscilla hemoglobin gene in Burkholderia and Pseudomonas for the purpose of producing stable engineered strains with enhanced bioremediating ability[J]. Journal of industrial microbiology & biotechnology. 2001，27(1):27-33.
[12] 刘风俊, 宋述清. 色氨酸的生物学作用[J].佳木斯医学院学报1992,(01)：65-69.
[13] 刘丽梅, 孙文志. 色氨酸的营养生理学作用[J].饲料博览.1995，(2):23-24.
[14] Ikeda M. Towards bacterial strains overproducing L-tryptophan and other aromatics by metabolic engineering [J]. Applied Microbiology and Biotechnology. 2005,69(6):615-626.
[15] 赵春光, 程立坤, 徐庆阳. 微生物法生产L-色氨酸的研究进展[J].发酵科技通讯.2008, (4):34-36.
[16] Bandyopadhyay P, Saha K. Surfactant-induced fluorescent sensor activity enhan-cement of tryptophan at various pH[J]. Chemical Physics Letters, 2008, 457(1-3):227-231.
[17] 葛权松, 郁宝平. 必需氨基酸L-色氨酸营养的研究[J].畜牧与兽医.1995,27
(4):228-230.
[18] 张蓓(2003). 代谢工程. 天津大学出版社.
[19] 朱玉贤, 李毅, 郑晓峰. 现代分子生物学[M].高等教育出版社,2007.
[20] 姜娜, 王芃, 王艳春, 等. 利用 Red 重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH 基因
[J]. 生物技术通讯, 2009, 20(2): 174-177.
[21] 王静，于金龙，张婷，郭长江，徐琪寿，黄英武. 大肠杆菌生物合成中心代谢途径的改造及其对工程菌色氨酸产量的影响[J]. 中国医药生物技术，2008,3
（2）：93-97.
[22] 于金龙, 王静, 李剑欣, 郭长江, 黄英武, 徐琪寿. 大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控研究[J].生物工程学报，2008,24(5): 844-850.
[23] Azuma S, Tsunekawa H, Okabe M, et al. Hyper-production of L-tryptophanvia fermentation with crystallization[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1993,39(4):471-476.
[24] 赵志军, 陈晟, 吴丹, 吴敬, 陈坚. 大肠杆菌色氨酸转运系统多基因敲除对色氨酸生产的影响[J].生物工程学报,2011,27(12):1765−1772.
[25] 张克旭.
氨基酸发酵工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,1992.
L-色氨酸的研究进展
陈荣庆 刘伟 皮雄娥 王欣
11222，* （浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004；浙江省农业科学院植物保护与
微生物研究所，浙江杭州 310021）
摘要：L-色氨酸在医药、食品、饲料添加剂以及环境监测等方面的应用越来越广泛。详细介介绍了酶法，直接发酵法，微生物转化法等生产L-色氨酸的方法。随着市场需求的增大，L-色氨酸的应用研究逐渐成为一项新的热点。
关键词： L-色氨酸； 应用； 生产方法
中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：
The study progress of L–tryptophan
CHEN Rong-qing1， LIU Wei2 ，PI Xiong-e2 ，W ANG Xin2，* 2
（1College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal Univeristy，Jinhua 1 321004，China ；2Institute of Plant Protection and Microbiology ，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences ，Hangzhou 310021，China ）
Abstract: L-tryptophan has more and more application in medicine，food ，feed additives， and the environmental monitoring ，etc. There are some detail introduces about the production method of L – tryptophan，such as the enzymatic，direct fermentation， microbial reforming process. With the increase of market demand, the application of L-tryptophan study gradually become a new hot spot.
Key words: L-tryptophan ；Application ； Production methods ；
1作者简介:陈荣庆( 1988－ ) ，男，山东人，硕士研究生，主要从事
微生物与分子生物学的研究。Tel:[1**********] E-mail: chenrongqing69@
163.com
*通讯作者：王欣，Tel: 0571－86415126；E-mail: [email protected]
色氨酸的化学名称为α-氨基-β-吲哚丙酸，有三种同分异构体：L 型、D 型和消旋体DL 型[1]。1825年，色氨酸首次被发现，1902年，由Hokinst 首次从酪蛋白中分离获得。其分子式为C 11H 12N 2O 2，分子量为204.23，白色晶体或者微黄色片状晶体或粉末。无味，右旋体或有特殊甜味，溶于水或者热乙醇，不溶于氯仿、乙醚，在稀酸或稀碱中较稳定。与水一起加热，会产生少量吲哚，在有NaOH 、CuSO 4存在的条件下加热，则会分解产生大量吲哚。若迅速加热至210℃时颜色会变黄，290℃时发生分解反应，长时间光照则会发生着色反应。L -色氨酸结构图式:
图1 色氨酸结构式
Fig.1 the Structure of tryptophan
L -色氨酸是人体和动物所必需的8种必需氨基酸之一，不能通过自身合成。所以，人和动物只能通过食物来摄取L-色氨酸。D -色氨酸主要存在于植物和微生物之中，动物中含量极少, 而且在人体内几乎不发生代谢作用, 也无毒性[2]。
L -色氨酸又被称为第二必需氨基酸，目前广泛应用医药，食品、饲料添加剂以及农业环境检测等行业[3]。近年来，随着国内饲料工业发展迅速，以及L-色氨酸及其代谢产物研究的越来越深入，尤其是随着我国老龄化程度不断加重，其在医药行业上的用途也不断扩大，L-色氨酸逐渐成为一种国际市场发展潜力巨大、国内市场需求较大的产品。本文就L-色氨酸在各行业的应用，生产方法, 高产菌构建策略以及市场现状和前景作一综述。
1 L-色氨酸的应用
1.1 L-色氨酸在医药研究的应用
L -色氨酸在医药行业的应用一直是医药界的研究热点。L -色氨酸及其代谢产物能够广泛参与到生物体内的新陈代谢过程, 在L-色氨酸的分解代谢过程中可以产生多种生理活性物质，如5-羟色胺(5-HT )
、色素、烟酸、吲哚乙酸、生
物碱、辅酶、褪黑素和植物激素等[4]。这些代谢产物能够广泛参与到人体的各项生理活动，同时会参与众多的生理调节。近年来研究发现，L-色氨酸不只用来制作氨基酸注射液，对于抑郁症、高血压及止痛都有良好的效果，在欧美一些国家已经广泛应用于临床治疗[5]。
作为L -色氨酸的重要代谢产物之一，5-HT 是人体中枢神经系统的重要神经递质, 能够调节人体精神活动, 同时控制神经系统的兴奋表达。如果人体内血液中L -色氨酸水平下降, 就会引起脑部5-HT 供应不足, 使人们产生抑郁、自责等情绪, 所以在抑郁症患者体内通常会发现5-HT 供应不足的现象，所以在抑郁症患者的治疗过程中，积极补充L-色氨酸，患者大脑内5-HT 的含量会相对应的提高, 患者情绪会得到良好的控制，病情得到明显缓解[6-7]。L -色氨酸在英国已经被列为抗抑郁剂。
临床研究发现，L -色氨酸与铁剂、维生素合用可增强它们治疗运动性贫血的疗效；与组氨酸一起使用还可以治疗消化道溃疡[8]。
1.2 L-色氨酸在饲料添加剂行业的应用
L -色氨酸是饲料市场上的除酪氨酸和蛋氨酸之外的三大氨基酸饲料添加剂之一。如果禽类体内L -色氨酸供应不足时, 动物体内会出现一系列不适应症状，如脂肪积累速度减缓、机体生长缓慢、而且公畜有时候会出现睾丸发育不良等现象[9]。而且，在饲料中添加微量的L -色氨酸就可以达到促进动物体体重增加的目的，具有良好的效果。
L -色氨酸可以参与体内脂肪代谢、降低动物肝脏脂肪含量, 从而达到提高禽畜肉类的瘦肉比例的目的[10]，还可以降低禽畜发生攻击性行为的可能性[11]。作为L-色氨酸中间代谢产物之一的尼克酰胺, 将其制成饲料添加剂，能够显著提高家禽的生长速度，同时可以预防动物体发生尼克酸胺缺乏症[12]。另外一种代谢中间物5-羟色胺可以促进动物体产生γ-球蛋白、增强禽畜的抗病能力等[13]。虽然L -色氨酸作为饲料添加剂的效果良好，但是在大规模应用方面还是有其不足之处。主要是因为目前色氨酸生产工艺水平不高，不能大规模的生产L -色氨酸，所以存在成本限制。所以现在只是应用到仔猪饲料添加剂中。日本市场的L -色
氨酸年需求量已经从前几年的不到10t 提高到现在的30t 以上。目前饲用氨基酸的开发主要是在日本市场。
1.3 L-色氨酸在食品行业的应用
人体也不能自身合成L -色氨酸，为了满足自身需要，需要从外界获取L -色氨酸，而这个来源主要就是食物来源。L-色氨酸在人及动物的体内代谢过程发挥着重要的作用，所以L -色氨酸又称为第二必需氨基酸。L -色氨酸在食物添加剂的应用方面现在越来越受到人们的重视。在国内外很多地方，已经将L -色氨酸制作为食品添加剂，人体摄入之后会对人体生理活动有许多积极作用，比如可以提高机体对植物蛋白的利用效率，加速蛋白分解利用[14]。另外，L -色氨酸容易与金属离子发生作用, 作为一种螯合剂来使用时，经常用作防腐剂，添加到奶粉中防止变质或用作鱼类保鲜剂[15]。
1.4 L-色氨酸在农业以及环境监测方面的应用
L -色氨酸在农业害虫防治方面也有一定应用，例如L -色氨酸可以使南方毛虫拒食死亡。L -色氨酸还可以加入到水杨酸和环磷酸中作为稳定剂, 能够增强其杀虫效果[8]。色氨酸具有吲哚环, 具有良好的荧光吸收性, 是荧光性最强的氨基酸, 因此可用于检测生物生态系统及自然环境中有毒金属离子(如Cu 2+,As 3+,Pb 2+) 。色氨酸对环境有高度敏感性，某些物质极微小的极性变化也可以使吸收光谱发生变化，因此, 将色氨酸作为极性探针, 可以检测环境中某些成分的极性变化[16]。 2 L-色氨酸的生产方法研究
传统生产L -色氨酸的方法主要是化学合成法和蛋白质水解法，但是这些方法有不足之处，主要表现在周期长、原材料成本较高、产物不宜分离提纯等[17]。随着生产技术的不断进步，现在占据市场主导地位的方法是很多公司采用的微生物法生产L -色氨酸。微生物法主要包括酶法、直接发酵法和微生物转化法。
2.1 酶法
酶法主要是指利用微生物中的L -色氨酸生物合成酶系的催化功能来生产L -色氨酸。酶法生产L -色氨酸的方法主要用到的酶包括色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。根据提供所需酶的微生物种类数，酶法主要分为单菌酶法和双菌酶法。
现在工业生产L -色氨酸的工程菌包括大肠杆菌、透明无色杆菌、谷氨酸棒状杆菌、恶臭假单胞菌等。该方法是在发酵过程中直接加入细胞壁溶解酶，破坏其细胞壁，然后直接使用菌体裂解出来的酶, 同样也可以将所需的酶固定提纯化后再使用。而且酶法生产L -色氨酸过程中需要的前体物不是必须是自然原始材料，即使是化工合成的前体物也可以作为生产原料，这就大大降低了生产成本，与此同时，酶法合成还具有例如产物纯度高、副产物少、收率高、易操作等优点
[18]。
目前日本三井化学公司是世界色氨酸生产市场最大的公司之一。三井公司利用酶法来生产L -色氨酸所需要的原料主要是吲哚和丝氨酸。但是因为L -色氨酸合成酶和丝氨酸消旋酶活性较低，所以此法生产L -色氨酸的效率不高。不过以丙酮酸、吲哚和氨作为原料的酶法途径生产L -色氨酸, 由于丙氨酸的价格低廉，而且底物之一的吲哚对酶活性影响较小。所以此法有具有一定的应用前景和发展潜力。
2.2直接发酵法
直接发酵法的碳源供体是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为主, 采用高效的色氨酸生产菌株，控制发酵条件，直接积累L -色氨酸，因此直接发酵法也是微生物法的一种。但是因为在微生物体内，葡萄糖逐步代谢直至合成L -色氨酸的调控机制也比较复杂，一直以来都难以直接从自然界中获得高产的色氨酸生产菌株。所以，选育优良的菌种是直接发酵法能否成功的关键。另外，在微生物体内， L -色氨酸的生物合成途径代谢流很弱, 合成过程需要持续添加多种前体物L -丝氨酸、L -谷氨酰胺等, 若要获得可观的L -色氨酸产量只有将前体物维持在较高的比例才能达到目的。在L -色氨酸的生物合成过程中存在多种调节机制，不仅有反馈阻遏和反馈抑制等粗调节系统, 还有一种细调系统—弱化子系统[19]。近年来，
随着DNA 重组技术在微生物育种方面应用的越来越广泛，为构建高效的基因工程菌和产酸水平的提高提供了良好的技术支持，使直接发酵法逐渐成为了一种低成本的工业化生产方法。
利用直接发酵法来生产L -色氨酸也有其自身不足之处，主要表现在产物复杂，造成后期目的产物分离提纯困难、工艺复杂等。不过随着代谢工程理论的发展，并且不断改善发酵工艺水平，直接发酵法生产L -色氨酸的效能越来越高，现在逐步进入产业化阶段。
2.3 微生物转化法
微生物转化法也可以称为前体转化法，主要是指利用葡萄糖作为碳源供体，然后培养微生物中，在培养过程中会不断产生L -色氨酸合成所需要的各种前体物，例如邻氨基苯甲酸、L -丝氨酸、吲哚等等。然后微生物会利用这些前体物在自身色氨酸合成酶的作用下合成色氨酸。工业化生产L-色氨酸企业最早就是利用这种方法来大规模获得L -色氨酸。日本昭和电工公司利用芽袍杆菌和汉逊氏酵母菌种，在其培养环境中添加邻氨基苯甲酸，来获得L-色氨酸。为了使L-色氨酸过量积累，需要解除芳香族氨基酸代谢过程中多种底物的反馈抑制。此法生产L-色氨酸的过程中不宜添加过多的前体物，容易产生反馈抑制，因此厂家大多采用分批补料的方法来持续不断的添加前体物。微生物前体转化法也存在不足之处，前体物的价格昂贵，不利于控制成本[20]。而且当前体物浓度过高时，会反馈抑制合成过程中酶的活性，影响色氨酸的的积累效率。
3 L-色氨酸高产色氨酸菌株的构建策略
3.1 增加前体物
如图2所示，以大肠杆菌为例，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP ）和4-磷酸赤藓糖（E4P ）是L -色氨酸合成过程中最重要的两种前体物质。在中心代谢途径中，ppsA 基因和tktA 基因分别对PEP 和E4P 的合成具有非常关键的作用，其中PEP 的积累主要通过磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(pps ) 催化一部分丙酮酸重新转化为 PEP ，而E4P 的合成则通过转醛酶（tal ）和转酮酶（tkt ）的催化。在大肠杆菌中，转酮酶有两个同工酶，分别由tktA 和tktB 编码，其中tktA 同工酶对E4P 的合成
反应起主要作用。
图2. 大肠杆菌中 L-色氨酸的合成途径及相关调控[25]
Fig.2 L-tryptophan synthesis pathway in E.coli and related regulation
2008年，王静[21]等克隆的tktA 和ppsA 基因序列, 构建重组质粒
pZA31-ppsA-tktA ，工程菌ppsA 和tktA 酶活性（U ）与对照菌株比较，分别提高了3和3.5倍；L -色氨酸的产量则比对照菌株的产量提高了1.3倍。
3.2 切断代谢支路及降解途径
大肠杆菌的芳香族氨基酸的代谢途径中，从PEP 和E4P 在DAHP 合成酶的催化作用下进行一系列反应，经过分支酸，然后开始分别合成L -色氨酸、L -苯丙氨酸和L -酪氨酸。作为L -色氨酸合成的竞争途径，在L -苯丙氨酸/L -酪氨酸的合成过程中，需要预苯酸脱水酶和预苯酸脱氢酶的参与，这两个酶分别有
pheA
基因和tyrA 基因编码。如果敲除这两个基因，会使芳香族氨基酸代谢过程中的碳循环流向L -色氨酸合成的方向，进而能够达到提高L-色氨酸产量的目的。在微生物体内，L -色氨酸可以在色氨酸酶的作用下，降解为吲哚，而且这是微生物体内色氨酸降解的主要途径，色氨酸酶是由tnaA 基因编码合成，采取基因敲除策略，敲除tnaA 基因，可以消除色氨酸的降解反应，同样可以达到提高色氨酸产量的目的。
2008年，于金龙[22]等首先敲除trpR 基因, 去除基因组上色氨酸合成过程中受到的反馈阻遏调控, 然后又进一步敲除tnaA 基因, 阻断了色氨酸分解代谢, 工程菌经过这两次改造后,L-色氨酸产量有了不同程度的提高。
3.3 转运途径的改造
在大肠杆菌中，aroP 、pheP 、tyrP 、mtr 和tnaB 基因控制了L-苯丙氨酸、L -酪氨酸和L-色氨酸在细胞内外的转运机制。其中，L-色氨酸的转运由mtr 和tnaB 基因控制，苯丙氨酸和酪氨酸的转运由pheP 和tyrP 控制，不过aroP 可以同时转运这三种芳香族氨基酸。同时有研究表明，如果微生物体内L -色氨酸的合成量升高，其所受到的调控作用就会越强[23]。
赵志军[24]等分别构建双基因敲除菌和三基因敲除菌，双基因敲除菌分别敲除mtr 、tnaB 和mtr 、aroP ，三基因敲除菌是敲除mtr 、tnaB 、aroP 三个基因，分别进行发酵检测，观察转运基因对于色氨酸产量的影响，最终得到以下结果：双基因缺失菌相对于原始菌的L -色氨酸产量分别上升了17%和9%,不过三个基因都缺失的突变菌株无法正常生长。
4 L-色氨酸的产业现状及其发展前景
目前, 国外大规模工业化生产L -色氨酸的企业主要有德国德固赛、日本协和发酵工业公司、日本三井化学公司和日本昭和电工等。其中德国德固赛采用微生物法和合成法相结合来生产L-色氨酸, 而日本的三家公司则都采用微生物法来生产L -色氨酸。日本将生物技术应用于L -色氨酸的生产, 目的是推广L -色氨酸在饲料添加剂方面的应用，并于1989年批准将重组菌株用于L -色氨酸的生产。
2005年国际市场对L-色氨酸的需求量是1800吨/年，其中医药行业的需求量为500吨/年。由于L-色氨酸在医药、饲料、食品、农业等方面的应用越来越广泛，目前L-色氨酸市场一千吨左右的年产量远远不能满足国际市场约为120
万吨/年的L-色氨酸需求量，而且主要产地集中在欧美、日本等少数地方, 因此，L -色氨酸具有非常大的市场发展潜力。但是由于技术水平的限制，我国生产L -色氨酸的能力还不能与国际先进厂家相比。目前国内能够小规模提供L -色氨酸厂家主要有鲁抗医药、升华拜克、丰原生物等，而且主要是应用于医药行业，相当大的一部分还是依赖于国外进口。另外，由于成本高昂的缘故，我国还没有将L -色氨酸应用到饲料添加剂行业。
L -色氨酸的重要性也越来越受到人们的重视。而且现在L -色氨酸的应用不仅局限在传统的医药，食品，饲料添加剂行业，在一些新领域也逐渐有了更多应用，例如氨基酸美白剂逐渐应用到化妆品行业；作为健康饮品的许多氨基酸饮料不仅在欧美等发达国家流行，现在也逐渐开始进入我国的饮料市场，并为大众所接受。
随着科学技术的进步，相信人们对色氨酸的用途会有更多的探究和发现。而且随着基因工程，代谢工程以及定向进化技术的发展，我们可以更好地了解色氨酸的生物合成途径及调控机制，进一步加强优良的产酸菌株的构建，结合发酵工艺的不断完善，L -色氨酸的市场前景令人乐观。
参考文献：
[1] 李剑欣，张绪梅，徐琪寿. 色氨酸的生理生化作用及其应用[J].氨基酸和生物资源.2005,27(3):58-62.
[2] 宋文霞，王瑞明. L-色氨酸的研究[J]. 农业品加工,2005,34(3):18-21.
[3] Wolfgang Leuchtenberger, Klau Huthmacher. Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69(10):1-8.
[4] 陈涛, 陈宁. L-色氨酸的生产及其代谢控制育种[J].生物技术通讯. 2000，11(2):141-145.
[5] 翁辉康，周路德，L-色氨酸的临床应用[J]:广州医药，1990(3)49-50.
[6] Ray JM, Bauerle R. Purification and properties of tryptophan-sensitive 3-deoxy- D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase from Escherichia coli [J]. Journal of bacteriology. 1991,173 (6) :1894-1901.
[7] Sloan MJ, Phillips RS. Effects of alpha-deuteration and of aza and thia analogs of L-tryptophan on formation of intermediates in the reaction of Escherichia coli trypto- phan indole-lyase [J]. Biochemistry. 1996,35(50):16165-16173.
[8] 宋波. 色氨酸的合成及其应用[J]. 广东化工.1989，(4):11-17.
[9] 张伟国, 钱和. 氨基酸生产技术及其应用[J].中国轻工业出版社.1997.
[10] 崔芹, 崔山. 色氨酸营养研究进展[J].中国词料.2003,15:20-23.
[11] Chung JW, Webster DA,Pagilla KR, et al. Chromosomal integration of the Wreoscilla hemoglobin gene in Burkholderia and Pseudomonas for the purpose of producing stable engineered strains with enhanced bioremediating ability[J]. Journal of industrial microbiology & biotechnology. 2001，27(1):27-33.
[12] 刘风俊, 宋述清. 色氨酸的生物学作用[J].佳木斯医学院学报1992,(01)：65-69.
[13] 刘丽梅, 孙文志. 色氨酸的营养生理学作用[J].饲料博览.1995，(2):23-24.
[14] Ikeda M. Towards bacterial strains overproducing L-tryptophan and other aromatics by metabolic engineering [J]. Applied Microbiology and Biotechnology. 2005,69(6):615-626.
[15] 赵春光, 程立坤, 徐庆阳. 微生物法生产L-色氨酸的研究进展[J].发酵科技通讯.2008, (4):34-36.
[16] Bandyopadhyay P, Saha K. Surfactant-induced fluorescent sensor activity enhan-cement of tryptophan at various pH[J]. Chemical Physics Letters, 2008, 457(1-3):227-231.
[17] 葛权松, 郁宝平. 必需氨基酸L-色氨酸营养的研究[J].畜牧与兽医.1995,27
(4):228-230.
[18] 张蓓(2003). 代谢工程. 天津大学出版社.
[19] 朱玉贤, 李毅, 郑晓峰. 现代分子生物学[M].高等教育出版社,2007.
[20] 姜娜, 王芃, 王艳春, 等. 利用 Red 重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH 基因
[J]. 生物技术通讯, 2009, 20(2): 174-177.
[21] 王静，于金龙，张婷，郭长江，徐琪寿，黄英武. 大肠杆菌生物合成中心代谢途径的改造及其对工程菌色氨酸产量的影响[J]. 中国医药生物技术，2008,3
（2）：93-97.
[22] 于金龙, 王静, 李剑欣, 郭长江, 黄英武, 徐琪寿. 大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控研究[J].生物工程学报，2008,24(5): 844-850.
[23] Azuma S, Tsunekawa H, Okabe M, et al. Hyper-production of L-tryptophanvia fermentation with crystallization[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1993,39(4):471-476.
[24] 赵志军, 陈晟, 吴丹, 吴敬, 陈坚. 大肠杆菌色氨酸转运系统多基因敲除对色氨酸生产的影响[J].生物工程学报,2011,27(12):1765−1772.
[25] 张克旭.
氨基酸发酵工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,1992.