染色体步移技术（Genome Walking）
染色体步行是一种常用的克隆已知基因旁侧序列的技术。染色体步行是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸。
现有的染色体步行PCR 技术包括反向PCR 、锅柄PCR 、连接介导PCR 、热不对称PCR 、SON PCR等染色体步移技术主要有以下几方面的应用：
1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；
2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；
3. 鉴定 T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；
4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；
5. 用于人工染色体 PAC 、Y AC 和 BAC 的片段搭接。
其主要原理是根据已知 DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer ），与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称 PCR 反应。
现在有很多Genome Walking Kit，相应的说明书都介绍得很详尽，下面给你发一个原理图：
依据TaKaRa 的试剂盒，具体的操作步骤如下：
1. 基因组 DNA 的获取。
基因组 DNA 的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单
处理的基因
组 DNA （例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组
DNA 。此外，由于本方法灵敏度极高，模板 DNA 一定不要污染，所需的 DNA 量不要少于 3 μg。
2. 已知序列的验证。
在进行 PCR 实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序
列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500 bp），对模板进行 PCR 扩增，然后对 PCR 产物进行测
序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。
3. 特异性引物的设计。
根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3。
4. 1st PCR 反应。
基因组 DNA 经 OD 测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应 DNA 量并不相同，实际
用量参考下面的注*1），以 AP Primer （四种中的任意一种，以下以 AP1 Primer 为例）作为上游引
物，SP1 Primer 为下游引物，进行 1st PCR 反应。
① 按下列组份配制 1st PCR反应液。
Template （基因组 DNA ） x ng *1
dNTP Mixture（2.5 mΜ each ） 8 μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 5 μl
TaKaRa LA Taq （5 U/μl） 0.5 μl
AP1 Primer（100 pmol/μl） 1 μl
SP1 Primer（10 pmol/μl） 1 μl
dH2O up to 50 μl
② 1st PCR 反应条件如下：
94℃ 1 min
98℃ 1 min
94℃ 30 sec
60~68℃*2 1 min 5 Cycles
72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 25℃ 3 min； 72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3 15 Cycles
94℃ 30 sec； 44℃ 1 min； 72℃ 2~4 min*3
72℃ 10 min
5. 2nd PCR 反应。
将 1st PCR反应液稀释 1~1000 倍后，取 1 μl作为 2nd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引
物，SP2 Primer为下游引物，进行 2nd
PCR 反应。
① 按下列组份配制 2nd PCR反应液。
Template （1st PCR反应液） 1 μl *4
dNTP Mixture（2.5 mΜ each ) 8 μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 5 μl
TaKaRa LA Taq （5 U/μl） 0.5 μl
AP1 Primer（100 pmol/μl） 1 μl
SP2 Primer（10 pmol/μl） 1 μl
dH2O up to 50 μl
② 2nd PCR 反应条件如下：
94℃ 30 sec； 60~68℃ 1 min*2； 72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 60~68℃ 1 min*2； 72℃ 2~4 min*3 15 Cycles
94℃ 30 sec； 44℃ 1 min ； 72℃ 2~4 min*3
72℃ 10 min
6. 3rd PCR 反应。
将 2nd PCR反应液稀释 1~1000 倍后，取 1 μl作为 3rd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引
物，SP3 Primer为下游引物，进行 3rd
PCR 反应。
① 按下列组份配制 3rd PCR反应液。
Template （2nd PCR 反应液） 1 μl *4
dNTP Mixture（2.5 mΜ each ) 8 μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 5 μl
TaKaRa LA Taq （5 U/μl） 0.5 μl
AP1 Primer（100 pmol/μl） 1 μl
SP3 Primer（10 pmol/μl） 1 μl
dH2O up to 50 μl
② 3rd PCR 反应条件如下：
94℃ 30 sec； 60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3 15 Cycles
94℃ 30 sec； 44℃ 1 min； 72℃ 2~4 min*3
72℃ 10 min
7. 取 1st ，2nd ，3rd
PCR 反应液各 5 μl，使用 1％的琼脂糖凝胶进行电泳。
8. 切胶回收清晰的电泳条带，以 SP3 Primer 为引物对 PCR 产物进行 DNA 测序。
染色体步移技术（Genome Walking）
染色体步行是一种常用的克隆已知基因旁侧序列的技术。染色体步行是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸。
现有的染色体步行PCR 技术包括反向PCR 、锅柄PCR 、连接介导PCR 、热不对称PCR 、SON PCR等染色体步移技术主要有以下几方面的应用：
1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；
2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；
3. 鉴定 T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；
4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；
5. 用于人工染色体 PAC 、Y AC 和 BAC 的片段搭接。
其主要原理是根据已知 DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer ），与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称 PCR 反应。
现在有很多Genome Walking Kit，相应的说明书都介绍得很详尽，下面给你发一个原理图：
依据TaKaRa 的试剂盒，具体的操作步骤如下：
1. 基因组 DNA 的获取。
基因组 DNA 的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单
处理的基因
组 DNA （例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组
DNA 。此外，由于本方法灵敏度极高，模板 DNA 一定不要污染，所需的 DNA 量不要少于 3 μg。
2. 已知序列的验证。
在进行 PCR 实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序
列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500 bp），对模板进行 PCR 扩增，然后对 PCR 产物进行测
序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。
3. 特异性引物的设计。
根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3。
4. 1st PCR 反应。
基因组 DNA 经 OD 测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应 DNA 量并不相同，实际
用量参考下面的注*1），以 AP Primer （四种中的任意一种，以下以 AP1 Primer 为例）作为上游引
物，SP1 Primer 为下游引物，进行 1st PCR 反应。
① 按下列组份配制 1st PCR反应液。
Template （基因组 DNA ） x ng *1
dNTP Mixture（2.5 mΜ each ） 8 μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 5 μl
TaKaRa LA Taq （5 U/μl） 0.5 μl
AP1 Primer（100 pmol/μl） 1 μl
SP1 Primer（10 pmol/μl） 1 μl
dH2O up to 50 μl
② 1st PCR 反应条件如下：
94℃ 1 min
98℃ 1 min
94℃ 30 sec
60~68℃*2 1 min 5 Cycles
72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 25℃ 3 min； 72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3 15 Cycles
94℃ 30 sec； 44℃ 1 min； 72℃ 2~4 min*3
72℃ 10 min
5. 2nd PCR 反应。
将 1st PCR反应液稀释 1~1000 倍后，取 1 μl作为 2nd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引
物，SP2 Primer为下游引物，进行 2nd
PCR 反应。
① 按下列组份配制 2nd PCR反应液。
Template （1st PCR反应液） 1 μl *4
dNTP Mixture（2.5 mΜ each ) 8 μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 5 μl
TaKaRa LA Taq （5 U/μl） 0.5 μl
AP1 Primer（100 pmol/μl） 1 μl
SP2 Primer（10 pmol/μl） 1 μl
dH2O up to 50 μl
② 2nd PCR 反应条件如下：
94℃ 30 sec； 60~68℃ 1 min*2； 72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 60~68℃ 1 min*2； 72℃ 2~4 min*3 15 Cycles
94℃ 30 sec； 44℃ 1 min ； 72℃ 2~4 min*3
72℃ 10 min
6. 3rd PCR 反应。
将 2nd PCR反应液稀释 1~1000 倍后，取 1 μl作为 3rd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引
物，SP3 Primer为下游引物，进行 3rd
PCR 反应。
① 按下列组份配制 3rd PCR反应液。
Template （2nd PCR 反应液） 1 μl *4
dNTP Mixture（2.5 mΜ each ) 8 μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 5 μl
TaKaRa LA Taq （5 U/μl） 0.5 μl
AP1 Primer（100 pmol/μl） 1 μl
SP3 Primer（10 pmol/μl） 1 μl
dH2O up to 50 μl
② 3rd PCR 反应条件如下：
94℃ 30 sec； 60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3
94℃ 30 sec； 60~68℃*2 1 min； 72℃ 2~4 min*3 15 Cycles
94℃ 30 sec； 44℃ 1 min； 72℃ 2~4 min*3
72℃ 10 min
7. 取 1st ，2nd ，3rd
PCR 反应液各 5 μl，使用 1％的琼脂糖凝胶进行电泳。
8. 切胶回收清晰的电泳条带，以 SP3 Primer 为引物对 PCR 产物进行 DNA 测序。