实验三 水体富营养化程度的评价
富营养化(eutrophication)是指在人类活动的影响下，生物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡的现象。在自然条件下，湖泊也会从贫营养状态过渡到富营养状态，沉积物不断增多，先变为沼泽，后变为陆地。这种自然过程非常缓慢，常需几千年甚至上万年。而人为排放含营养物质的工业废水和生活污水所引起的水体富营养化现象，可以在短期内出现。水体富营养化后，即使切断外界营养物质的来源，也很难自净和恢复到正常水平。水体富养化严重时，湖泊可被某些繁生植物及其残骸淤塞，成为沼泽甚至干地。局部海区可变成“死海”，或出现“赤潮”现象。
植物营养物质的来源广、数量大，有生活污水、农业面源、工业废水、垃圾等。每人每天带进污水中的氮约50 g。生活污水中的磷主要来源于洗涤废水，而施入农田的化肥有50%～80%流入江河、湖海和地下水体中。
许多参数可用作水体富营养化的指标，常用的是总磷、叶绿素-a 含量和初级生产率的大小（见表7-1）。
一、实验目的
1. 掌握总磷、叶绿素-a 及初级生产率的测定原理及方法。
2. 评价水体的富营养化状况。
二、仪器设备及试剂
1. 仪器
(1) 可见分光光度计。
(2) 移液管：1mL 、2mL 、10mL 。
(3) 容量瓶：100mL 、250mL 。）
(4) 锥型瓶：250mL 。
(5) 比色管：25mL 或50mL
(6) BOD 瓶：250mL 。
(7) 具塞小比色试管：10mL 。
(8) 玻璃纤维滤膜（40片）、剪刀、玻棒、夹子
(9) 多功能水质检测仪或溶氧仪
2. 试剂
(1) 过硫酸铵（固体）。
(2) 浓硫酸。
(3) 1 mol/L硫酸溶液。
(4) 2 mol/L盐酸溶液。
(5) 6 mol/L氢氧化钠溶液。
(6) 1%酚酞：1g 酚酞溶于90mL 乙醇中，加水至100mL 。
(7) 丙酮:水（9:1）溶液。
(8) 酒石酸锑钾溶液：将4.4gK(SbO)C4H 4O 6 ·1/2H2O 溶于200mL 蒸馏水中，用棕色瓶在4℃时保存。
(9) 钼酸铵溶液：将20g(NH4 ) 6MO 7O 24 ·4H 2O 溶于500mL 蒸馏水中，用塑料瓶在4℃时保存。
(10) 抗坏血酸溶液：0.1 mol/L（溶解1.76g 抗坏血酸于100mL 蒸馏水中，转入棕色瓶，若在4℃时保存，可维持一个星期不变）。
(11) 混合试剂：50mL 2 mol/L硫酸、5mL 酒石酸锑钾溶液、15mL 钼酸铵溶
液和30mL 抗坏血酸溶液。混合前，先让上述溶液达到室温，并按上述次序混合。在加入酒石酸锑钾或钼酸铵后，如混合试剂有浑浊，须摇动混合试剂，并放置几分钟，至澄清为止。若在4℃下保存，可维持1个星期不变。
(12) 磷酸盐储备液（1.00mg/mL磷）：称取1.098 gKH 2PO 4 ，溶解后转入250mL 容量瓶中，稀释至刻度，即得1.00mg/mL磷溶液。
(13) 磷酸盐标准溶液：量取1.00mL 储备液于100mL 容量瓶中，稀释至刻度，即得磷含量为10μg /mL的工作液。
三、实验过程
（一）磷的测定
1. 原理
在酸性溶液中，将各种形态的磷转化成磷酸根离子(PO43- )。随之用钼酸铵和酒石酸锑钾与之反应，生成磷钼锑杂多酸，再用抗坏血酸把它还原为深色钼蓝。
砷酸盐与磷酸盐一样也能生成钼蓝，0.1g/mL的砷就会干扰测定。六价铬、二价铜和亚硝酸盐能氧化钼蓝，使测定结果偏低。
2. 步骤
(1) 水样处理：水样中如有大的微粒，可用搅拌器搅拌2～3min ，以至混合均匀。量取100mL 水样（或经稀释的水样）2份，分别放入250mL 锥型瓶中，另取100mL 蒸馏水于250mL 锥型瓶中作为对照，分别加入1mL2mol/LH2SO 4，3g(NH4) 2S 2O 8 ，微沸约1h ，补加蒸馏水使体积为25～50mL （如锥型瓶壁上有白色凝聚物，应用蒸馏水将其冲入溶液中），再加热数分钟。冷却后，加一滴酚酞，并用6mol/LNaOH将溶液中和至微红色。再滴加2mol/LHCl使粉红色恰好褪去，转入100mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，移取25mL 至50mL 比色管中，加1mL 混合试剂，摇匀后，放置10min ，加水稀释至刻度再摇匀，放置10min ，以试剂空白作参比，用1cm 比色皿，于波长880nm 处测定吸光度（若分光光度计不能测定880nm 处的吸光度，可选择710nm 波长）。
(2) 标准曲线的绘制：分别吸取10μg /mL磷的标准溶液0.00、0.50、1.00、
1.50、2.00、2.50、3.00mL 于50mL 比色管中，加水稀释至约25mL ，加入1mL 混合试剂，摇匀后放置10min ，加水稀释至刻度，再摇匀，10min 后，以试剂空白作参比，用1cm 比色皿，于波长880nm 处测定吸光度。
3. 结果处理
由标准曲线查得磷的含量，按下式计算水中磷的含量：
ρP =Wp /V
式中，ρP 为水中磷的含量，g/L；W p 为由标准曲线上查得磷含量，μg ；V 为测定时吸取水样的体积（本实验V=25.00mL）。
（二）生产率的测定
1. 原理
绿色植物的生产率是光合作用的结果，与氧的产生量成比例。因此测定水体中的氧可看作对生产率的测量。然而在任何水体中都有呼吸作用产生，要消耗一部分氧。因此在计算生产率时，还必须测量因呼吸作用所损失的氧。本实验用测定2只无色瓶和2只深色瓶中相同样品内溶解氧变化量的方法测定生产率。此外，测定无色瓶中氧的减少量，提供校正呼吸作用的数据。
2. 实验过程
(1) 取四只BOD 瓶，其中两只用铝箔包裹使之不透光，这些分别记作“亮”和“暗”瓶。从一水体上半部的中间取出水样，测量水温和溶解氧。如果此水体的溶解氧未过饱和，则记录此值为ρOi ，然后将水样分别注入一对“亮”和“暗”瓶中。若水样中溶解氧过饱和，则缓缓地给水样通气，以除去过剩的氧。重新测定溶解氧并记作ρOi 。按上法将水样分别注入一对“亮”和“暗”瓶中。
(2) 从水体下半部的中间取出水样，按上述方法同样处理。
(3) 将两对“亮”和“暗”瓶分别悬挂在与取水样相同的水深位置，调整这些瓶子，使阳光能充分照射。一般将瓶子暴露几个小时，暴露期为清晨至中午，或中午至黄昏，也可清晨到黄昏。为方便起见，可选择较短的时间。
(4) 暴露期结束即取出瓶子，逐一测定溶解氧，分别将“亮”和“暗”瓶的数值记为ρOl 和ρOd 。
3. 结果处理
①呼吸作用：氧在暗瓶中的减少量R =ρOi - ρOd
净光合作用：氧在亮瓶中的增加量P n =ρOl -ρOi
总光合作用：P g =呼吸作用+净光合作用=（ρOi - ρOd ）+（ρOl -ρOi ）=ρOl -ρOd ②计算水体上下两部分值的平均值。
③通过以下公式计算来判断每单位水域总光合作用和净光合作用的日速率： a. 把暴露时间修改为日周期
Pg ′(mg O2 ·L -1·日-1) = Pg × 每日光周期时间/暴露时间
b. 将生产率单位从mg O2 /L 改为mg O2 /m2，这表示1 m2水面下水柱的总产生率。为此必须知道产生区的水深：
P g "(mg O2 · m-2·日-1) = Pg × 每日光周期时间/暴露时间× 103× 水深( m ) 103是体积浓度 mg/L换算为mg/m3的系数。
c. 假设全日24 h呼吸作用保持不变，计算日呼吸作用
R （mg O2 · m-2·日-1） = R × 24/暴露时间（ h ）× 103× 水深（m ） d. 计算日净光合作用：
P n （mg O2 ·L -1·日-1）= 日P g – 日R
④假设符合光合作用的理想方程（CO 2 + H2O→CH2O +O2 ），将生产率的单位转换成固定碳的单位：
日P m （mg C· m-2·日-1）= 日P n （mg O2 m-2·日-1）× 12/32
（三）叶绿素-a 的测定
1. 原理
测定水体中的叶绿素-a 的含量，可估计该水体的绿色植物存在量。将色素用丙酮萃取，测量其吸光度值，便可以测得叶绿素- a的含量。
2. 实验过程
①将100～500mL 水样经玻璃纤维滤膜过滤，记录过滤水样的体积。将滤纸卷成香烟状，放入小瓶或离心管。加10mL 或足以使滤纸淹没的90%丙酮液，记录体积，塞住瓶塞，并在4℃下暗处放置4 h 。如有浑浊，可离心萃取。将一些萃取液倒入1cm 玻璃比色皿，加比色皿盖，以试剂空白为参比，分别在波长665nm 和750nm 处测其吸光度。
②加1滴2mol/L盐酸于上述两只比色皿中，混匀并放置1min ，再在波长665nm 和750nm 处测定吸光度。
3. 结果处理
酸化前：A=A665-A 750，酸化后：A a =A665a -A 750a
在665nm 处测得吸光度减去750nm 处测得值是为了校正浑浊液。
用下式计算叶绿素-a 的浓度（μg/L）：叶绿素-a=29(A-Aa)V萃取液/V样品，式中，
V 萃取液，萃取液体积，ml ；V 样品，萃取液体积，ml 。
根据测定结果，并查阅有关资料，评价水体富营养化状况。
四、思考题
1. 水体中氮、磷的主要来源有哪些？
2. 在计算日生产率时，有几个主要假设？
3. 被测水体的富营养化状况如何？
实验三 水体富营养化程度的评价
富营养化(eutrophication)是指在人类活动的影响下，生物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡的现象。在自然条件下，湖泊也会从贫营养状态过渡到富营养状态，沉积物不断增多，先变为沼泽，后变为陆地。这种自然过程非常缓慢，常需几千年甚至上万年。而人为排放含营养物质的工业废水和生活污水所引起的水体富营养化现象，可以在短期内出现。水体富营养化后，即使切断外界营养物质的来源，也很难自净和恢复到正常水平。水体富养化严重时，湖泊可被某些繁生植物及其残骸淤塞，成为沼泽甚至干地。局部海区可变成“死海”，或出现“赤潮”现象。
植物营养物质的来源广、数量大，有生活污水、农业面源、工业废水、垃圾等。每人每天带进污水中的氮约50 g。生活污水中的磷主要来源于洗涤废水，而施入农田的化肥有50%～80%流入江河、湖海和地下水体中。
许多参数可用作水体富营养化的指标，常用的是总磷、叶绿素-a 含量和初级生产率的大小（见表7-1）。
一、实验目的
1. 掌握总磷、叶绿素-a 及初级生产率的测定原理及方法。
2. 评价水体的富营养化状况。
二、仪器设备及试剂
1. 仪器
(1) 可见分光光度计。
(2) 移液管：1mL 、2mL 、10mL 。
(3) 容量瓶：100mL 、250mL 。）
(4) 锥型瓶：250mL 。
(5) 比色管：25mL 或50mL
(6) BOD 瓶：250mL 。
(7) 具塞小比色试管：10mL 。
(8) 玻璃纤维滤膜（40片）、剪刀、玻棒、夹子
(9) 多功能水质检测仪或溶氧仪
2. 试剂
(1) 过硫酸铵（固体）。
(2) 浓硫酸。
(3) 1 mol/L硫酸溶液。
(4) 2 mol/L盐酸溶液。
(5) 6 mol/L氢氧化钠溶液。
(6) 1%酚酞：1g 酚酞溶于90mL 乙醇中，加水至100mL 。
(7) 丙酮:水（9:1）溶液。
(8) 酒石酸锑钾溶液：将4.4gK(SbO)C4H 4O 6 ·1/2H2O 溶于200mL 蒸馏水中，用棕色瓶在4℃时保存。
(9) 钼酸铵溶液：将20g(NH4 ) 6MO 7O 24 ·4H 2O 溶于500mL 蒸馏水中，用塑料瓶在4℃时保存。
(10) 抗坏血酸溶液：0.1 mol/L（溶解1.76g 抗坏血酸于100mL 蒸馏水中，转入棕色瓶，若在4℃时保存，可维持一个星期不变）。
(11) 混合试剂：50mL 2 mol/L硫酸、5mL 酒石酸锑钾溶液、15mL 钼酸铵溶
液和30mL 抗坏血酸溶液。混合前，先让上述溶液达到室温，并按上述次序混合。在加入酒石酸锑钾或钼酸铵后，如混合试剂有浑浊，须摇动混合试剂，并放置几分钟，至澄清为止。若在4℃下保存，可维持1个星期不变。
(12) 磷酸盐储备液（1.00mg/mL磷）：称取1.098 gKH 2PO 4 ，溶解后转入250mL 容量瓶中，稀释至刻度，即得1.00mg/mL磷溶液。
(13) 磷酸盐标准溶液：量取1.00mL 储备液于100mL 容量瓶中，稀释至刻度，即得磷含量为10μg /mL的工作液。
三、实验过程
（一）磷的测定
1. 原理
在酸性溶液中，将各种形态的磷转化成磷酸根离子(PO43- )。随之用钼酸铵和酒石酸锑钾与之反应，生成磷钼锑杂多酸，再用抗坏血酸把它还原为深色钼蓝。
砷酸盐与磷酸盐一样也能生成钼蓝，0.1g/mL的砷就会干扰测定。六价铬、二价铜和亚硝酸盐能氧化钼蓝，使测定结果偏低。
2. 步骤
(1) 水样处理：水样中如有大的微粒，可用搅拌器搅拌2～3min ，以至混合均匀。量取100mL 水样（或经稀释的水样）2份，分别放入250mL 锥型瓶中，另取100mL 蒸馏水于250mL 锥型瓶中作为对照，分别加入1mL2mol/LH2SO 4，3g(NH4) 2S 2O 8 ，微沸约1h ，补加蒸馏水使体积为25～50mL （如锥型瓶壁上有白色凝聚物，应用蒸馏水将其冲入溶液中），再加热数分钟。冷却后，加一滴酚酞，并用6mol/LNaOH将溶液中和至微红色。再滴加2mol/LHCl使粉红色恰好褪去，转入100mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，移取25mL 至50mL 比色管中，加1mL 混合试剂，摇匀后，放置10min ，加水稀释至刻度再摇匀，放置10min ，以试剂空白作参比，用1cm 比色皿，于波长880nm 处测定吸光度（若分光光度计不能测定880nm 处的吸光度，可选择710nm 波长）。
(2) 标准曲线的绘制：分别吸取10μg /mL磷的标准溶液0.00、0.50、1.00、
1.50、2.00、2.50、3.00mL 于50mL 比色管中，加水稀释至约25mL ，加入1mL 混合试剂，摇匀后放置10min ，加水稀释至刻度，再摇匀，10min 后，以试剂空白作参比，用1cm 比色皿，于波长880nm 处测定吸光度。
3. 结果处理
由标准曲线查得磷的含量，按下式计算水中磷的含量：
ρP =Wp /V
式中，ρP 为水中磷的含量，g/L；W p 为由标准曲线上查得磷含量，μg ；V 为测定时吸取水样的体积（本实验V=25.00mL）。
（二）生产率的测定
1. 原理
绿色植物的生产率是光合作用的结果，与氧的产生量成比例。因此测定水体中的氧可看作对生产率的测量。然而在任何水体中都有呼吸作用产生，要消耗一部分氧。因此在计算生产率时，还必须测量因呼吸作用所损失的氧。本实验用测定2只无色瓶和2只深色瓶中相同样品内溶解氧变化量的方法测定生产率。此外，测定无色瓶中氧的减少量，提供校正呼吸作用的数据。
2. 实验过程
(1) 取四只BOD 瓶，其中两只用铝箔包裹使之不透光，这些分别记作“亮”和“暗”瓶。从一水体上半部的中间取出水样，测量水温和溶解氧。如果此水体的溶解氧未过饱和，则记录此值为ρOi ，然后将水样分别注入一对“亮”和“暗”瓶中。若水样中溶解氧过饱和，则缓缓地给水样通气，以除去过剩的氧。重新测定溶解氧并记作ρOi 。按上法将水样分别注入一对“亮”和“暗”瓶中。
(2) 从水体下半部的中间取出水样，按上述方法同样处理。
(3) 将两对“亮”和“暗”瓶分别悬挂在与取水样相同的水深位置，调整这些瓶子，使阳光能充分照射。一般将瓶子暴露几个小时，暴露期为清晨至中午，或中午至黄昏，也可清晨到黄昏。为方便起见，可选择较短的时间。
(4) 暴露期结束即取出瓶子，逐一测定溶解氧，分别将“亮”和“暗”瓶的数值记为ρOl 和ρOd 。
3. 结果处理
①呼吸作用：氧在暗瓶中的减少量R =ρOi - ρOd
净光合作用：氧在亮瓶中的增加量P n =ρOl -ρOi
总光合作用：P g =呼吸作用+净光合作用=（ρOi - ρOd ）+（ρOl -ρOi ）=ρOl -ρOd ②计算水体上下两部分值的平均值。
③通过以下公式计算来判断每单位水域总光合作用和净光合作用的日速率： a. 把暴露时间修改为日周期
Pg ′(mg O2 ·L -1·日-1) = Pg × 每日光周期时间/暴露时间
b. 将生产率单位从mg O2 /L 改为mg O2 /m2，这表示1 m2水面下水柱的总产生率。为此必须知道产生区的水深：
P g "(mg O2 · m-2·日-1) = Pg × 每日光周期时间/暴露时间× 103× 水深( m ) 103是体积浓度 mg/L换算为mg/m3的系数。
c. 假设全日24 h呼吸作用保持不变，计算日呼吸作用
R （mg O2 · m-2·日-1） = R × 24/暴露时间（ h ）× 103× 水深（m ） d. 计算日净光合作用：
P n （mg O2 ·L -1·日-1）= 日P g – 日R
④假设符合光合作用的理想方程（CO 2 + H2O→CH2O +O2 ），将生产率的单位转换成固定碳的单位：
日P m （mg C· m-2·日-1）= 日P n （mg O2 m-2·日-1）× 12/32
（三）叶绿素-a 的测定
1. 原理
测定水体中的叶绿素-a 的含量，可估计该水体的绿色植物存在量。将色素用丙酮萃取，测量其吸光度值，便可以测得叶绿素- a的含量。
2. 实验过程
①将100～500mL 水样经玻璃纤维滤膜过滤，记录过滤水样的体积。将滤纸卷成香烟状，放入小瓶或离心管。加10mL 或足以使滤纸淹没的90%丙酮液，记录体积，塞住瓶塞，并在4℃下暗处放置4 h 。如有浑浊，可离心萃取。将一些萃取液倒入1cm 玻璃比色皿，加比色皿盖，以试剂空白为参比，分别在波长665nm 和750nm 处测其吸光度。
②加1滴2mol/L盐酸于上述两只比色皿中，混匀并放置1min ，再在波长665nm 和750nm 处测定吸光度。
3. 结果处理
酸化前：A=A665-A 750，酸化后：A a =A665a -A 750a
在665nm 处测得吸光度减去750nm 处测得值是为了校正浑浊液。
用下式计算叶绿素-a 的浓度（μg/L）：叶绿素-a=29(A-Aa)V萃取液/V样品，式中，
V 萃取液，萃取液体积，ml ；V 样品，萃取液体积，ml 。
根据测定结果，并查阅有关资料，评价水体富营养化状况。
四、思考题
1. 水体中氮、磷的主要来源有哪些？
2. 在计算日生产率时，有几个主要假设？
3. 被测水体的富营养化状况如何？