跟踪：转录因子激活与靶基因 转录因子上游信号通路，以及靶基因专题讨论。
转录因子靶点的鉴定
鉴定转录因子的靶点的第一步通常是将所研究对像敲除掉或超量表达，然后考察基因表达的变化，通常的方法有RT-PCR ，消减杂交（subtractive hybridization），差异显示（differential display）和SAGE （analysis of gene expression）等。芯片技术的发展使这种分析变得更加简便。它能一次分析很多的基因。但上面的技术都不能让我们知道所找到的靶基因是否直接的靶基因，可能有大量的基因都是间接被调控的。另外一些技术的发展使我们能够找到直接的靶点，如染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP ）和Dam 甲基化酶鉴定法（Dam methylase identification，DamID ）。这种技术和芯片技术联合起来可以帮助我们分析在基因组范围内转录因子的结合位点，称作基因组范围的定位分析（Genome-wide location analysis）。另外，基于算法和数据库的生物信息学方法也得到了一定的发展，这表现在从单纯保守位点分析到比较基因组方法的应用，这种方法基于以下事实，在种间高度保守的非编码序列有更大的可能性参与基因调控。
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1、许多转录因子需要跟一些配体因子结合才能发挥功能。转录因子的蛋白结构一般分三个区：DNA 结合区(DBD)，铰链区(hinge domain)，和配体结合区(LBD)，这个区域同时是转录激活/抑制功能区。这样的因子有PPAR, LXR（肝x 受体）。
2、有些转录因子的转录激活/抑制功能区不需要配体结合也能发挥功能，比如p53
3、而像NFkB 这样的转录因子在细胞内以非活性的形式存在。静息时NF-kB 二聚体与I-kB 蛋白家族构成三聚体而存留于胞浆，当细胞受到外界因素，如细菌或病毒感染、炎症细胞因子、TNF 、LPS 、紫外线照射、电离辐射等刺激后，I-kB 将发生磷酸化并迅速降解，NF-kB 被释放，、激活并进入细胞核，结合于特异性DNA 位点，从而启动一系列基因的转录，发挥其重要的生物学作用[4]。
转录因子的分类有很多种。从转录的过程来看，如 TFIIB, TFIID 等与RNA polymerase II 直接BIND 的称 general transcription factor，其他位于启动子上游需要信号激活的转录因子也有一些分类方法。如楼上所说，有需要与配体相互作用以后转核的，如steriod hormone receptor，也有在细胞质内通过细胞膜的第二信使作用激活的蛋白因子，还有一些 house keeping gene 的产物，同样也有 transcription factor 的作用。与转录密切相关的 co-factor ，enhancer ，也都对转录起重要作用。同时启动子上的一些cis 作用元件。。。对于不同基因激活的方式各异，含盖的方面也比较广。
看大家发了很多了，我就来个比较基础的东西，泛泛的谈谈转录因子是如何激活转录的吧，资料来源于Watson 《MBOG 》2004版，同时参考了杨克恭（协和的XX 老师）讲课所编。
基础的东西，嘿嘿，希望大家不要烦啊！
1. 在体内由于DNA 被组装成核小体核染色质，所以转录调节蛋白或者叫做转录因子，我们称之为Activator 募集聚合酶到Promoter ，稳定酶与DNA 的结合。
2. 该作用主要是由于DNA 结合Activator 和部分转录机介导的，呵呵，所以我们又把它们叫做“Mediator”。Mediator 一端表面和CTD"tail" 结合（多聚酶的一个亚基），其他端和Activator 结合。可见“Mediator”在在体内转录中的作用很重要啊！
3.Mediator 是由多个亚基组成的，如右上的图。某个亚基的缺失并不能使基因转录失活，只使得小部分基因丢失，这点也是有意义的，可以解释不同的现象。
4.Mediator 还募集了染色体重塑体和组蛋白酰化酶，使DNA 从凝集态转变为松散态。
5.CTD 的作用，贯穿于这个转录启始，延伸，终止过程中。只要是由于一个7肽一拷贝的不同位点Ser 的磷酸化。如图启始阶段2、5位磷酸化可以募集加帽酶，延伸2位磷酸化募集剪切机组件，终止阶段5位磷酸化募集分裂因子并且使多腺苷酸化。如下图 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=462
title="Click to view full 未命名.JPG (896 X 648)" border=0 align=absmiddle>
转录因子的人工设计。
人工设计转录因子调控目标基因的表达，基于锌指蛋白结构域的设计已经展开。锌指蛋白结构域能够结合于特定的三个碱基配对的DNA 序列上。RNA 干扰和反义核酸技术能够抑制基因的表达，而人工设计转录因子能够升高目标基因的表达，从而为疾病的新治疗方法开辟了新的思路。Nature Biotechnology上新发表的两篇文章为基于锌指蛋白结构域的转录因子设计提出了新的观点。
Kim et al.在整个基因组范围内寻找编码锌指蛋白结构域的序列，并分别分析这些结构域的结合特性，得到了56种不同的结构域对三连碱基对DNA 序列有不同的结合特异性。研究者接着把这些结构域三三组合观察是否能够产生9个碱基对的特异性。从这些锌指蛋白结构域中，转录因子被设计为能够结合人类血管内皮生长因子的启动子，设计得到的转录因子也确实能够特异性结合并激活人类血管内皮生长因子的表达。
Barbas and colleagues也在基因组范围内寻找可以激活和抑制基因表达的转录因子。研究者用一个随机产生的锌指蛋白构成的文库转化到人类细胞中去，分析细胞表面蛋白的异位表达情况。研究者用这种方法寻找到了具有自然的染色质结合状态并能够结合DNA 激活基因表达的锌指蛋白。
这两个报道都在基因组范围内分析了包含锌指蛋白结构域的有价值因子。Kim et al.寻找到的锌指蛋白结构域比完全人工设计的结构域引发的免疫活性要小。Barbas and
colleagues 的研究也可以立即知道那些锌指蛋白在人类细胞系中可以发挥作用。这些研究为锌指蛋白转录因子的人工设计提出了非常新颖的方法，对此类的研究具有很高的价值。
Watson 《Molecular biology of the gene》5th 的summary
1.Expression of a transcription factor that binds X (TFX)
2.If TFX binds as a heterodimer, expression of the appropriate partner
3.Activation of TFX (in response to a signal)
4.Release from an inhibitor
5.Targetting to the nucleus
6.The presence of appropriate co-activators/mediators
7.Occupation of other cis elements by TFs
8.The presence of DNA-deforming proteins
想请问ahge ：
我们知道转录激活因子特意性地激活靶基因。那么这种特异性是如何体现的呢？
我先说说自己所了解到的：
首先，转录激活因子需要识别特意性的核酸响应元件，带有这些响应元件是成为靶基因的首要条件；
我想，并不是所有带这个响应元件的基因都在任何时候成为靶基因。那么，这是如何进一步区分和调控的呢？一些诸如转录沉默因子的其他因子参与了？你说得mediator 在某个生物体内只有一种吧？
ahge wrote:
看大家发了很多了，我就来个比较基础的东西，泛泛的谈谈转录因子是如何激活转录的吧，资料来源于Watson 《MBOG 》2004版，同时参考了杨克恭（协和的XX 老师）讲课所编。基础的东西，嘿嘿，希望大家不要烦啊！
1. 在体内由于DNA 被组装成核小体核染色质，所以转录调节蛋白或者叫做转录因子，我们称之为Activator 募集聚合酶到Promoter ，稳定酶与DNA 的结合。
2. 该作用主要是由于DNA 结合Activator 和部分转录机介导的，呵呵，所以我们又把它们叫做“Mediator”。Mediator 一端表面和CTD"tail" 结合（多聚酶的一个亚基），其他端和Activator 结合。可见“Mediator”在在体内转录中的作用很重要啊！
3.Mediator 是由多个亚基组成的，如右上的图。某个亚基的缺失并不能使基因转录失活，只使得小部分基因丢失，这点也是有意义的，可以解释不同的现象。
4.Mediator 还募集了染色体重塑体和组蛋白酰化酶，使DNA 从凝集态转变为松散态。
5.CTD 的作用，贯穿于这个转录启始，延伸，终止过程中。只要是由于一个7肽一拷贝的不同位点Ser 的磷酸化。如图启始阶段2、5位磷酸化可以募集加帽酶，延伸2位磷酸化募集剪切机组件，终止阶段5位磷酸化募集分裂因子并且使多腺苷酸化。如下图
通过直接的基因组范围转录因子表达分析揭示小鼠大脑的组织结构
在今天的Science 上发表一篇研究小鼠发育过程中大脑里转录因子（TF ）的整体表达情况的文章。在大脑发育过程中，转录因子指导形成多样的神经元和神经胶质细胞阵列。作者首先从小鼠基因组中鉴定了1445个可能的TFs ，然后用原位杂交的方法在发育小鼠的大脑中对这些1000多个TFs 和TF 共调节基因（TFcoregulator genes）的表达进行了作图分析。作者发现这些基因中的349个表现出局限表达谱且足以描绘大脑的解剖组织情况了。作者还将小鼠的TFs 及其表达谱构建了一个可查询的数据库。
SCIENCE VOL 306 24 DECEMBER 2004:2255
Mouse Brain Organization Revealed Through Direct Genome-Scale TF Expression Analysis
Paul A. Gray et.al
In the developing brain, transcription factors (TFs) direct the formation of a diverse array of neurons and glia. We identifed 1445 putative TFs in the mouse genome. We used in situ hybridization to map the expression of over 1000 of these TFs and TF-coregulator genes in the brains of developing mice. We found that 349 of these genes showed restricted expression patterns that were adequate to describe the anatomical organization of the brain. We provide a comprehensive inventory of murine TFs and their expression patterns in a searchable brain atlas database.
原文链接：
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多谢主任提醒并纠正！
支持一下，^_^
难以解释的现象--转录因子结合位点在人21和22号染色体上的分布 （cell 中的一篇文章）
转录因子的结合位点（transcription factor binding site，TFBS ）是转录因子调节基因表达时，与mRNA 结合的区域。按照常识，转录因子（transcription factor，TF ）的结合位点一般应该分布在基因的前端，但是，新的研究发现，人21和22号染色体上，只有22％的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5' 端。
文章的试验方法是，通过高密度的寡核苷酸芯片，反映出人21和22号染色体的几乎所有的非重复序列，通过这种芯片，检测三种转录因子，Sp1、cMyc 、和p53的结合位点。结果表明，每种转录因子都有大量的TFBS 与之结合。然而，只有22％的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5' 端，36％的TFBS 分布在蛋白编码基因的中部或3' 端，并且这36％的TFBS 常常和基因组中的非蛋白编码RNA 分布在一起。这暗示，在人的基因组中，不仅包含蛋白编码基因，也包含数量相当的非编码基因（noncoding genes），他们都受常见的转录因子所调控。
（有关非编码基因的研究：）
人们对蛋白编码基因已经很熟悉了，但是，最近几年，人们发现，似乎基因组中的转录产物（转录组，transcriptome ）比想象的更多更复杂。这主要是由非编码基因造成的，它们不编码蛋白，其中有一些编码反义RNA 。后来，通过对小鼠基因组的分析，发现人和小鼠的基因组中的非编码区存在比预想多的保守区域，这些保守区域可能就是非编码基因所在的区域。非编码基因对生物体照样有很重要的功能，但是，目前我们对这一部分还知之甚少。
关于细胞核转录因子的分离和鉴定：
信号转导的结果是细胞核内一些转录因子同DNA 上某些特定的序列结合，调节转录活性和基因的表达水平。因而分离鉴定细胞内核转录因子在信号转导研究中具有独特的意义。根据核转录因子可与一些特定的核甘酸序列结合的特点，将其特定的核苷序列标记上同位素，来鉴定信号转导中的核转录因子。核转录因子具有一些特征性的结构域，即亮氨酸拉链（lucine zipper ）、锌指结构（zinc finger）和螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix ）结构。并且受用足迹法（foot printing）分析新发现核转录因子结合DNA 的位置和核甘酸序列。
随着分子生物学核技术的发展，信号转导研究取得很大进展。采用基因克隆技术发现了越来越多的信号蛋白分子；嵌合分子的构建及基因转染等技术的应用为细胞因子的信号转导研究提供了有效的手段；点突变、肽竞争等技术使信号蛋白中某些功能区的作用的研究变得更为精确。
现在为了筛选转录因子的药物候选物，构建筛选模型已经细到domain 的地步。比如筛选肝X 受体（LXR ）的抑制剂，我们可以构建报告基因模型，但是现在往往是取LXR 的Ligand binding domain跟另一个转录因子，比如哺乳双杂交中应用的那个因子的DNA binding domain 和hinge domain组成嵌合转录因子，筛选作用于LXR 的lingand bingding domain 的抑制剂。筛选中用完整的，哺乳双杂交中应用的那个因子作为阴性对照。
稍微谈一点人工转录因子相关的东东：
真核转录因子（Transcription factors）分为两大类：通用转录因子（General
transcription factor,GTF）与序列特异的转录因子。前者包括TFIIA 、TFIIB 、TFIID 、TFIIE 以及TFIIF 等成员，几乎参与了所有真核基因的转录，以特定的顺序结合在转录起始位点附近的核心启动子上，与RNA 聚合酶II 组装形成前起始复合体（Preinitiation Complex ，PIC ），从而启动真核基因的转录。后者则通过特异地结合不同基因的调节区中的DNA 顺式元件对个别基因的转录起到激活、抑制等作用。
后者通常由DNA 结合域（DNA-binding domain，DBD ）与效应域（Effector domain，ED ）两部分构成。效应域通常是一个激活因子（Activator ）或者抑制因子（Repressor ），能够激活或者抑制靶基因的表达。这两个结构域是各自独立起作用的 ，于是人们将不同的DNA 结合域与效应域组合在一起，得到具有新的序列特异性与作用效果的人工转录因子（artificial transcription factor，ATF ）。目前在人工转录因子的构建中最常用的DNA 结合域是锌指结构，许多实验室构建了各种不同的锌指筛选系统以得到与目的序列特异作用的锌指结构。
关于ATF 的设计。该图来自Modular design of artificial transcription factors。 Current Opinion in Chemical Biology 2002, 6:765–772
（缩略图，点击图片链接看原图）
carol_hh wrote:
稍微谈一点人工转录因子相关的东东：
真核转录因子（Transcription factors）分为两大类：通用转录因子（General
transcription factor,GTF）与序列特异的转录因子。前者包括TFIIA 、TFIIB 、TFIID 、TFIIE 以及TFIIF 等成员，几乎参与了所有真核基因的转录，以特定的顺序结合在转录起始位点附近的核心启动子上，与RNA 聚合酶II 组装形成前起始复合体（Preinitiation Complex ，PIC ），从而启动真核基因的转录。后者则通过特异地结合不同基因的调节区中的DNA 顺式元件对个别基因的转录起到激活、抑制等作用。
是不是可以这样讲，通用转录因子的结合序列一般是宿主细胞每个基因都具有的，也是RNA 聚合酶转录起始所必需的；而特异转录因子的结合序列不是转录所必需的，也是只有少数基因的调控序列所具有的，因此具有了特异性。
后者通常由DNA 结合域（DNA-binding domain，DBD ）与效应域（Effector domain，ED ）两部分构成。效应域通常是一个激活因子（Activator ）或者抑制因子（Repressor ），能够激活或者抑制靶基因的表达。这两个结构域是各自独立起作用的 ，于是人们将不同的DNA 结合域与效应域组合在一起，得到具有新的序列特异性与作用效果的人工转录因子（artificial transcription factor，ATF ）。目前在人工转录因子的构建中最常用的DNA 结合域是锌指结构，许多实验室构建了各种不同的锌指筛选系统以得到与目的序列特异作用的锌指结构。
在构建核转录因子相关的药物高通量筛选模型时，采用人工转录因子往往要比天然的转录因子好，或者说采用两者结合进行药物筛选，得到的化合物的靶点特异性更高。单纯采用天然核转录因子做靶点筛选，得到的活性化合物往往并不知道它到底作用于靶点的DNA 结合区还是效应区。
核转录因子由于在作用机制上，和结构上具有非常相似的特点，因此构建这种chimera 比较容易。典型的就是酵母双杂交和哺乳动物双杂交系统。
pengding3 wrote:
转录因子靶点的鉴定
鉴定转录因子的靶点的第一步通常是将所研究对像敲除掉或超量表达，然后考察基因表达的变化，通常的方法有RT-PCR ，消减杂交（subtractive hybridization），差异显示（differential display）和SAGE （analysis of gene expression）等。芯片技术的发
展使这种分析变得更加简便。它能一次分析很多的基因。但上面的技术都不能让我们知道所找到的靶基因是否直接的靶基因，可能有大量的基因都是间接被调控的。另外一些技术的发展使我们能够找到直接的靶点，如染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP ）和Dam 甲基化酶鉴定法（Dam methylase identification，DamID ）。这种技术和芯片技术联合起来可以帮助我们分析在基因组范围内转录因子的结合位点，称作基因组范围的定位分析（Genome-wide location analysis）。另外，基于算法和数据库的生物信息学方法也得到了一定的发展，这表现在从单纯保守位点分析到比较基因组方法的应用，这种方法基于以下事实，在种间高度保守的非编码序列有更大的可能性参与基因调控。
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关于转录因子和下游调控基因的鉴定，补充一点：报告基因检测(reporter gene assay)方法：
1、首先对嫌疑基因进行粗略的启动子分析，得到大致的启动子（包括上游一些调控区）就行；
2、然后将将" 嫌疑基因的整个启动子区+报告基因”组合起来，构建到质粒载体中，形成报告质粒。
3、最后将转录因子的表达质粒和报告质粒转入宿主细胞（转录因子因此形成了过表达），设定合适的对照，就能够很灵敏的显示之间的关系。
4、当核转录因子具有激活因子或者抑制因子时，加入这玩意儿，更能很好的反应转录因子和靶基因的上调和下调关系。
报告基因相对于一般的检测方法，如差异显示，定量RT-PCR 等，具有成本低，通量高的特点，灵敏度也很好。
oasis wrote:
关于转录因子和下游调控基因的鉴定，补充一点：报告基因检测(reporter gene assay)方法：
1、首先对嫌疑基因进行粗略的启动子分析，得到大致的启动子（包括上游一些调控区）就行；
2、然后将将" 嫌疑基因的整个启动子区+报告基因”组合起来，构建到质粒载体中，形成报告质粒。
3、最后将转录因子的表达质粒和报告质粒转入宿主细胞（转录因子因此形成了过表达），设定合适的对照，就能够很灵敏的显示之间的关系。
4、当核转录因子具有激活因子或者抑制因子时，加入这玩意儿，更能很好的反应转录因子和靶基因的上调和下调关系。
报告基因相对于一般的检测方法，如差异显示，定量RT-PCR 等，具有成本低，通量高的特点，灵敏度也很好。
非常好，
这个精美介绍的方法好像没什么：
研究转录因子活性的ELISA 试剂盒
转录因子是一种严格调节基因表达的DNA 结合蛋白。它由两个不同的功能区组成：一个可与特异性DNA 有很高的亲合力，另一个表现转录活性。转录因子活性的表现是通过特殊残基的磷酸化过程表现，或与抑制蛋白连接而达到。对于转录因子的了解和对其定量分析十分有利于分化、脑活性、免疫反应、感染和癌症相关的人细胞功能的研究。研究转录因子（TF ）最常用的方法是用凝胶转移分析法。其他传统方法包括Westrn blot和报告质粒转染。而这些方法都费时，且缺乏特异性。不适于高通量扫描，也可能会用到放射性元素。Active Motif 公司开发的TRANS-AM 产品线突破了这些限制。
优点
TRANS-AM 采用高敏感性和高通量技术分析哺乳动物组织或细胞抽提液中转录因子的活性。TRANS-AM 利用一个与96孔板相连的寡核苷酸。细胞抽提中的转录因子活化形式可与这个寡核苷酸特异性连接。用于检测转录因子的一抗识别活化的与靶DNA 连接的转录因子。再用抗IgG 偶联物和显色反应，则可很容易得到定量的结果。
TRANS-AM's ELISA试剂可在3-5小时准确定量转录因子，不会有麻烦的克隆和细胞转染过程，不用胶的曝光且无需放射性探针。
为什么要选用TRANS-AM
比凝胶转移分析技术敏感性要强10倍
在3-5小时就可完成包括细胞抽提的全部分析
敏感、无放射性，分光光度计读出显色结果
同时处理大量样本，高通量自动分析96孔板
主任说的非常好，有些地方我们可以进行一些深入的讨论。
sunxjk wrote:
非常好，
这个精美介绍的方法好像没什么：
研究转录因子活性的ELISA 试剂盒
转录因子是一种严格调节基因表达的DNA 结合蛋白。它由两个不同的功能区组成：一个可
与特异性DNA 有很高的亲合力，另一个表现转录活性。转录因子活性的表现是通过特殊残基的磷酸化过程表现，或与抑制蛋白连接而达到。对于转录因子的了解和对其定量分析十分有利于分化、脑活性、免疫反应、感染和癌症相关的人细胞功能的研究。研究转录因子（TF ）最常用的方法是用凝胶转移分析法。其他传统方法包括Westrn blot和报告质粒转染。而这些方法都费时，且缺乏特异性。不适于高通量扫描，也可能会用到放射性元素。Active Motif 公司开发的TRANS-AM 产品线突破了这些限制。
high throughput screening，一般翻译成高通量筛选，不译成高通量扫描，精美翻译的不太好，呵呵，我有点学究了；
优点
TRANS-AM 采用高敏感性和高通量技术分析哺乳动物组织或细胞抽提液中转录因子的活性。TRANS-AM 利用一个与96孔板相连的寡核苷酸。细胞抽提中的转录因子活化形式可与这个寡核苷酸特异性连接。用于检测转录因子的一抗识别活化的与靶DNA 连接的转录因子。再用抗IgG 偶联物和显色反应，则可很容易得到定量的结果。
TRANS-AM's ELISA试剂可在3-5小时准确定量转录因子，不会有麻烦的克隆和细胞转染过程，不用胶的曝光且无需放射性探针。
TRANS-AM 这个方法就是把分子间的反应跟ELISA 结合起来，方法虽然并不新，但有些创意义的，其实跟凝胶转移分析法（EMSA ）的基本原理类似，只是采用了ELISA 作为检测手段，而EMSA 采用电涌作为检测手段，目的都是为了检测和转录因子跟响应元件的结合。
商家说自己的产品，总是会贬低别人的缺点，从不会讨论方法间的互补。其实仔细分析，大家就会发现，这种TRANS-AM 技术也好，EMSA 也好，检测的是核转录因子跟响应元件的结合，而报告基因检测的是核转录因子的功能，用检测模型构建的专业术语来讲，前者是分子水平的assay ，后者是cell-based assay，是功能筛选。也就是说，前者只能检测是否结合了，而报告基因方法则只关心转录因子活性是不是发生变化了，而不管你是通过抑制/促进它跟靶序列的结合，还是通过影响和转录因子的转录激活区功能而发挥作用。
一般来讲，分子水平的检测模型往往不是功能分析，它只是分析两个分子是否相互作用了（当然，这里，核转录激活因子跟响应元件的结合变化肯定会影响功能，但从本质上讲这不是一种功能分析方法）
而细胞和细胞水平以上的分析模型，或者说方法，很多是基于功能的检测的，比如说报告基因，是一种非常典型的基于功能的检测方法。
分子水平上的检测结果往往需要进一步的功能检测，才能说明功能上的问题；而功能检测结果往往靶点特异性上没有分子水上的分析结果更精确定位，比如报告基因结果分析一个核转录因子的转炉激活作用，但是它不能说明到底是通过影响抑制/促进它跟靶序列的结合，还是通过影响和转录因子的转录激活区功能而发挥作用，因此往往需要分子水平上的检测，比如EMSA 或者TRANS-AM 来进一步验证和排除。
为什么要选用TRANS-AM
比凝胶转移分析技术敏感性要强10倍
在3-5小时就可完成包括细胞抽提的全部分析
敏感、无放射性，分光光度计读出显色结果
同时处理大量样本，高通量自动分析96孔板
总体上来讲，ELISA 并不是流行的分子水上的高通量筛选方法，缺点是洗板，这个大家都知道；报告基因是非常流行的高通量筛选方法，是cell 水平上的方法，但是就通量来说，ELISA 比reporter gene方法高，不过个人感觉，reporter gene方法比elisa 更方便，特别是得到稳定表达模型以后，非常方便。
reporter gene的方法灵敏度并不低，0.1, 0.01,甚至0.001ng/ml都可以达到，不过我觉得比较这个参考意义不大，一个是检测一个分子间反应，一个是检测功能。这是非常互补的。大家去看这类文献，一片好de 文献都是同时采用互补的方法来从不同层次和角度说明问题。这样才有说服力，缺一不可。
好呀，不过我不怎么懂，希望以后大哥教教我！
We developed a new DNA microarray-based technology, called protein binding microarrays (PBMs), that allows rapid, high-throughput characterization of the in vitro DNA binding–site sequence specificities of transcription factors in a single day. Using PBMs, we identified the DNA binding–site sequence
specificities of the yeast transcription factors Abf1, Rap1 and Mig1. Comparison of these proteins' in vitro binding sites with their in vivo binding sites indicates that PBM-derived sequence specificities can accurately reflect in vivo DNA sequence specificities. In addition to previously identified targets, Abf1, Rap1 and Mig1 bound to 107, 90 and 75 putative new target intergenic regions,
respectively, many of which were upstream of previously uncharacterized open reading frames. Comparative sequence analysis indicated that many of these newly identified sites are highly conserved across five sequenced sensu stricto yeast species and, therefore, are probably functional in vivo binding sites that may be used in a condition-specific manner. Similar PBM experiments should be useful in identifying new cis regulatory elements and transcriptional regulatory networks in various genomes.
为什么要选用TRANS-AM
比凝胶转移分析技术敏感性要强10倍
在3-5小时就可完成包括细胞抽提的全部分析
敏感、无放射性，分光光度计读出显色结果
同时处理大量样本，高通量自动分析96孔板
I DON'T KNOW
跟踪：转录因子激活与靶基因 转录因子上游信号通路，以及靶基因专题讨论。
转录因子靶点的鉴定
鉴定转录因子的靶点的第一步通常是将所研究对像敲除掉或超量表达，然后考察基因表达的变化，通常的方法有RT-PCR ，消减杂交（subtractive hybridization），差异显示（differential display）和SAGE （analysis of gene expression）等。芯片技术的发展使这种分析变得更加简便。它能一次分析很多的基因。但上面的技术都不能让我们知道所找到的靶基因是否直接的靶基因，可能有大量的基因都是间接被调控的。另外一些技术的发展使我们能够找到直接的靶点，如染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP ）和Dam 甲基化酶鉴定法（Dam methylase identification，DamID ）。这种技术和芯片技术联合起来可以帮助我们分析在基因组范围内转录因子的结合位点，称作基因组范围的定位分析（Genome-wide location analysis）。另外，基于算法和数据库的生物信息学方法也得到了一定的发展，这表现在从单纯保守位点分析到比较基因组方法的应用，这种方法基于以下事实，在种间高度保守的非编码序列有更大的可能性参与基因调控。
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1、许多转录因子需要跟一些配体因子结合才能发挥功能。转录因子的蛋白结构一般分三个区：DNA 结合区(DBD)，铰链区(hinge domain)，和配体结合区(LBD)，这个区域同时是转录激活/抑制功能区。这样的因子有PPAR, LXR（肝x 受体）。
2、有些转录因子的转录激活/抑制功能区不需要配体结合也能发挥功能，比如p53
3、而像NFkB 这样的转录因子在细胞内以非活性的形式存在。静息时NF-kB 二聚体与I-kB 蛋白家族构成三聚体而存留于胞浆，当细胞受到外界因素，如细菌或病毒感染、炎症细胞因子、TNF 、LPS 、紫外线照射、电离辐射等刺激后，I-kB 将发生磷酸化并迅速降解，NF-kB 被释放，、激活并进入细胞核，结合于特异性DNA 位点，从而启动一系列基因的转录，发挥其重要的生物学作用[4]。
转录因子的分类有很多种。从转录的过程来看，如 TFIIB, TFIID 等与RNA polymerase II 直接BIND 的称 general transcription factor，其他位于启动子上游需要信号激活的转录因子也有一些分类方法。如楼上所说，有需要与配体相互作用以后转核的，如steriod hormone receptor，也有在细胞质内通过细胞膜的第二信使作用激活的蛋白因子，还有一些 house keeping gene 的产物，同样也有 transcription factor 的作用。与转录密切相关的 co-factor ，enhancer ，也都对转录起重要作用。同时启动子上的一些cis 作用元件。。。对于不同基因激活的方式各异，含盖的方面也比较广。
看大家发了很多了，我就来个比较基础的东西，泛泛的谈谈转录因子是如何激活转录的吧，资料来源于Watson 《MBOG 》2004版，同时参考了杨克恭（协和的XX 老师）讲课所编。
基础的东西，嘿嘿，希望大家不要烦啊！
1. 在体内由于DNA 被组装成核小体核染色质，所以转录调节蛋白或者叫做转录因子，我们称之为Activator 募集聚合酶到Promoter ，稳定酶与DNA 的结合。
2. 该作用主要是由于DNA 结合Activator 和部分转录机介导的，呵呵，所以我们又把它们叫做“Mediator”。Mediator 一端表面和CTD"tail" 结合（多聚酶的一个亚基），其他端和Activator 结合。可见“Mediator”在在体内转录中的作用很重要啊！
3.Mediator 是由多个亚基组成的，如右上的图。某个亚基的缺失并不能使基因转录失活，只使得小部分基因丢失，这点也是有意义的，可以解释不同的现象。
4.Mediator 还募集了染色体重塑体和组蛋白酰化酶，使DNA 从凝集态转变为松散态。
5.CTD 的作用，贯穿于这个转录启始，延伸，终止过程中。只要是由于一个7肽一拷贝的不同位点Ser 的磷酸化。如图启始阶段2、5位磷酸化可以募集加帽酶，延伸2位磷酸化募集剪切机组件，终止阶段5位磷酸化募集分裂因子并且使多腺苷酸化。如下图 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=462
title="Click to view full 未命名.JPG (896 X 648)" border=0 align=absmiddle>
转录因子的人工设计。
人工设计转录因子调控目标基因的表达，基于锌指蛋白结构域的设计已经展开。锌指蛋白结构域能够结合于特定的三个碱基配对的DNA 序列上。RNA 干扰和反义核酸技术能够抑制基因的表达，而人工设计转录因子能够升高目标基因的表达，从而为疾病的新治疗方法开辟了新的思路。Nature Biotechnology上新发表的两篇文章为基于锌指蛋白结构域的转录因子设计提出了新的观点。
Kim et al.在整个基因组范围内寻找编码锌指蛋白结构域的序列，并分别分析这些结构域的结合特性，得到了56种不同的结构域对三连碱基对DNA 序列有不同的结合特异性。研究者接着把这些结构域三三组合观察是否能够产生9个碱基对的特异性。从这些锌指蛋白结构域中，转录因子被设计为能够结合人类血管内皮生长因子的启动子，设计得到的转录因子也确实能够特异性结合并激活人类血管内皮生长因子的表达。
Barbas and colleagues也在基因组范围内寻找可以激活和抑制基因表达的转录因子。研究者用一个随机产生的锌指蛋白构成的文库转化到人类细胞中去，分析细胞表面蛋白的异位表达情况。研究者用这种方法寻找到了具有自然的染色质结合状态并能够结合DNA 激活基因表达的锌指蛋白。
这两个报道都在基因组范围内分析了包含锌指蛋白结构域的有价值因子。Kim et al.寻找到的锌指蛋白结构域比完全人工设计的结构域引发的免疫活性要小。Barbas and
colleagues 的研究也可以立即知道那些锌指蛋白在人类细胞系中可以发挥作用。这些研究为锌指蛋白转录因子的人工设计提出了非常新颖的方法，对此类的研究具有很高的价值。
Watson 《Molecular biology of the gene》5th 的summary
1.Expression of a transcription factor that binds X (TFX)
2.If TFX binds as a heterodimer, expression of the appropriate partner
3.Activation of TFX (in response to a signal)
4.Release from an inhibitor
5.Targetting to the nucleus
6.The presence of appropriate co-activators/mediators
7.Occupation of other cis elements by TFs
8.The presence of DNA-deforming proteins
想请问ahge ：
我们知道转录激活因子特意性地激活靶基因。那么这种特异性是如何体现的呢？
我先说说自己所了解到的：
首先，转录激活因子需要识别特意性的核酸响应元件，带有这些响应元件是成为靶基因的首要条件；
我想，并不是所有带这个响应元件的基因都在任何时候成为靶基因。那么，这是如何进一步区分和调控的呢？一些诸如转录沉默因子的其他因子参与了？你说得mediator 在某个生物体内只有一种吧？
ahge wrote:
看大家发了很多了，我就来个比较基础的东西，泛泛的谈谈转录因子是如何激活转录的吧，资料来源于Watson 《MBOG 》2004版，同时参考了杨克恭（协和的XX 老师）讲课所编。基础的东西，嘿嘿，希望大家不要烦啊！
1. 在体内由于DNA 被组装成核小体核染色质，所以转录调节蛋白或者叫做转录因子，我们称之为Activator 募集聚合酶到Promoter ，稳定酶与DNA 的结合。
2. 该作用主要是由于DNA 结合Activator 和部分转录机介导的，呵呵，所以我们又把它们叫做“Mediator”。Mediator 一端表面和CTD"tail" 结合（多聚酶的一个亚基），其他端和Activator 结合。可见“Mediator”在在体内转录中的作用很重要啊！
3.Mediator 是由多个亚基组成的，如右上的图。某个亚基的缺失并不能使基因转录失活，只使得小部分基因丢失，这点也是有意义的，可以解释不同的现象。
4.Mediator 还募集了染色体重塑体和组蛋白酰化酶，使DNA 从凝集态转变为松散态。
5.CTD 的作用，贯穿于这个转录启始，延伸，终止过程中。只要是由于一个7肽一拷贝的不同位点Ser 的磷酸化。如图启始阶段2、5位磷酸化可以募集加帽酶，延伸2位磷酸化募集剪切机组件，终止阶段5位磷酸化募集分裂因子并且使多腺苷酸化。如下图
通过直接的基因组范围转录因子表达分析揭示小鼠大脑的组织结构
在今天的Science 上发表一篇研究小鼠发育过程中大脑里转录因子（TF ）的整体表达情况的文章。在大脑发育过程中，转录因子指导形成多样的神经元和神经胶质细胞阵列。作者首先从小鼠基因组中鉴定了1445个可能的TFs ，然后用原位杂交的方法在发育小鼠的大脑中对这些1000多个TFs 和TF 共调节基因（TFcoregulator genes）的表达进行了作图分析。作者发现这些基因中的349个表现出局限表达谱且足以描绘大脑的解剖组织情况了。作者还将小鼠的TFs 及其表达谱构建了一个可查询的数据库。
SCIENCE VOL 306 24 DECEMBER 2004:2255
Mouse Brain Organization Revealed Through Direct Genome-Scale TF Expression Analysis
Paul A. Gray et.al
In the developing brain, transcription factors (TFs) direct the formation of a diverse array of neurons and glia. We identifed 1445 putative TFs in the mouse genome. We used in situ hybridization to map the expression of over 1000 of these TFs and TF-coregulator genes in the brains of developing mice. We found that 349 of these genes showed restricted expression patterns that were adequate to describe the anatomical organization of the brain. We provide a comprehensive inventory of murine TFs and their expression patterns in a searchable brain atlas database.
原文链接：
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多谢主任提醒并纠正！
支持一下，^_^
难以解释的现象--转录因子结合位点在人21和22号染色体上的分布 （cell 中的一篇文章）
转录因子的结合位点（transcription factor binding site，TFBS ）是转录因子调节基因表达时，与mRNA 结合的区域。按照常识，转录因子（transcription factor，TF ）的结合位点一般应该分布在基因的前端，但是，新的研究发现，人21和22号染色体上，只有22％的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5' 端。
文章的试验方法是，通过高密度的寡核苷酸芯片，反映出人21和22号染色体的几乎所有的非重复序列，通过这种芯片，检测三种转录因子，Sp1、cMyc 、和p53的结合位点。结果表明，每种转录因子都有大量的TFBS 与之结合。然而，只有22％的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5' 端，36％的TFBS 分布在蛋白编码基因的中部或3' 端，并且这36％的TFBS 常常和基因组中的非蛋白编码RNA 分布在一起。这暗示，在人的基因组中，不仅包含蛋白编码基因，也包含数量相当的非编码基因（noncoding genes），他们都受常见的转录因子所调控。
（有关非编码基因的研究：）
人们对蛋白编码基因已经很熟悉了，但是，最近几年，人们发现，似乎基因组中的转录产物（转录组，transcriptome ）比想象的更多更复杂。这主要是由非编码基因造成的，它们不编码蛋白，其中有一些编码反义RNA 。后来，通过对小鼠基因组的分析，发现人和小鼠的基因组中的非编码区存在比预想多的保守区域，这些保守区域可能就是非编码基因所在的区域。非编码基因对生物体照样有很重要的功能，但是，目前我们对这一部分还知之甚少。
关于细胞核转录因子的分离和鉴定：
信号转导的结果是细胞核内一些转录因子同DNA 上某些特定的序列结合，调节转录活性和基因的表达水平。因而分离鉴定细胞内核转录因子在信号转导研究中具有独特的意义。根据核转录因子可与一些特定的核甘酸序列结合的特点，将其特定的核苷序列标记上同位素，来鉴定信号转导中的核转录因子。核转录因子具有一些特征性的结构域，即亮氨酸拉链（lucine zipper ）、锌指结构（zinc finger）和螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix ）结构。并且受用足迹法（foot printing）分析新发现核转录因子结合DNA 的位置和核甘酸序列。
随着分子生物学核技术的发展，信号转导研究取得很大进展。采用基因克隆技术发现了越来越多的信号蛋白分子；嵌合分子的构建及基因转染等技术的应用为细胞因子的信号转导研究提供了有效的手段；点突变、肽竞争等技术使信号蛋白中某些功能区的作用的研究变得更为精确。
现在为了筛选转录因子的药物候选物，构建筛选模型已经细到domain 的地步。比如筛选肝X 受体（LXR ）的抑制剂，我们可以构建报告基因模型，但是现在往往是取LXR 的Ligand binding domain跟另一个转录因子，比如哺乳双杂交中应用的那个因子的DNA binding domain 和hinge domain组成嵌合转录因子，筛选作用于LXR 的lingand bingding domain 的抑制剂。筛选中用完整的，哺乳双杂交中应用的那个因子作为阴性对照。
稍微谈一点人工转录因子相关的东东：
真核转录因子（Transcription factors）分为两大类：通用转录因子（General
transcription factor,GTF）与序列特异的转录因子。前者包括TFIIA 、TFIIB 、TFIID 、TFIIE 以及TFIIF 等成员，几乎参与了所有真核基因的转录，以特定的顺序结合在转录起始位点附近的核心启动子上，与RNA 聚合酶II 组装形成前起始复合体（Preinitiation Complex ，PIC ），从而启动真核基因的转录。后者则通过特异地结合不同基因的调节区中的DNA 顺式元件对个别基因的转录起到激活、抑制等作用。
后者通常由DNA 结合域（DNA-binding domain，DBD ）与效应域（Effector domain，ED ）两部分构成。效应域通常是一个激活因子（Activator ）或者抑制因子（Repressor ），能够激活或者抑制靶基因的表达。这两个结构域是各自独立起作用的 ，于是人们将不同的DNA 结合域与效应域组合在一起，得到具有新的序列特异性与作用效果的人工转录因子（artificial transcription factor，ATF ）。目前在人工转录因子的构建中最常用的DNA 结合域是锌指结构，许多实验室构建了各种不同的锌指筛选系统以得到与目的序列特异作用的锌指结构。
关于ATF 的设计。该图来自Modular design of artificial transcription factors。 Current Opinion in Chemical Biology 2002, 6:765–772
（缩略图，点击图片链接看原图）
carol_hh wrote:
稍微谈一点人工转录因子相关的东东：
真核转录因子（Transcription factors）分为两大类：通用转录因子（General
transcription factor,GTF）与序列特异的转录因子。前者包括TFIIA 、TFIIB 、TFIID 、TFIIE 以及TFIIF 等成员，几乎参与了所有真核基因的转录，以特定的顺序结合在转录起始位点附近的核心启动子上，与RNA 聚合酶II 组装形成前起始复合体（Preinitiation Complex ，PIC ），从而启动真核基因的转录。后者则通过特异地结合不同基因的调节区中的DNA 顺式元件对个别基因的转录起到激活、抑制等作用。
是不是可以这样讲，通用转录因子的结合序列一般是宿主细胞每个基因都具有的，也是RNA 聚合酶转录起始所必需的；而特异转录因子的结合序列不是转录所必需的，也是只有少数基因的调控序列所具有的，因此具有了特异性。
后者通常由DNA 结合域（DNA-binding domain，DBD ）与效应域（Effector domain，ED ）两部分构成。效应域通常是一个激活因子（Activator ）或者抑制因子（Repressor ），能够激活或者抑制靶基因的表达。这两个结构域是各自独立起作用的 ，于是人们将不同的DNA 结合域与效应域组合在一起，得到具有新的序列特异性与作用效果的人工转录因子（artificial transcription factor，ATF ）。目前在人工转录因子的构建中最常用的DNA 结合域是锌指结构，许多实验室构建了各种不同的锌指筛选系统以得到与目的序列特异作用的锌指结构。
在构建核转录因子相关的药物高通量筛选模型时，采用人工转录因子往往要比天然的转录因子好，或者说采用两者结合进行药物筛选，得到的化合物的靶点特异性更高。单纯采用天然核转录因子做靶点筛选，得到的活性化合物往往并不知道它到底作用于靶点的DNA 结合区还是效应区。
核转录因子由于在作用机制上，和结构上具有非常相似的特点，因此构建这种chimera 比较容易。典型的就是酵母双杂交和哺乳动物双杂交系统。
pengding3 wrote:
转录因子靶点的鉴定
鉴定转录因子的靶点的第一步通常是将所研究对像敲除掉或超量表达，然后考察基因表达的变化，通常的方法有RT-PCR ，消减杂交（subtractive hybridization），差异显示（differential display）和SAGE （analysis of gene expression）等。芯片技术的发
展使这种分析变得更加简便。它能一次分析很多的基因。但上面的技术都不能让我们知道所找到的靶基因是否直接的靶基因，可能有大量的基因都是间接被调控的。另外一些技术的发展使我们能够找到直接的靶点，如染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP ）和Dam 甲基化酶鉴定法（Dam methylase identification，DamID ）。这种技术和芯片技术联合起来可以帮助我们分析在基因组范围内转录因子的结合位点，称作基因组范围的定位分析（Genome-wide location analysis）。另外，基于算法和数据库的生物信息学方法也得到了一定的发展，这表现在从单纯保守位点分析到比较基因组方法的应用，这种方法基于以下事实，在种间高度保守的非编码序列有更大的可能性参与基因调控。
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关于转录因子和下游调控基因的鉴定，补充一点：报告基因检测(reporter gene assay)方法：
1、首先对嫌疑基因进行粗略的启动子分析，得到大致的启动子（包括上游一些调控区）就行；
2、然后将将" 嫌疑基因的整个启动子区+报告基因”组合起来，构建到质粒载体中，形成报告质粒。
3、最后将转录因子的表达质粒和报告质粒转入宿主细胞（转录因子因此形成了过表达），设定合适的对照，就能够很灵敏的显示之间的关系。
4、当核转录因子具有激活因子或者抑制因子时，加入这玩意儿，更能很好的反应转录因子和靶基因的上调和下调关系。
报告基因相对于一般的检测方法，如差异显示，定量RT-PCR 等，具有成本低，通量高的特点，灵敏度也很好。
oasis wrote:
关于转录因子和下游调控基因的鉴定，补充一点：报告基因检测(reporter gene assay)方法：
1、首先对嫌疑基因进行粗略的启动子分析，得到大致的启动子（包括上游一些调控区）就行；
2、然后将将" 嫌疑基因的整个启动子区+报告基因”组合起来，构建到质粒载体中，形成报告质粒。
3、最后将转录因子的表达质粒和报告质粒转入宿主细胞（转录因子因此形成了过表达），设定合适的对照，就能够很灵敏的显示之间的关系。
4、当核转录因子具有激活因子或者抑制因子时，加入这玩意儿，更能很好的反应转录因子和靶基因的上调和下调关系。
报告基因相对于一般的检测方法，如差异显示，定量RT-PCR 等，具有成本低，通量高的特点，灵敏度也很好。
非常好，
这个精美介绍的方法好像没什么：
研究转录因子活性的ELISA 试剂盒
转录因子是一种严格调节基因表达的DNA 结合蛋白。它由两个不同的功能区组成：一个可与特异性DNA 有很高的亲合力，另一个表现转录活性。转录因子活性的表现是通过特殊残基的磷酸化过程表现，或与抑制蛋白连接而达到。对于转录因子的了解和对其定量分析十分有利于分化、脑活性、免疫反应、感染和癌症相关的人细胞功能的研究。研究转录因子（TF ）最常用的方法是用凝胶转移分析法。其他传统方法包括Westrn blot和报告质粒转染。而这些方法都费时，且缺乏特异性。不适于高通量扫描，也可能会用到放射性元素。Active Motif 公司开发的TRANS-AM 产品线突破了这些限制。
优点
TRANS-AM 采用高敏感性和高通量技术分析哺乳动物组织或细胞抽提液中转录因子的活性。TRANS-AM 利用一个与96孔板相连的寡核苷酸。细胞抽提中的转录因子活化形式可与这个寡核苷酸特异性连接。用于检测转录因子的一抗识别活化的与靶DNA 连接的转录因子。再用抗IgG 偶联物和显色反应，则可很容易得到定量的结果。
TRANS-AM's ELISA试剂可在3-5小时准确定量转录因子，不会有麻烦的克隆和细胞转染过程，不用胶的曝光且无需放射性探针。
为什么要选用TRANS-AM
比凝胶转移分析技术敏感性要强10倍
在3-5小时就可完成包括细胞抽提的全部分析
敏感、无放射性，分光光度计读出显色结果
同时处理大量样本，高通量自动分析96孔板
主任说的非常好，有些地方我们可以进行一些深入的讨论。
sunxjk wrote:
非常好，
这个精美介绍的方法好像没什么：
研究转录因子活性的ELISA 试剂盒
转录因子是一种严格调节基因表达的DNA 结合蛋白。它由两个不同的功能区组成：一个可
与特异性DNA 有很高的亲合力，另一个表现转录活性。转录因子活性的表现是通过特殊残基的磷酸化过程表现，或与抑制蛋白连接而达到。对于转录因子的了解和对其定量分析十分有利于分化、脑活性、免疫反应、感染和癌症相关的人细胞功能的研究。研究转录因子（TF ）最常用的方法是用凝胶转移分析法。其他传统方法包括Westrn blot和报告质粒转染。而这些方法都费时，且缺乏特异性。不适于高通量扫描，也可能会用到放射性元素。Active Motif 公司开发的TRANS-AM 产品线突破了这些限制。
high throughput screening，一般翻译成高通量筛选，不译成高通量扫描，精美翻译的不太好，呵呵，我有点学究了；
优点
TRANS-AM 采用高敏感性和高通量技术分析哺乳动物组织或细胞抽提液中转录因子的活性。TRANS-AM 利用一个与96孔板相连的寡核苷酸。细胞抽提中的转录因子活化形式可与这个寡核苷酸特异性连接。用于检测转录因子的一抗识别活化的与靶DNA 连接的转录因子。再用抗IgG 偶联物和显色反应，则可很容易得到定量的结果。
TRANS-AM's ELISA试剂可在3-5小时准确定量转录因子，不会有麻烦的克隆和细胞转染过程，不用胶的曝光且无需放射性探针。
TRANS-AM 这个方法就是把分子间的反应跟ELISA 结合起来，方法虽然并不新，但有些创意义的，其实跟凝胶转移分析法（EMSA ）的基本原理类似，只是采用了ELISA 作为检测手段，而EMSA 采用电涌作为检测手段，目的都是为了检测和转录因子跟响应元件的结合。
商家说自己的产品，总是会贬低别人的缺点，从不会讨论方法间的互补。其实仔细分析，大家就会发现，这种TRANS-AM 技术也好，EMSA 也好，检测的是核转录因子跟响应元件的结合，而报告基因检测的是核转录因子的功能，用检测模型构建的专业术语来讲，前者是分子水平的assay ，后者是cell-based assay，是功能筛选。也就是说，前者只能检测是否结合了，而报告基因方法则只关心转录因子活性是不是发生变化了，而不管你是通过抑制/促进它跟靶序列的结合，还是通过影响和转录因子的转录激活区功能而发挥作用。
一般来讲，分子水平的检测模型往往不是功能分析，它只是分析两个分子是否相互作用了（当然，这里，核转录激活因子跟响应元件的结合变化肯定会影响功能，但从本质上讲这不是一种功能分析方法）
而细胞和细胞水平以上的分析模型，或者说方法，很多是基于功能的检测的，比如说报告基因，是一种非常典型的基于功能的检测方法。
分子水平上的检测结果往往需要进一步的功能检测，才能说明功能上的问题；而功能检测结果往往靶点特异性上没有分子水上的分析结果更精确定位，比如报告基因结果分析一个核转录因子的转炉激活作用，但是它不能说明到底是通过影响抑制/促进它跟靶序列的结合，还是通过影响和转录因子的转录激活区功能而发挥作用，因此往往需要分子水平上的检测，比如EMSA 或者TRANS-AM 来进一步验证和排除。
为什么要选用TRANS-AM
比凝胶转移分析技术敏感性要强10倍
在3-5小时就可完成包括细胞抽提的全部分析
敏感、无放射性，分光光度计读出显色结果
同时处理大量样本，高通量自动分析96孔板
总体上来讲，ELISA 并不是流行的分子水上的高通量筛选方法，缺点是洗板，这个大家都知道；报告基因是非常流行的高通量筛选方法，是cell 水平上的方法，但是就通量来说，ELISA 比reporter gene方法高，不过个人感觉，reporter gene方法比elisa 更方便，特别是得到稳定表达模型以后，非常方便。
reporter gene的方法灵敏度并不低，0.1, 0.01,甚至0.001ng/ml都可以达到，不过我觉得比较这个参考意义不大，一个是检测一个分子间反应，一个是检测功能。这是非常互补的。大家去看这类文献，一片好de 文献都是同时采用互补的方法来从不同层次和角度说明问题。这样才有说服力，缺一不可。
好呀，不过我不怎么懂，希望以后大哥教教我！
We developed a new DNA microarray-based technology, called protein binding microarrays (PBMs), that allows rapid, high-throughput characterization of the in vitro DNA binding–site sequence specificities of transcription factors in a single day. Using PBMs, we identified the DNA binding–site sequence
specificities of the yeast transcription factors Abf1, Rap1 and Mig1. Comparison of these proteins' in vitro binding sites with their in vivo binding sites indicates that PBM-derived sequence specificities can accurately reflect in vivo DNA sequence specificities. In addition to previously identified targets, Abf1, Rap1 and Mig1 bound to 107, 90 and 75 putative new target intergenic regions,
respectively, many of which were upstream of previously uncharacterized open reading frames. Comparative sequence analysis indicated that many of these newly identified sites are highly conserved across five sequenced sensu stricto yeast species and, therefore, are probably functional in vivo binding sites that may be used in a condition-specific manner. Similar PBM experiments should be useful in identifying new cis regulatory elements and transcriptional regulatory networks in various genomes.
为什么要选用TRANS-AM
比凝胶转移分析技术敏感性要强10倍
在3-5小时就可完成包括细胞抽提的全部分析
敏感、无放射性，分光光度计读出显色结果
同时处理大量样本，高通量自动分析96孔板
I DON'T KNOW