《黑龙江畜牧兽医》科技版
DOI :10. 13881/j . cn ki . hljx m sy . 2009. 07. 018
2009年4月(上) 19
牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定
马忠辉, 赵巧香, 杨焕民
(黑龙江八一农垦大学动物科技学院, 黑龙江大庆163319)
中图分类号:S 823
文献标识码:A
文章编号:1004-7034(2009) 04-0019-03
关键词:成纤维细胞; 细胞分离培养; 性别鉴定; 牛摘 要:为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法, 试验取自怀孕40d 的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养, 用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态; 根据牛Y 染色体上的性别决定区域(S R Y ) 基因序列设计合成1对P C R 引物作为性别鉴定引物, 同时根据牛403b p 的β-珠蛋白基因序列设计1对引物作为内参照引物, 建立P C R 反应体系进行性别鉴定。结果表明:分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖; 阳性对照和第1牛胎儿成纤维细胞系P C R 鉴定扩增得到255b p 的片段和403b p 的β-珠蛋白基因片段, 第2, 3牛胎儿成纤维细胞系和母牛血液P C R 扩增只得到403b p 的β-珠蛋白基因片段, 通过电泳证明P C R 产物255b p 的片段为S R Y 基因片段, 说明有255b p 扩增带的细胞系为雄性; 无255b p 扩增带的细胞系为雌性。结果说明该方法所获得的牛胎儿成纤维细胞可在体外稳定培养, 利用P C R 鉴定牛胎儿性别具有简单、快速、准确的特点, 可应用于基因克隆动物研究中体细胞系的早期性别鉴定。
C u l t u r e a n d s e x i d e n t i f i c a t i o no f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t s
M AZ h o n g -h u i , Z H A OQ i a o -x i a n g , Y A N GH u a n -m i n
(F a c u l t y o f A n i m a l S c i e n c e a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e , H e i l o n g j i a n g A u g u s t F i r s t L a n dR e c l a m a t i o nU n i v e r s i t y , D a q i n g 163319, C h i n a ) K e yw o r d s :f e t a l f i b r o b l a s t s ; c e l l i s o l a t i o na n dc u l t i v a t i o n ; s e xi d e n t i f i c a t i o n ; c a t t l e
A b s t r a c t :Th e s t u d y e x p l o r e dt h e m e t h o d o f i s o l a t i o n , c u l t i v a t i o n , a n ds e x i d e n t i f i c a t i o n o f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t s i nv i t r o .T h e e a r t i s s u e w a s c u l t u r e db y t i s s u e e x p l a n t a t t a c h m e n t a n do b s e r v e dt h e c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t s b yi n v e r t e dp h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p y o f 40d a y s c a t t l ef e t a l .A p a i r o f P C Rp r i m e r s w a s d e s i g n e d t o i d e n t i f y t h e s e x o f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t c e l l l i n e s a c c o r d i n g t o t h e c a t t l e S R Yg e n e . T h e i s o l a t e df i b r o b l a s t s c o u l d g r o wa n dp r o l i f e r a t e i nv i t r o . T h e f e m a l e s a m p l e a n d c e l l l i n e s d i dn o t a m p l i f y t h e 255b a n dp r o d u c t , c o n v e r s e l y . T h e r e s u l t i n d i c a t e s t h a t P C Ro f S R Yg e n e i s a s i m p l e , f a s t a n da c c u r a t e m e t h o dt o i d e n t i f y t h e s e xo f c a t t l e f e t a l f i r o b l a s t c e l l l i n e s , a n dc a n b e u s e d i nr o u t i n e s t u d y o nt r a n s g e n i cc l o n i n g a n i m a l s .
成纤维细胞指成熟的分化纤维细胞的增殖前体细胞, 呈梭型或星型, 中央有圆形核, 细胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞群常借原生质突起连接成网, 如果接触抑制, 汇合时平行排列。通常把未分化的中胚层细胞和长度超过其核直径3倍以上的
[1]
游走型细胞称为成纤维细胞。成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞, 属生长与裂殖迅速的细胞族群, 在适当的体外培养条件下能迅速增长繁殖。目前, 成纤维细胞已被广泛应用于细胞和分子生物学研究的许多方面。
研究旨在从牛胎儿耳组织中分离到成纤维细胞, 并用组织贴附培养法进行原代培养, 在传代培养过程中观察总结了体外培养成纤维细胞的生长特征, 用
收稿日期:2008-10-18作者简介:马忠辉(1983-) , 男, 硕士研究生.
, , , , P C R 法鉴定了性别, 找到一种简单、实用的胎儿体细
胞系早期性别鉴定方法, 为后续牛体细胞克隆与胚胎移植奠定基础。1 材料与方法1. 1 材料
牛胎儿、阳性对照与阴性对照牛血液, 取自黑龙江八一农垦大学农场; D M E M/F12, 购自G i b c o 公司; 胰蛋白酶, S i g m a 公司产品; 标准胎牛血清, T B D 公司产品; 细胞培养板与培养瓶, C o s t a r 公司产品; P C R 引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; T a q 酶、细胞基因组D N A 提取试剂盒, 购于天根生化科技有限公司。1. 2 牛胎儿成纤维细胞的分离培养
采用组织块贴附法:取胎龄为40d 的胎牛, 在无菌条件下用手术剪在P B S 液中剥除胎膜, 剪下分离出的牛胎儿(体长约2. 1c m ) 耳朵放入37℃灭菌生P B S 3
20
酒精消毒30s , 再用P B S 洗3遍; 将清洗好的牛胎儿耳尖用含10%血清的D M E M /F12培养液洗2次, 放
2
入培养皿中用眼科剪剪成1m m 左右的小块, 用镊子将剪碎的组织块转移到35m m 的3个卡氏培养瓶中, 用牙科探针将组织块铺展, 并使组织块内侧贴壁; 将已加好血清、双抗的D M E M/F12预热, 在每个培养瓶中加入5m L 预热好的培养基, 做好标记, 把培养瓶放入37℃、5%C O 2、饱和湿度的培养箱中培养, 使组织块贴壁, 5h 后轻轻翻瓶, 培养2d 后换液, 培养至第3天观察细胞生长情况。待细胞长到80%～90%汇合时, 将一部分细胞冷冻起来, 一部分按照1∶2的比例传代培养。1. 3 牛胎儿成纤维细胞生长曲线的测定
将牛胎儿成纤维细胞消化收集后, 按相同的密度
4
(2. 3×10/mL ) 接种于一个24孔培养板中, 37℃、5%C O 饱和湿度恒温培养; 每隔2d 换液, 每隔1d 2、
消化收集2孔细胞, 用血细胞计数板分别计数3孔的细胞数, 每孔计数3次求平均值。连续计数10d , 绘制生长曲线。1. 4 细胞D N A 的提取
用细胞基因组D N A 提取试剂盒提取牛胎儿成纤维细胞的基因组D N A , 用血液基因组D N A 提取试剂盒提取阳性对照与阴性对照牛基因组D N A , 作为P C R 反应的模板。1. 5 PC R 反应的引物序列及反应条件
根据G e n B a n k 数据库中牛S R Y 基因序列设计P C R 引物:P 15′-C C A G G G A A C T G C T T G G G T A-3′, P 25′-T G C T T C T C C A C T T A G G C T C A A -3′, 预计产物为255b p ; 根据牛β-珠蛋白基因序列设计合成1对内
[2]
标引物:P35′-T A T C C C A C T T A C A A G G C A G G T T-3′; P 45′-G C A G A C A A C A G A G A A C A A G A A T G A-3′, 预计产物为405b p 。
采用20μL 反应体系, 以牛基因组D N A 为模板, 反应条件为94℃预变性5m i n ; 94℃变性50s , 59℃退火30s , 72℃延伸1m i n , 30个循环; 72℃延伸10m i n 。2 结果2. 1 牛成纤维细胞的培养结果
组织块培养12h 后在倒置显微镜下观察, 可见组织块贴壁, 有少量细胞开始沿组织块周围向外生长; 培养第2天, 组织块边缘游离出许多单个细胞, 大多数为上皮样细胞及一些颗粒物质, 并呈晕状, 只有少部分游离出个别成纤维细胞; 培养第4天, 组织块周围仍有大量上皮样细胞, 但大部分组织已游离出成纤维细胞(见图1) ; 培养第6天上皮样细胞比例减少, 成纤维细胞已占多数, 成梭状延伸(见图2) ; 培养第8天成纤维细胞生长旺盛, 已基本铺满瓶底, 但组织块间仍有间隙(见图3) ; 培养第10天后组织块间
,
H e i l o n g j i a n g A n i m a l S c i e n c e
a n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e №
42009
图1 培养第4天成纤维细胞游出
(相差显微镜, 10×10)
F i g 1 To c u l t i v a t e t h e e m i g r a t i o n o f f e t a l f i b r o b l a s t s a t 4d a y s (p h a s e -c o n t r a s t mi c r o s c o p e , 10×10)
图2 培养第6天成纤维细胞呈梭状延伸
(相差显微镜, 10×10)
F i g 2 Toc u l t i v a t e t h e s p i n d l e e x t e n s i o no f f e t a l f i b r o b l a s t s
a t 6d a y s (p h a s e -c o n t r a s t mi c r o s c o p e , 10×10)
图3 培养第8天成纤维细胞铺满(相差显微镜, 10×10) F i g 3 To c u l t i v a t e t h e f u l l f e t a l f i b r o b l a s t s
a t 8d a y s (p h a s e -c o n t r a s t m i c r o s c o p e , 10×10)
图4 培养第10天成纤维细胞汇合(相差显微镜, 10×10) F i g 4 To j o i n t h e f e t a l f i b r o b l a s t s a t 10d a y s
(p h a s e -c o n t r a s t m i c r o s c o p e , 10×10)
2. 2 牛成纤维细胞的生长曲线
4
牛胎儿成纤维细胞以2. 3×10个/mL 接种于24孔细胞培养板中, 6～10d 长满细胞。每隔2d 换液, 隔1d 计数3孔细胞数, 取平均值, 连续计数10d , 绘制生长曲线(见图5) 。由图5可见, 牛胎儿成纤维细胞生长增殖的滞留期为0～1d , 对数生长期为2～6d , 平台期为7～10d , 第10天开始有下降趋势。
《黑龙江畜牧兽医》科技版
2009年4月(上
) 21
3 讨论
当前对牛胎儿成纤维细胞培养比较常用的方法有组织块贴附法和酶消化法。组织块贴附法简便易行, 得到的细胞均质性好, 易于操作, 而且不用胰蛋白
[3]
酶消化, 避免对细胞造成伤害。所以, 试验选用组织块贴附法培养细胞。
用组织块贴附法培养牛胎儿成纤维细胞时, 细胞呈贴附型生长, 原代和早期传代细胞是上皮样和成纤维样细胞的混合物, 从发育生物学角度来看, 二者来源不同, 上皮样细胞来源于外胚层, 成纤维细胞来源
[4]
于中胚层。组织块培养初期, 由于细胞仍基于原组织生长, 所以首先移出生长的主要是上皮样细胞, 成纤维样细胞由于母细胞数量少而显得增加数量较慢。但随着细胞在体外传代次数的增加上皮样细胞逐步被淘汰。成纤维细胞对消化液比上皮细胞更敏感, 通过控制适宜的消化时间可以使成纤维细胞脱壁, 而上皮细胞仍保持贴壁, 经过3～5次传代纯化
[5]
后, 就可以得到比较纯的成纤维细胞。本试验细胞生长曲线呈“S”型, 表现为潜伏期、对数生长期和平台期, 接种第1天细胞刚刚贴壁, 处于恢复期, 细胞数量基本保持不变; 从第2天进入对数生长期; 3～6d 为增殖高峰期, 6d 后进入平台期, 细胞逐渐长满, 10d 后由于接触抑制开始走向衰亡。
试验通过P C R 扩增反应扩增出公牛的一段近255b p 的S R Y 基因特异性片段和403b p 的β-珠蛋白基因特异性片段, 而牛胎儿成纤维细胞、阴性对照母牛和空白对照只有403b p 的β-珠蛋白基因特异性片段。故判定有255b p 扩增带的母体为公牛, 而无此带的为母牛。这一结论为转基因克隆动物研究中转染目的基因以及保存和扩增性别已知的胎儿成纤维细胞系提供了可靠的依据, 也进一步说明P C R 法对细胞系性别进行早期鉴定, 在家畜体细胞克隆与胚胎移植中具有很大的应用价值。参考文献:
[1] 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[M ]. 西安:世界图书出版社,
1997.
[2] 陈红星, 程萱, 杨晓, 等. 牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组
织纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达[J ]. 生物工程学报, 2000, 17(2) :135-139.
[3] 杨东山, 杜晨光, 高飞, 等. 牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法
分离培养与电穿孔法基因转染[J ].动物学研究, 2006, 27(1) :41-47.
[4] 李扬, 郭继彤, 吴凯峰, 等. 牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培
养[J ]. 细胞生物学杂志, 2002, 24(4) :254-255.
[5] X UJ , G U O Z , S U L , e t a l .D e v e l o p m e n t a l p o t e n t i a l o f v i t r i f i e d
h o l s t e i nc a t t l ee m b r y o sf e r t i l i z e di nv i t r ow i t hs e x-s o r t e ds p e r m
图5 牛胎儿成纤维细胞生长曲线
F i g 5 T h e g r o w t h c u r v e o f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t c e l l s c u l t u r e d i n v i t r o
2. 3 牛基因组D N A 的提取结果
从牛胎儿成纤维细胞、牛血液中提取牛基因组D N A , 经0. 8%琼脂糖凝胶电泳, 得到的条带大小为20k b 左右(结果见图6) , 这与G e n B a n k 中的一致
。
M .λD N A/Hi n d ⅢM a r k e r ; 1. 公牛血液基因组; 2. 母牛血液基因组; 3. 牛胎儿成纤维细胞基因组。
图6 牛基因组D N A 的提取
F i g 6 Ag a r o s e g e l a n a l y s i s o f g e n o m i c D N Af r o m c a t t l e
2. 4 PC R 扩增结果
分别以公牛、母牛血液基因组D N A 和牛胎儿成纤维细胞基因组D N A 为模板进行P C R 反应, 反应后各取10μL , 用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果见图7。由图7可见:以阳性对照公牛血液基因组D N A 为模板扩增得到403b p 的β-珠蛋白基因和255b p 的S R Y 基因2条扩增带(1泳道) ; 以阴性对照母牛血液基因组D N A 为模板扩增得到403b p 的1条扩增带(2泳道) 。以牛胎儿成纤维细胞基因组D N A 为模板扩增结果见3, 4, 6泳道, 第3号泳道(第1牛胎儿成纤维细胞系) 有403b p 的β-珠蛋白基因和255b p 的S R Y 基因2条扩增带, 第4, 6号(第2, 3牛胎儿成纤维细胞系) 只有β-珠蛋白基因基因扩增带而没有S R Y 基因条带, 故可确定第1牛胎儿成纤维细胞系的供体胎牛为公牛, 第2, 3牛胎儿成纤维细胞系的供体胎牛为母牛
。
M .p U C 18D N A/Ms p ⅠM a r k e r ; 1. 阳性对照; 2. 阴性对照;
3, 4, 6. 第1, 2, 3细胞系; 5, 7. 空白对照。
[J ].J D a i r y S c i , 2006, 89(7) :2510-2518.
(009)
图7 牛胎儿成纤维细胞性别P C R 鉴定F i g 7 PC R a mp l i f i c a t i o no f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t s
《黑龙江畜牧兽医》科技版
DOI :10. 13881/j . cn ki . hljx m sy . 2009. 07. 018
2009年4月(上) 19
牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定
马忠辉, 赵巧香, 杨焕民
(黑龙江八一农垦大学动物科技学院, 黑龙江大庆163319)
中图分类号:S 823
文献标识码:A
文章编号:1004-7034(2009) 04-0019-03
关键词:成纤维细胞; 细胞分离培养; 性别鉴定; 牛摘 要:为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法, 试验取自怀孕40d 的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养, 用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态; 根据牛Y 染色体上的性别决定区域(S R Y ) 基因序列设计合成1对P C R 引物作为性别鉴定引物, 同时根据牛403b p 的β-珠蛋白基因序列设计1对引物作为内参照引物, 建立P C R 反应体系进行性别鉴定。结果表明:分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖; 阳性对照和第1牛胎儿成纤维细胞系P C R 鉴定扩增得到255b p 的片段和403b p 的β-珠蛋白基因片段, 第2, 3牛胎儿成纤维细胞系和母牛血液P C R 扩增只得到403b p 的β-珠蛋白基因片段, 通过电泳证明P C R 产物255b p 的片段为S R Y 基因片段, 说明有255b p 扩增带的细胞系为雄性; 无255b p 扩增带的细胞系为雌性。结果说明该方法所获得的牛胎儿成纤维细胞可在体外稳定培养, 利用P C R 鉴定牛胎儿性别具有简单、快速、准确的特点, 可应用于基因克隆动物研究中体细胞系的早期性别鉴定。
C u l t u r e a n d s e x i d e n t i f i c a t i o no f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t s
M AZ h o n g -h u i , Z H A OQ i a o -x i a n g , Y A N GH u a n -m i n
(F a c u l t y o f A n i m a l S c i e n c e a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e , H e i l o n g j i a n g A u g u s t F i r s t L a n dR e c l a m a t i o nU n i v e r s i t y , D a q i n g 163319, C h i n a ) K e yw o r d s :f e t a l f i b r o b l a s t s ; c e l l i s o l a t i o na n dc u l t i v a t i o n ; s e xi d e n t i f i c a t i o n ; c a t t l e
A b s t r a c t :Th e s t u d y e x p l o r e dt h e m e t h o d o f i s o l a t i o n , c u l t i v a t i o n , a n ds e x i d e n t i f i c a t i o n o f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t s i nv i t r o .T h e e a r t i s s u e w a s c u l t u r e db y t i s s u e e x p l a n t a t t a c h m e n t a n do b s e r v e dt h e c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t s b yi n v e r t e dp h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p y o f 40d a y s c a t t l ef e t a l .A p a i r o f P C Rp r i m e r s w a s d e s i g n e d t o i d e n t i f y t h e s e x o f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t c e l l l i n e s a c c o r d i n g t o t h e c a t t l e S R Yg e n e . T h e i s o l a t e df i b r o b l a s t s c o u l d g r o wa n dp r o l i f e r a t e i nv i t r o . T h e f e m a l e s a m p l e a n d c e l l l i n e s d i dn o t a m p l i f y t h e 255b a n dp r o d u c t , c o n v e r s e l y . T h e r e s u l t i n d i c a t e s t h a t P C Ro f S R Yg e n e i s a s i m p l e , f a s t a n da c c u r a t e m e t h o dt o i d e n t i f y t h e s e xo f c a t t l e f e t a l f i r o b l a s t c e l l l i n e s , a n dc a n b e u s e d i nr o u t i n e s t u d y o nt r a n s g e n i cc l o n i n g a n i m a l s .
成纤维细胞指成熟的分化纤维细胞的增殖前体细胞, 呈梭型或星型, 中央有圆形核, 细胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞群常借原生质突起连接成网, 如果接触抑制, 汇合时平行排列。通常把未分化的中胚层细胞和长度超过其核直径3倍以上的
[1]
游走型细胞称为成纤维细胞。成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞, 属生长与裂殖迅速的细胞族群, 在适当的体外培养条件下能迅速增长繁殖。目前, 成纤维细胞已被广泛应用于细胞和分子生物学研究的许多方面。
研究旨在从牛胎儿耳组织中分离到成纤维细胞, 并用组织贴附培养法进行原代培养, 在传代培养过程中观察总结了体外培养成纤维细胞的生长特征, 用
收稿日期:2008-10-18作者简介:马忠辉(1983-) , 男, 硕士研究生.
, , , , P C R 法鉴定了性别, 找到一种简单、实用的胎儿体细
胞系早期性别鉴定方法, 为后续牛体细胞克隆与胚胎移植奠定基础。1 材料与方法1. 1 材料
牛胎儿、阳性对照与阴性对照牛血液, 取自黑龙江八一农垦大学农场; D M E M/F12, 购自G i b c o 公司; 胰蛋白酶, S i g m a 公司产品; 标准胎牛血清, T B D 公司产品; 细胞培养板与培养瓶, C o s t a r 公司产品; P C R 引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; T a q 酶、细胞基因组D N A 提取试剂盒, 购于天根生化科技有限公司。1. 2 牛胎儿成纤维细胞的分离培养
采用组织块贴附法:取胎龄为40d 的胎牛, 在无菌条件下用手术剪在P B S 液中剥除胎膜, 剪下分离出的牛胎儿(体长约2. 1c m ) 耳朵放入37℃灭菌生P B S 3
20
酒精消毒30s , 再用P B S 洗3遍; 将清洗好的牛胎儿耳尖用含10%血清的D M E M /F12培养液洗2次, 放
2
入培养皿中用眼科剪剪成1m m 左右的小块, 用镊子将剪碎的组织块转移到35m m 的3个卡氏培养瓶中, 用牙科探针将组织块铺展, 并使组织块内侧贴壁; 将已加好血清、双抗的D M E M/F12预热, 在每个培养瓶中加入5m L 预热好的培养基, 做好标记, 把培养瓶放入37℃、5%C O 2、饱和湿度的培养箱中培养, 使组织块贴壁, 5h 后轻轻翻瓶, 培养2d 后换液, 培养至第3天观察细胞生长情况。待细胞长到80%～90%汇合时, 将一部分细胞冷冻起来, 一部分按照1∶2的比例传代培养。1. 3 牛胎儿成纤维细胞生长曲线的测定
将牛胎儿成纤维细胞消化收集后, 按相同的密度
4
(2. 3×10/mL ) 接种于一个24孔培养板中, 37℃、5%C O 饱和湿度恒温培养; 每隔2d 换液, 每隔1d 2、
消化收集2孔细胞, 用血细胞计数板分别计数3孔的细胞数, 每孔计数3次求平均值。连续计数10d , 绘制生长曲线。1. 4 细胞D N A 的提取
用细胞基因组D N A 提取试剂盒提取牛胎儿成纤维细胞的基因组D N A , 用血液基因组D N A 提取试剂盒提取阳性对照与阴性对照牛基因组D N A , 作为P C R 反应的模板。1. 5 PC R 反应的引物序列及反应条件
根据G e n B a n k 数据库中牛S R Y 基因序列设计P C R 引物:P 15′-C C A G G G A A C T G C T T G G G T A-3′, P 25′-T G C T T C T C C A C T T A G G C T C A A -3′, 预计产物为255b p ; 根据牛β-珠蛋白基因序列设计合成1对内
[2]
标引物:P35′-T A T C C C A C T T A C A A G G C A G G T T-3′; P 45′-G C A G A C A A C A G A G A A C A A G A A T G A-3′, 预计产物为405b p 。
采用20μL 反应体系, 以牛基因组D N A 为模板, 反应条件为94℃预变性5m i n ; 94℃变性50s , 59℃退火30s , 72℃延伸1m i n , 30个循环; 72℃延伸10m i n 。2 结果2. 1 牛成纤维细胞的培养结果
组织块培养12h 后在倒置显微镜下观察, 可见组织块贴壁, 有少量细胞开始沿组织块周围向外生长; 培养第2天, 组织块边缘游离出许多单个细胞, 大多数为上皮样细胞及一些颗粒物质, 并呈晕状, 只有少部分游离出个别成纤维细胞; 培养第4天, 组织块周围仍有大量上皮样细胞, 但大部分组织已游离出成纤维细胞(见图1) ; 培养第6天上皮样细胞比例减少, 成纤维细胞已占多数, 成梭状延伸(见图2) ; 培养第8天成纤维细胞生长旺盛, 已基本铺满瓶底, 但组织块间仍有间隙(见图3) ; 培养第10天后组织块间
,
H e i l o n g j i a n g A n i m a l S c i e n c e
a n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e №
42009
图1 培养第4天成纤维细胞游出
(相差显微镜, 10×10)
F i g 1 To c u l t i v a t e t h e e m i g r a t i o n o f f e t a l f i b r o b l a s t s a t 4d a y s (p h a s e -c o n t r a s t mi c r o s c o p e , 10×10)
图2 培养第6天成纤维细胞呈梭状延伸
(相差显微镜, 10×10)
F i g 2 Toc u l t i v a t e t h e s p i n d l e e x t e n s i o no f f e t a l f i b r o b l a s t s
a t 6d a y s (p h a s e -c o n t r a s t mi c r o s c o p e , 10×10)
图3 培养第8天成纤维细胞铺满(相差显微镜, 10×10) F i g 3 To c u l t i v a t e t h e f u l l f e t a l f i b r o b l a s t s
a t 8d a y s (p h a s e -c o n t r a s t m i c r o s c o p e , 10×10)
图4 培养第10天成纤维细胞汇合(相差显微镜, 10×10) F i g 4 To j o i n t h e f e t a l f i b r o b l a s t s a t 10d a y s
(p h a s e -c o n t r a s t m i c r o s c o p e , 10×10)
2. 2 牛成纤维细胞的生长曲线
4
牛胎儿成纤维细胞以2. 3×10个/mL 接种于24孔细胞培养板中, 6～10d 长满细胞。每隔2d 换液, 隔1d 计数3孔细胞数, 取平均值, 连续计数10d , 绘制生长曲线(见图5) 。由图5可见, 牛胎儿成纤维细胞生长增殖的滞留期为0～1d , 对数生长期为2～6d , 平台期为7～10d , 第10天开始有下降趋势。
《黑龙江畜牧兽医》科技版
2009年4月(上
) 21
3 讨论
当前对牛胎儿成纤维细胞培养比较常用的方法有组织块贴附法和酶消化法。组织块贴附法简便易行, 得到的细胞均质性好, 易于操作, 而且不用胰蛋白
[3]
酶消化, 避免对细胞造成伤害。所以, 试验选用组织块贴附法培养细胞。
用组织块贴附法培养牛胎儿成纤维细胞时, 细胞呈贴附型生长, 原代和早期传代细胞是上皮样和成纤维样细胞的混合物, 从发育生物学角度来看, 二者来源不同, 上皮样细胞来源于外胚层, 成纤维细胞来源
[4]
于中胚层。组织块培养初期, 由于细胞仍基于原组织生长, 所以首先移出生长的主要是上皮样细胞, 成纤维样细胞由于母细胞数量少而显得增加数量较慢。但随着细胞在体外传代次数的增加上皮样细胞逐步被淘汰。成纤维细胞对消化液比上皮细胞更敏感, 通过控制适宜的消化时间可以使成纤维细胞脱壁, 而上皮细胞仍保持贴壁, 经过3～5次传代纯化
[5]
后, 就可以得到比较纯的成纤维细胞。本试验细胞生长曲线呈“S”型, 表现为潜伏期、对数生长期和平台期, 接种第1天细胞刚刚贴壁, 处于恢复期, 细胞数量基本保持不变; 从第2天进入对数生长期; 3～6d 为增殖高峰期, 6d 后进入平台期, 细胞逐渐长满, 10d 后由于接触抑制开始走向衰亡。
试验通过P C R 扩增反应扩增出公牛的一段近255b p 的S R Y 基因特异性片段和403b p 的β-珠蛋白基因特异性片段, 而牛胎儿成纤维细胞、阴性对照母牛和空白对照只有403b p 的β-珠蛋白基因特异性片段。故判定有255b p 扩增带的母体为公牛, 而无此带的为母牛。这一结论为转基因克隆动物研究中转染目的基因以及保存和扩增性别已知的胎儿成纤维细胞系提供了可靠的依据, 也进一步说明P C R 法对细胞系性别进行早期鉴定, 在家畜体细胞克隆与胚胎移植中具有很大的应用价值。参考文献:
[1] 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[M ]. 西安:世界图书出版社,
1997.
[2] 陈红星, 程萱, 杨晓, 等. 牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组
织纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达[J ]. 生物工程学报, 2000, 17(2) :135-139.
[3] 杨东山, 杜晨光, 高飞, 等. 牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法
分离培养与电穿孔法基因转染[J ].动物学研究, 2006, 27(1) :41-47.
[4] 李扬, 郭继彤, 吴凯峰, 等. 牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培
养[J ]. 细胞生物学杂志, 2002, 24(4) :254-255.
[5] X UJ , G U O Z , S U L , e t a l .D e v e l o p m e n t a l p o t e n t i a l o f v i t r i f i e d
h o l s t e i nc a t t l ee m b r y o sf e r t i l i z e di nv i t r ow i t hs e x-s o r t e ds p e r m
图5 牛胎儿成纤维细胞生长曲线
F i g 5 T h e g r o w t h c u r v e o f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t c e l l s c u l t u r e d i n v i t r o
2. 3 牛基因组D N A 的提取结果
从牛胎儿成纤维细胞、牛血液中提取牛基因组D N A , 经0. 8%琼脂糖凝胶电泳, 得到的条带大小为20k b 左右(结果见图6) , 这与G e n B a n k 中的一致
。
M .λD N A/Hi n d ⅢM a r k e r ; 1. 公牛血液基因组; 2. 母牛血液基因组; 3. 牛胎儿成纤维细胞基因组。
图6 牛基因组D N A 的提取
F i g 6 Ag a r o s e g e l a n a l y s i s o f g e n o m i c D N Af r o m c a t t l e
2. 4 PC R 扩增结果
分别以公牛、母牛血液基因组D N A 和牛胎儿成纤维细胞基因组D N A 为模板进行P C R 反应, 反应后各取10μL , 用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果见图7。由图7可见:以阳性对照公牛血液基因组D N A 为模板扩增得到403b p 的β-珠蛋白基因和255b p 的S R Y 基因2条扩增带(1泳道) ; 以阴性对照母牛血液基因组D N A 为模板扩增得到403b p 的1条扩增带(2泳道) 。以牛胎儿成纤维细胞基因组D N A 为模板扩增结果见3, 4, 6泳道, 第3号泳道(第1牛胎儿成纤维细胞系) 有403b p 的β-珠蛋白基因和255b p 的S R Y 基因2条扩增带, 第4, 6号(第2, 3牛胎儿成纤维细胞系) 只有β-珠蛋白基因基因扩增带而没有S R Y 基因条带, 故可确定第1牛胎儿成纤维细胞系的供体胎牛为公牛, 第2, 3牛胎儿成纤维细胞系的供体胎牛为母牛
。
M .p U C 18D N A/Ms p ⅠM a r k e r ; 1. 阳性对照; 2. 阴性对照;
3, 4, 6. 第1, 2, 3细胞系; 5, 7. 空白对照。
[J ].J D a i r y S c i , 2006, 89(7) :2510-2518.
(009)
图7 牛胎儿成纤维细胞性别P C R 鉴定F i g 7 PC R a mp l i f i c a t i o no f c a t t l e f e t a l f i b r o b l a s t s