２００７，２７（１２）
２．１．４
王英国等：解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究
２（Ｘ）∞
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４３
ＨＰＬＣ分离将经过上一步层析得到的样品溶
解，过高效液相色谱柱，得到图２，收集各个峰进行活性测定，发现峰Ⅱ具有抗真菌活性。将其冷冻干燥纯化得到淡黄色粉末。
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２．２活性物质分子量的测定
采用ＥｓＩ质谱分析仪测得该活性物质的分子量为
１４９８
Ｄａ。如图３所示。１４９９．５５为［Ｍ＋Ｈ］＋，７７２．５５
为［Ｍ＋Ｎａ＋Ｎａ］２＋／２。将Ｉｎ／ｚ为Ｏ－７００部分局部放大得到图４，对其中ｎ∥ｚ的峰值分析表明：碎片中有许多氨基酸残基；如：２６０—１２９＝１３１（Ｍｅｔ），５１１—４１２＝９９（Ｖａｌ），５４９—４１２＝１３７（Ｈｉｓ），５８２—５１１＝７１（Ａｌａ）。初步断定该物质为肽类。
７
图５活性物质的红外光谱图
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１５００
示菌尖孢镰刀菌等的抑菌活性。发现该物质有很好的抗真菌效果，与现在广泛使用的井冈霉素抑菌效果相当。空白对照实验抑菌圈直径都为０ｍｍ，没有列入表中。抑菌谱图如下（表１）。
表１活性物质与阳性对照的抑菌谱图
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图３活性物质的ＥＳＩ榔谱图
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２．３红外光谱分析
红外光谱扫描得图５。３４１０ｃｍ‘１为Ｎ－Ｈ伸缩振动，
１６４７锄．１为Ｃ＝Ｏ伸缩振动，１４舵ｃｍ以为Ｃ甜伸缩振动，２９３５咖“为脂肪碳链中的Ｃ羽键伸缩振动。３６６０锄“为Ｏ冉的伸缩振动。６１７３咖一为ｃｓ的伸缩振动。以上数据
说明该物质中可能含有肽键，饱和ｃ－Ｈ键，ＤＨ，ＣＳ键。在１７ｃｌＤ左右没有吸收，说明不含有酯类结构。２．４分离纯化所得物质的抑菌活性
采用牛津杯定量扩散法测定纯化的活性物质对指
２．５活性物质对真菌菌丝形态的影响
用显微镜观察草莓蛇病菌在被抑制前后菌丝生长的变化（图６）。Ａ为抑菌效果图，Ｂ为正常菌丝，Ｃ为被抑制的菌丝。从图中可以看出，草莓蛇病菌正常生
中国生物工程杂志Ｃｈｉｎａ
长时，菌丝细长，且有许多分生孢子；当被抑制后，菌丝弯曲，顶端膨大，分生孢子数量减少。由此可见，该抗
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖ０１．２７Ｎｏ．１２２００７
菌活性物质能够明显地影响草莓蛇病菌菌丝的生长。
图６活性物质作用下草莓蛇菌丝形态的变化
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３讨论
植物真菌病害给农业生产带来了巨大的损失¨¨，随着病害的日趋严重，化学农药的使用量也日趋增多，尽管在一定程度上化学农药起到了作用，但它对环境造成了相当严重的破坏Ｈ引，而且长期使用还会使某些病原真菌的抗性增加ｕ３’¨’，不能达到根治病害的效果。因此生物农药的开发迫在眉睫。解淀粉芽孢杆菌是一株具有广谱抑菌活性的细菌，发酵液中至少含有两种活性物质。它能够抑制很多植物病原真菌和食品腐败真菌。本文所分离的活性物质具有极强的抑菌活性，所产生的抑菌圈大于实验室中的其他拮抗菌种，而且具有很多优良的特性，将来在农业生防和食品保鲜中会有很广泛的应用。
本文对解淀粉芽孢杆菌产生的抗菌活性物质进行了分离纯化并对其抑菌活性进行了相应的研究。在纯化过程中尝试过有机溶剂萃取和盐酸沉淀，但没有成功，最终利用柱层析的手段达到了分离纯化的目的。该物质易溶于水、极性有机溶剂，具有一定的亲水性。测得活性物质的分子量为１４９８Ｄａ。通过红外和质谱推测该物质为肽类。据报道，芽孢杆菌能够产生多种抗菌物质，１９７３年Ｐｅｙｐｏ慨等¨副从枯草芽孢杆菌中分
类物质，但性质方面有所差别：Ｆｅｎｇｙｃｉｎ不溶于水，而本文的活性物质却有很好的水溶性，并且含有甲硫氨酸，从红外图谱中的ｃｓ伸缩振动可进一步说明该氨基酸的存在，以往发现的抗菌肽中并不含有甲硫氨酸ｍ１；该物质的分子量与以往发现的抗菌肽也有一定的差别，因此推测该活性肽为新型物质。下一步的计划是对其结构进行更深入的研究，相应机理方面的工作也正在准备之中。
参考文献
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ｆｒｕｉｔｐｒｏｄｕｃ６仰ｂｙｔ．ＩｅＥＢＷ４蚰面ｎｏｆＢ眦埘ＷｌＩ‘６‘妇ｉｎａｐｐｌｅ
ｔｈｅ咖ｈＤｌ０ｆ印ｐｌｅ
ｒｅｐｌａ呲ｄｉ８ｅ脚蚰ｉｌ．Ｃ蛐ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２，３８：１２７０～１２７３
［５］潘恩霖．微生物作为天然防腐剂的应用和展望．南平师专学
报。２００ｌ，２０（２）：６８～７０Ｐ肌ＥＬ．Ｊ叭ｍａｌ
＿７０
０ｆ
离得到Ｉｔｕｒｉｎ，１９８６年ＶａｎｉｔｔａＩｌａｌ【啪等¨刮从枯草芽孢杆
菌Ｆ＿２９－３分离纯化得到Ｆｅｎｇ）ｒｃｉｎ。它们大多为低分子量脂肽类物质。本文所分离的物质也为低分子量的肽
Ｎ明ｐｉｎｇＴｅａｃｈ嘶ＣｏＵｅｇｅ，２００１，２０（２）：鹋
［６］王军华，权春善，徐洪涛，等．解淀粉芽孢杆菌Ｑ・１２抗真菌
特性的研究．食品与发酵工业，２００６，３２（６）：４７—４８
解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究
作者：作者单位：
王英国， 王军华， 权春善， 范圣第， WANG Ying-guo， WANG Jun-hua， QUAN Chun-shan ， FAN Sheng-di
王英国,WANG Ying-guo(中国科学院大连化学物理研究所,大连,116023;中国科学院研究生院,北京,100049)， 王军华,权春善,范圣第,WANG Jun-hua,QUAN Chun-shan,FAN Sheng-di(大连民族学院生命科学学院,大连,116600)中国生物工程杂志CHINA BIOTECHNOLOGY2007,27(12)16次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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15. 代岩石. 吴子丹. 伍松陵. 王松雪. 宋慧. 孙长坡 一株拮抗储粮真菌的细菌菌株鉴定和初步研究[期刊论文]-中国粮油学报 2010(10)
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引用本文格式：王英国. 王军华. 权春善. 范圣第. WANG Ying-guo. WANG Jun-hua. QUAN Chun-shan. FAN Sheng-di 解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究[期刊论文]-中国生物工程杂志 2007(12)
２００７，２７（１２）
２．１．４
王英国等：解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究
２（Ｘ）∞
１７５００１５阱１１）
４３
ＨＰＬＣ分离将经过上一步层析得到的样品溶
解，过高效液相色谱柱，得到图２，收集各个峰进行活性测定，发现峰Ⅱ具有抗真菌活性。将其冷冻干燥纯化得到淡黄色粉末。
３∞
２Ｓ０２００
皇１００００
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５ｌ晴ｍ２５００
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５００６００
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图４活性物质的ＥＳＩ埘Ｓ谱图（０－７∞）
矾ｇ．４ＥＳＩ赳Ｓｐｍｍｅｏｆａｃｔｉｖｅ鲫ｂｓｔａｎ∞（０习∞）
２．５
５．０
７．５ｔ，ｍｉｎ
１０．０
１２．５
Ｏ．Ｏ
图２活性物质的Ｉ口ＬＣ谱图ｎｇ．２
ＩⅡ．ＬＣａｎａｌｙｓｉｓ０ｆ
ａｃｔｉｗ锄ｂｓｔ粕ｃｅ
２．２活性物质分子量的测定
采用ＥｓＩ质谱分析仪测得该活性物质的分子量为
１４９８
Ｄａ。如图３所示。１４９９．５５为［Ｍ＋Ｈ］＋，７７２．５５
为［Ｍ＋Ｎａ＋Ｎａ］２＋／２。将Ｉｎ／ｚ为Ｏ－７００部分局部放大得到图４，对其中ｎ∥ｚ的峰值分析表明：碎片中有许多氨基酸残基；如：２６０—１２９＝１３１（Ｍｅｔ），５１１—４１２＝９９（Ｖａｌ），５４９—４１２＝１３７（Ｈｉｓ），５８２—５１１＝７１（Ａｌａ）。初步断定该物质为肽类。
７
图５活性物质的红外光谱图
ｎｇ．５
ｍｓｐ∞ｔ１１岫ｏｆａｃｔｉ靶鲫ｂｓｔ蚰∞
姗咖姗
ｏ
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ｍ／ｚ
１０００
１５００
示菌尖孢镰刀菌等的抑菌活性。发现该物质有很好的抗真菌效果，与现在广泛使用的井冈霉素抑菌效果相当。空白对照实验抑菌圈直径都为０ｍｍ，没有列入表中。抑菌谱图如下（表１）。
表１活性物质与阳性对照的抑菌谱图
ＴａＭｅ１
§
蕾一誊２
Ａｎｔｉｌｎｉｃｍｂｉａｌ
ｓｐｅｃｌ【舢ｏｆａｃｔｉⅥ
枷＂Ｈ蛔∞∞Ⅷ缸＝。
Ｗｉｄｌｌｌ
规她ｔａⅡｃｅ瓶ｄｖａｌｉｄ枷ｙｄｎ
‰‘腻Ｍ唱ａＩｌｊ８”
０ｆ跚肆ｈｄ曲ｉ曲ｎ（棚）
图３活性物质的ＥＳＩ榔谱图
ｎｇ．３
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２．３红外光谱分析
红外光谱扫描得图５。３４１０ｃｍ‘１为Ｎ－Ｈ伸缩振动，
１６４７锄．１为Ｃ＝Ｏ伸缩振动，１４舵ｃｍ以为Ｃ甜伸缩振动，２９３５咖“为脂肪碳链中的Ｃ羽键伸缩振动。３６６０锄“为Ｏ冉的伸缩振动。６１７３咖一为ｃｓ的伸缩振动。以上数据
说明该物质中可能含有肽键，饱和ｃ－Ｈ键，ＤＨ，ＣＳ键。在１７ｃｌＤ左右没有吸收，说明不含有酯类结构。２．４分离纯化所得物质的抑菌活性
采用牛津杯定量扩散法测定纯化的活性物质对指
２．５活性物质对真菌菌丝形态的影响
用显微镜观察草莓蛇病菌在被抑制前后菌丝生长的变化（图６）。Ａ为抑菌效果图，Ｂ为正常菌丝，Ｃ为被抑制的菌丝。从图中可以看出，草莓蛇病菌正常生
中国生物工程杂志Ｃｈｉｎａ
长时，菌丝细长，且有许多分生孢子；当被抑制后，菌丝弯曲，顶端膨大，分生孢子数量减少。由此可见，该抗
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖ０１．２７Ｎｏ．１２２００７
菌活性物质能够明显地影响草莓蛇病菌菌丝的生长。
图６活性物质作用下草莓蛇菌丝形态的变化
Ｆｉｇ．６彤钕缸０ｆ越ｔｉｖｅｓｕｂｓｔ粕∞蚰ｍｅ
ｈｙｐｈａｌｍｏｒｐｈｏｌｏ科ｏｆ置删ｌＨ细妇组ｚＥ职以ｄＳａ∞
３讨论
植物真菌病害给农业生产带来了巨大的损失¨¨，随着病害的日趋严重，化学农药的使用量也日趋增多，尽管在一定程度上化学农药起到了作用，但它对环境造成了相当严重的破坏Ｈ引，而且长期使用还会使某些病原真菌的抗性增加ｕ３’¨’，不能达到根治病害的效果。因此生物农药的开发迫在眉睫。解淀粉芽孢杆菌是一株具有广谱抑菌活性的细菌，发酵液中至少含有两种活性物质。它能够抑制很多植物病原真菌和食品腐败真菌。本文所分离的活性物质具有极强的抑菌活性，所产生的抑菌圈大于实验室中的其他拮抗菌种，而且具有很多优良的特性，将来在农业生防和食品保鲜中会有很广泛的应用。
本文对解淀粉芽孢杆菌产生的抗菌活性物质进行了分离纯化并对其抑菌活性进行了相应的研究。在纯化过程中尝试过有机溶剂萃取和盐酸沉淀，但没有成功，最终利用柱层析的手段达到了分离纯化的目的。该物质易溶于水、极性有机溶剂，具有一定的亲水性。测得活性物质的分子量为１４９８Ｄａ。通过红外和质谱推测该物质为肽类。据报道，芽孢杆菌能够产生多种抗菌物质，１９７３年Ｐｅｙｐｏ慨等¨副从枯草芽孢杆菌中分
类物质，但性质方面有所差别：Ｆｅｎｇｙｃｉｎ不溶于水，而本文的活性物质却有很好的水溶性，并且含有甲硫氨酸，从红外图谱中的ｃｓ伸缩振动可进一步说明该氨基酸的存在，以往发现的抗菌肽中并不含有甲硫氨酸ｍ１；该物质的分子量与以往发现的抗菌肽也有一定的差别，因此推测该活性肽为新型物质。下一步的计划是对其结构进行更深入的研究，相应机理方面的工作也正在准备之中。
参考文献
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［５］潘恩霖．微生物作为天然防腐剂的应用和展望．南平师专学
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０ｆ
离得到Ｉｔｕｒｉｎ，１９８６年ＶａｎｉｔｔａＩｌａｌ【啪等¨刮从枯草芽孢杆
菌Ｆ＿２９－３分离纯化得到Ｆｅｎｇ）ｒｃｉｎ。它们大多为低分子量脂肽类物质。本文所分离的物质也为低分子量的肽
Ｎ明ｐｉｎｇＴｅａｃｈ嘶ＣｏＵｅｇｅ，２００１，２０（２）：鹋
［６］王军华，权春善，徐洪涛，等．解淀粉芽孢杆菌Ｑ・１２抗真菌
特性的研究．食品与发酵工业，２００６，３２（６）：４７—４８
解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究
作者：作者单位：
王英国， 王军华， 权春善， 范圣第， WANG Ying-guo， WANG Jun-hua， QUAN Chun-shan ， FAN Sheng-di
王英国,WANG Ying-guo(中国科学院大连化学物理研究所,大连,116023;中国科学院研究生院,北京,100049)， 王军华,权春善,范圣第,WANG Jun-hua,QUAN Chun-shan,FAN Sheng-di(大连民族学院生命科学学院,大连,116600)中国生物工程杂志CHINA BIOTECHNOLOGY2007,27(12)16次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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