纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定

第19卷第5期印染助剂

Vol.19No.5纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定

张瑞萍

(南通工学院,江苏南通226007)

摘滤纸或CMC,(和CMC酶活(CMCA).要:采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)为显色剂、

分析确定了酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DNS,,结果表明:纤维素酶的CMC酶活比滤纸酶活高,,很大影响.

关键词:纤维素酶;酶活;:92+:C

文章编号:1004-0439(2002)05-0051-03

DETERMINATIONOFFILTERPAPERENZYMEACTIVITYAND

CMCENZYMEACTIVITYOFCELLULASE

ZHANGRui-ping

(NantongInstituteofTechnology,Nantong226007,China)

Abstract:With3,5-dinitrosalicylicacid(DNS)asdeveloperandfilterpaperorCMCasthesubstrate,filterpa2

perenzymeactivity(FPA)andCMCenzymeactivity(CMCA)ofcellulaseweredetermined.Throughanalysis,wavelengthfordeterminingenzymeactivitywassetas530nm.Thereferencesolutionshouldbethereactantofinactivatedenzyme.substrateandDNS.Thedeterminationmethodsfortwokindsofsubstrateswerecompared.Theresultindi2catedthatCMCAofcellulaseishigherthanFPAandenzymeismoreactivetowatersolablesubstrate.adsorptionhasgreatinfluenceonthebondingofactivepartofcellulasewithmolecularchainofcelluloseandthecatalysis.

Keywords:cellulase;enzymeactivity;determination

近年来,酶特别是纤维素酶在纺织工业上的应用已受到纺织染整和生物工程界人士的高度关注.纤维素酶是多组分的复合物,各个组分的底物专一性不同;另外,纤维素酶作用的底物比较复杂,加上反应产物不同,致使纤维素酶活的测定方法很多,各国采用的方法亦不统一.本试验选择滤纸、CMC为底物,其原理为利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖与显色剂反应,求出还原糖的浓度,再求出酶的活力.由不同底物测得的酶活分别称作FPA(滤纸酶活)和CMCA(CMC酶活).本实验分析酶活测定的主要条件,比较两种底物酶活测定方法的结果,为生产中酶的利用提供了依据.

化学药品、材料

纤维素酶(工业品),DNS试剂为自配,冰醋酸、醋酸钠、葡萄糖均为分析纯,滤纸(定性)、羧甲基纤维素钠(试剂级).

1.11.2

FPA滤纸酶活和CMC酶活的测定

取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%CMC溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h,然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min,再加入蒸馏水,于530nm测定吸光度OD值.酶活定义:1ml酶液1min产生1mg葡萄糖为一个单位(u).1.3织物酶减量率的测定

将酶处理前后的试样在105℃烘箱中烘至恒重.

减量率=

处理前织物干质量-处理后织物干质量

处理前织物干质量

×100%

1实验方法

收稿日期:2002-03-18

作者简介:张瑞萍(1964-),女,江苏南通人,副教授,硕士,从事酶在纺织品染整加工中的应用工艺及配套助剂的研究.

2.1

结果与讨论

显色剂的选择

本试验选用3,5-二硝基水杨酸(DNS),在碱性条件下,与还原糖反应,生成有色化合物,通过分光光度计进行比色测定,确定低分子糖的量.

DNS黄色试剂在碱性条件下与还原糖共热反应

生成的棕红色氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸为比色法的测定基础物.

COOH+还原糖

NO2

COOH

,=2.0666x+0.1362,线R2,可以用于酶活.

大多数由微生物产生的纤维素酶是多组分的酶系,主要含有3种组分:(1)endo-β-1,4-葡聚糖酶;(2)exo-β-1,4-葡聚糖酶;(3)β-1,4-葡萄糖苷酶.其中,endo-酶能进攻纤维素大分子链的中间部

2.,以及DNS试剂的颜色及反应生成的棕红色氨基化合物的颜

2.2

色,选取490～580nm波长对显色液进行比色.

位,任意地切断大分子成较短的链;而exo-酶则仅能从纤维素大分子链的非还原性末端切下一个个纤维二糖;β-葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催化分解成葡萄糖.纤维素酶复合体与纤维素纤维作用的最终效果,是由各种酶综合作用所决定的.

作为底物的滤纸结构较为松散,可及区较多,非还原性末端也较多,容易同时被endo-酶和exo-酶降解,再由β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖.用比色法定量测定还原糖的生成量,可反映纤维素酶的总酶活FPA.由于exo-酶对纤维素链的专一性高,而endo-酶的专一性较低.在降解羧甲基纤维素(CMC)时,主要是反映endo-酶的活力.

本试验选择了3种酸性纤维素酶,分别以滤纸和CMC为底物,其酶活(FPA和CMCA)的测试数据结果如表1所示.

表1不同酶种的滤纸酶活(FPA)和CMC酶活(CMCA)

酶种

CMCA

FPA71.6330.9227.27

由图1可知,不同浓度葡萄糖溶液在490～500nm处有最大吸收,DNS在此波长下也有较明显的吸收.为了排除DNS的干扰,选择在波长530nm处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,但仍符合“吸收最大、干扰最小”的原则

2.3底物及酶本身的含糖量

在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS试剂中也会发色.而且,试验所用的纤维素酶是工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同.为了排除还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS等共热的反应物.2.4葡萄糖标准曲线

用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS共热反应显色后,测出其吸光度OD值,结果如图2所示.

酶活/u

杰能科

NOVOLPLUSL

528.16417.40327.83

从表1可知:CMCA和FPA两种酶活的大小顺序是:杰能科>NOVOL>PLUSL.这几种酶的endo-酶活(CMCA)较高,且比总酶活(FPA)大,几乎相差一个数量级.这说明酶对水溶性底物有较高的活力,而滤纸与酶是多相催化,酶分子也是高分子物,所以反应

的空间阻碍较大,这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响.另外,从酶整理过程中机械处理条件对织物减量率的影响(如图3所示),也说明了这一点.

的接近、附着不仅是单纯的物理结合,而且对纤维素水解反应的影响也很大.

3.1

结论

葡萄糖浓度与吸光度OD值的相关系数在0.9991以上,从而确定该标准曲线可用于酶的活力测定.

分析确定了DNS530nm,DNS等共热的反应物.3.,,以羧甲基纤维CMCA比以滤纸为底物测得

3.2

所以,,满足两个条件:,、附着于基质,,(对基质的亲和性);其次,以某种程度促进酶和基质分子的反应(对基质的活性).纤维素织物不溶于水,纤维素酶在对其攻击时会有空间障碍,而吸附于纤维素上的纤维素酶的活性又受时间的限制,在尚存活性时,如果不与基质作用,就会失活.所以,纤维素酶对基质

FPA高;这说明酶对水溶性底物有较高的活力;也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响.

参考文献:

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C.H.温著[英].罗

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GhoseT.MeasurementofCellulaseActivities[J].PureAppl.Chem,1987,58(2):257-268.

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