水桶水垢中微生物的数量统计与微生物
形态观察
作者：
班级：
摘要 在我们洗衣服的水桶中，由于我们每次并不是清洗的很干净，导致在水桶底部形成一层固体物质，俗称“水垢”。这种水垢属于碳酸盐水垢，是以钙簇的碳酸盐为主要成份的水垢，包括氢氧化钙，其中CaCO3含量大于50%。这种水垢中生活着一群“小家伙”。本次试验主要探究的是这些形体种类多样的微生物，本试验属于探究性试验，主要是通过对水桶中的水垢中微生物的取样稀释与培养再对其进行制片或革兰氏染色在显微镜下进行观察来对水桶水垢中微生物数量与形态的探究。
关键词：水垢 培养基制作 稀释分离 革兰氏染色 微生物的数量与形态
前言 通过查阅资料我们了解到水垢中的主要微生物为细菌，其中包括球菌、杆菌、螺旋菌、以及丝状菌等，因此我们采用肉膏蛋白胨培养基进行培养。为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。由于水垢中微生物浓度不能确定，通过观察并查阅资料确定其浓度与校园水池中水样微生物浓度相似，所以采用与之相同的稀释倍数。
此次实验“水桶水垢中微生物的数量统计与形态观察”是一种探究性试验，其目的为：
一、进一步巩固我们对培养基的制备，微生物的分离，显微镜的使用，革兰
氏染色原理等的理解与运用操作。
二、观察平板上的细菌菌落，确定水桶水垢中微生物的数量，观察细菌的细
胞结构。
三、通过此次试验来使我们更加了解到我们生活中看不见的看似卫生的不卫生。
1. 实验材料与设备
1.1实验材料
1.1.1菌源：用灭菌后的勺子在水桶底部轻轻刮取表层固体物质盛装与已灭
菌后的10ml 试管中并封口。
1.1.2培养基：肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、1mol/LNaOH
溶液、1mol/LHCl溶液。
1.1.3 培养皿、锥形瓶、烧杯、试管、移液管、玻璃棒、酒精灯、棉花、报
纸、量筒、药匙、称量纸、pH 试纸。
1.2 实验设备
1.2.1 高压蒸汽锅、无菌操作台、电子天平。
2.实验方法
2.1培养基的配制
称量、溶化、pH 调节、定容、加琼脂。
2.2 高压蒸汽灭菌
2.2.1玻璃器皿的洗涤
2.2.2 玻璃器皿的干燥
2.2.3 将六只试管分别加入9ml 蒸馏水
2.2.3玻璃器皿的包装
2.2.4 玻璃器皿的灭菌
2.3微生物稀释分离
在无菌操作台上，点燃酒精灯，用酒精棉由内到外擦拭操作台，取出六
只9.0ml 无菌水试管和六个培养皿，按10-2„„10-4分别顺序编号，放置
试管架上。将1ml 移液管的吸液端伸进振荡混匀的水垢悬液试管底部，用手
指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸三次，准确吸取1ml 悬液移至10-2试
管内制成10-2水垢稀释液。用另一只移液管，准确吸取1ml10-2土壤稀释
液至10-2培养皿中，用同一只移液管将1ml10-2土壤稀释液注入9.0ml 无
菌水试管内，制成10-3的土壤稀释液，将此移液管在试管内反复吹吸三次，
然后取出移液管。盖上试管帽，右手持10-3稀释液试管在左手上敲打20～
30次，混匀水样稀释液。另取移液管插入稀释液已混匀的试管内，再吹吸三
次，然后准确吸出1ml10-3稀释液至10-3培养皿中，再取1ml 置第三只支
装有9.0ml 无菌水试管中，制成10-4的土壤稀释液。（平行样同样如此操作，
为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，每一个稀释度更换一支移液管）。
2.4 加入肉膏蛋白胨培养液（温度控制在45°左右）
2.5 培养：待平板完全冷凝后，将平板倒置于37度恒温箱中培养24至48
小时。
2.6平板菌落形态及个体形态观察，并计数微生物数量，从不同平板上选择
不同类型菌落用肉眼观察，区分各种微生物的菌落形态与类别。用接种环挑取不
同菌落制片，在显微镜下进行个体形态观察并记录，取其中的菌落进行革兰氏染
色鉴定个体形体特征。
2.7革兰氏染色
2.7.1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，在载玻片中央滴一滴蒸馏水，
用接种针以无菌操作从菌种斜面取少量菌体与水滴混合，涂布成一均匀的薄层，
涂布面不宜过大。
2.7.2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上
高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而
变形。
2.7.3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精
灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及
皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
2.7.4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，
染色约1min 。
2.7.5水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的
水呈无色为止。
2.7.6 媒染：用碘液滴在涂片薄膜上，使染色盖涂片，染色约1min 。
2.7.7水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的
水呈无色为止。
2.7.8脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为
止，大约需时20-30S ，随即水洗。
2.7.9 复染：在涂片薄膜上滴加蕃红染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染
色约1min 。
2.7.10水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下
的水呈无色为止。
2.7.11干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用
低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，
紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌
5. 实验结果
上图分别为稀释度为10-2、10-3、10-4菌悬液的培养皿，随着稀释度递减菌落
数明显减少，10-2、10-3稀释度培养皿菌落较多不易观察，稀释度为10-4的培
养皿能较好的观察菌落形态。
表一：微生物数量统计
可以得出水垢菌落的个数为两个10-4稀释度的平均值： 459250个/mL
表二：细菌菌落、个体形态观察
6. 实验总结与心得
实验的第一部分统计微生物的数量，由于稀释度为10-2菌悬液培养皿中菌
落个数太多，至少在400以上，这说明10-2的稀释度对于取样的水垢悬液来说
稀释度不够，导致菌落无法清晰呈现在培养皿内，稀释度为10-3菌悬液培养皿
中菌落数减少，但任然密度较大，有一只仍超过300，菌落形态不易观察。稀释
度为10-4培养皿内菌落数大大减少，菌落形态清晰可见。造成这种现象的原因
可能是其一：我们在用移液管移取水垢悬液的时候未将试管摇匀，吸取的是底部
浓度较高的菌悬液，而或是在吸取10-2稀释度试管中的悬液时未将试管摇匀取
到底部的悬液，因此造成10-3稀释度试管中水垢浓度也较高。第二个原因是稀
释倍数可能设置过高，而水垢悬液浓度较大，不能将微生物较好的稀释放大。但
这也说明我们此次试验培养基的制作是较成功的，PH 调节适宜，没有出现培养皿不生长微生物的情况。
实验的第二部分观察菌落形态，我们观察到的菌落形态有三种以上，分别有小圆点状，边缘不规则状，以及边缘规则的大圆状，具体描述上面以总结，刚开始我们没有进行革兰氏染色直接观察菌体发现了两类微生物，由于辨识度不高，我们将其进行革兰氏染色，这时候我们犯了一个较大的错误，就是没有挑取单一菌落进行革兰氏染色，而是在不同菌落上挑取一点点然后溶解制片，最后观察到的图像可想而知，多种微生物混合在一起导致较小的微生物观察不清。然后我们又重新挑取单一的菌落进行革兰氏染色制片，于是就观察到了球菌和两种杆菌，还有一种类似于螺旋菌的菌体由于数量较少而且观察不清所以不能肯定。我们观察到的细菌肯定不是所有培养皿上的细菌，还有一些没有被观察到的细菌是由于我们的操作失误，比如在挑取菌落制片时我们组员可能选择到同一种菌落，在那之前没有进行比对，所以我们观察到的菌体有重复的现象。有点形态不同的菌落由于体积较小不易观察到而被我们忽略，还有的菌落不易挑起或者没有溶解开导致我们在制片的时候可能将其冲掉或者在观察时由于太密集而无法辨识个体形态。
通过这次设计性试验我们巩固加深了之前的实验操作，已经能熟练准确的配置肉膏蛋白胨培养基，掌握了玻璃器皿的洗涤以及灭菌的要点及注意事项，在稀释分离的过程中没有像上一次实验一样出现移液管不够的现象，能够熟练的操作显微镜，通过观察以及查阅资料重新回顾了各种细菌的菌落形态，明确了菌群数量统计的过程，掌握了革兰氏染色的方法，学会辨别各种形态的微生物，实验中出现的两个较不完美的地方分别是，其一，稀释度10-2明显过高，10-3可能是操作原因导致菌落较多，所以三个稀释度形成的梯度并不均匀。错误的出现是因为我们没有正确估计水垢悬液的浓度，以及这方面资料的欠缺所致。其二，我们在观察微生物个体形态的时候由于欠缺这方面的实验及知识，不能较好的辨别微生物和非微生物，常有把非微生物如培养基的晶体，铁丝或者染料当成微生物的情况出现，然后在老师的帮助下我们了解到大多数微生物形态在显微镜下都是数量较多，有明显微生物特征如细胞核等。总得来说，通过这次试验我们对微生物又有了全新的认识。
参考文献：
刘亚洁、李文娟 《环境微生物学实验教程》 中国原子能出版社 2013年5月 王国惠《环境工程微生物学——原理与应用》化学工业出版社
水桶水垢中微生物的数量统计与微生物
形态观察
作者：
班级：
摘要 在我们洗衣服的水桶中，由于我们每次并不是清洗的很干净，导致在水桶底部形成一层固体物质，俗称“水垢”。这种水垢属于碳酸盐水垢，是以钙簇的碳酸盐为主要成份的水垢，包括氢氧化钙，其中CaCO3含量大于50%。这种水垢中生活着一群“小家伙”。本次试验主要探究的是这些形体种类多样的微生物，本试验属于探究性试验，主要是通过对水桶中的水垢中微生物的取样稀释与培养再对其进行制片或革兰氏染色在显微镜下进行观察来对水桶水垢中微生物数量与形态的探究。
关键词：水垢 培养基制作 稀释分离 革兰氏染色 微生物的数量与形态
前言 通过查阅资料我们了解到水垢中的主要微生物为细菌，其中包括球菌、杆菌、螺旋菌、以及丝状菌等，因此我们采用肉膏蛋白胨培养基进行培养。为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。由于水垢中微生物浓度不能确定，通过观察并查阅资料确定其浓度与校园水池中水样微生物浓度相似，所以采用与之相同的稀释倍数。
此次实验“水桶水垢中微生物的数量统计与形态观察”是一种探究性试验，其目的为：
一、进一步巩固我们对培养基的制备，微生物的分离，显微镜的使用，革兰
氏染色原理等的理解与运用操作。
二、观察平板上的细菌菌落，确定水桶水垢中微生物的数量，观察细菌的细
胞结构。
三、通过此次试验来使我们更加了解到我们生活中看不见的看似卫生的不卫生。
1. 实验材料与设备
1.1实验材料
1.1.1菌源：用灭菌后的勺子在水桶底部轻轻刮取表层固体物质盛装与已灭
菌后的10ml 试管中并封口。
1.1.2培养基：肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、1mol/LNaOH
溶液、1mol/LHCl溶液。
1.1.3 培养皿、锥形瓶、烧杯、试管、移液管、玻璃棒、酒精灯、棉花、报
纸、量筒、药匙、称量纸、pH 试纸。
1.2 实验设备
1.2.1 高压蒸汽锅、无菌操作台、电子天平。
2.实验方法
2.1培养基的配制
称量、溶化、pH 调节、定容、加琼脂。
2.2 高压蒸汽灭菌
2.2.1玻璃器皿的洗涤
2.2.2 玻璃器皿的干燥
2.2.3 将六只试管分别加入9ml 蒸馏水
2.2.3玻璃器皿的包装
2.2.4 玻璃器皿的灭菌
2.3微生物稀释分离
在无菌操作台上，点燃酒精灯，用酒精棉由内到外擦拭操作台，取出六
只9.0ml 无菌水试管和六个培养皿，按10-2„„10-4分别顺序编号，放置
试管架上。将1ml 移液管的吸液端伸进振荡混匀的水垢悬液试管底部，用手
指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸三次，准确吸取1ml 悬液移至10-2试
管内制成10-2水垢稀释液。用另一只移液管，准确吸取1ml10-2土壤稀释
液至10-2培养皿中，用同一只移液管将1ml10-2土壤稀释液注入9.0ml 无
菌水试管内，制成10-3的土壤稀释液，将此移液管在试管内反复吹吸三次，
然后取出移液管。盖上试管帽，右手持10-3稀释液试管在左手上敲打20～
30次，混匀水样稀释液。另取移液管插入稀释液已混匀的试管内，再吹吸三
次，然后准确吸出1ml10-3稀释液至10-3培养皿中，再取1ml 置第三只支
装有9.0ml 无菌水试管中，制成10-4的土壤稀释液。（平行样同样如此操作，
为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，每一个稀释度更换一支移液管）。
2.4 加入肉膏蛋白胨培养液（温度控制在45°左右）
2.5 培养：待平板完全冷凝后，将平板倒置于37度恒温箱中培养24至48
小时。
2.6平板菌落形态及个体形态观察，并计数微生物数量，从不同平板上选择
不同类型菌落用肉眼观察，区分各种微生物的菌落形态与类别。用接种环挑取不
同菌落制片，在显微镜下进行个体形态观察并记录，取其中的菌落进行革兰氏染
色鉴定个体形体特征。
2.7革兰氏染色
2.7.1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，在载玻片中央滴一滴蒸馏水，
用接种针以无菌操作从菌种斜面取少量菌体与水滴混合，涂布成一均匀的薄层，
涂布面不宜过大。
2.7.2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上
高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而
变形。
2.7.3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精
灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及
皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
2.7.4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，
染色约1min 。
2.7.5水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的
水呈无色为止。
2.7.6 媒染：用碘液滴在涂片薄膜上，使染色盖涂片，染色约1min 。
2.7.7水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的
水呈无色为止。
2.7.8脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为
止，大约需时20-30S ，随即水洗。
2.7.9 复染：在涂片薄膜上滴加蕃红染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染
色约1min 。
2.7.10水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下
的水呈无色为止。
2.7.11干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用
低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，
紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌
5. 实验结果
上图分别为稀释度为10-2、10-3、10-4菌悬液的培养皿，随着稀释度递减菌落
数明显减少，10-2、10-3稀释度培养皿菌落较多不易观察，稀释度为10-4的培
养皿能较好的观察菌落形态。
表一：微生物数量统计
可以得出水垢菌落的个数为两个10-4稀释度的平均值： 459250个/mL
表二：细菌菌落、个体形态观察
6. 实验总结与心得
实验的第一部分统计微生物的数量，由于稀释度为10-2菌悬液培养皿中菌
落个数太多，至少在400以上，这说明10-2的稀释度对于取样的水垢悬液来说
稀释度不够，导致菌落无法清晰呈现在培养皿内，稀释度为10-3菌悬液培养皿
中菌落数减少，但任然密度较大，有一只仍超过300，菌落形态不易观察。稀释
度为10-4培养皿内菌落数大大减少，菌落形态清晰可见。造成这种现象的原因
可能是其一：我们在用移液管移取水垢悬液的时候未将试管摇匀，吸取的是底部
浓度较高的菌悬液，而或是在吸取10-2稀释度试管中的悬液时未将试管摇匀取
到底部的悬液，因此造成10-3稀释度试管中水垢浓度也较高。第二个原因是稀
释倍数可能设置过高，而水垢悬液浓度较大，不能将微生物较好的稀释放大。但
这也说明我们此次试验培养基的制作是较成功的，PH 调节适宜，没有出现培养皿不生长微生物的情况。
实验的第二部分观察菌落形态，我们观察到的菌落形态有三种以上，分别有小圆点状，边缘不规则状，以及边缘规则的大圆状，具体描述上面以总结，刚开始我们没有进行革兰氏染色直接观察菌体发现了两类微生物，由于辨识度不高，我们将其进行革兰氏染色，这时候我们犯了一个较大的错误，就是没有挑取单一菌落进行革兰氏染色，而是在不同菌落上挑取一点点然后溶解制片，最后观察到的图像可想而知，多种微生物混合在一起导致较小的微生物观察不清。然后我们又重新挑取单一的菌落进行革兰氏染色制片，于是就观察到了球菌和两种杆菌，还有一种类似于螺旋菌的菌体由于数量较少而且观察不清所以不能肯定。我们观察到的细菌肯定不是所有培养皿上的细菌，还有一些没有被观察到的细菌是由于我们的操作失误，比如在挑取菌落制片时我们组员可能选择到同一种菌落，在那之前没有进行比对，所以我们观察到的菌体有重复的现象。有点形态不同的菌落由于体积较小不易观察到而被我们忽略，还有的菌落不易挑起或者没有溶解开导致我们在制片的时候可能将其冲掉或者在观察时由于太密集而无法辨识个体形态。
通过这次设计性试验我们巩固加深了之前的实验操作，已经能熟练准确的配置肉膏蛋白胨培养基，掌握了玻璃器皿的洗涤以及灭菌的要点及注意事项，在稀释分离的过程中没有像上一次实验一样出现移液管不够的现象，能够熟练的操作显微镜，通过观察以及查阅资料重新回顾了各种细菌的菌落形态，明确了菌群数量统计的过程，掌握了革兰氏染色的方法，学会辨别各种形态的微生物，实验中出现的两个较不完美的地方分别是，其一，稀释度10-2明显过高，10-3可能是操作原因导致菌落较多，所以三个稀释度形成的梯度并不均匀。错误的出现是因为我们没有正确估计水垢悬液的浓度，以及这方面资料的欠缺所致。其二，我们在观察微生物个体形态的时候由于欠缺这方面的实验及知识，不能较好的辨别微生物和非微生物，常有把非微生物如培养基的晶体，铁丝或者染料当成微生物的情况出现，然后在老师的帮助下我们了解到大多数微生物形态在显微镜下都是数量较多，有明显微生物特征如细胞核等。总得来说，通过这次试验我们对微生物又有了全新的认识。
参考文献：
刘亚洁、李文娟 《环境微生物学实验教程》 中国原子能出版社 2013年5月 王国惠《环境工程微生物学——原理与应用》化学工业出版社