《食品生物化学》课程
实验指导书
食品工程系
二○○四年十二月
目录
目录 . ......................................................................................................................... 1
实验一 水分活度的测定 .......................................................................................... 2
实验二 淀粉的显色和水解 . ...................................................................................... 4
实验三 总糖和还原糖的测定——斐林氏法 .............................................................. 7
实验四 油脂酸价的测定 ........................................................................................ 11
实验五 氨基酸的纸上层析 . .................................................................................... 12
实验六 牛奶中酪蛋白等电点测定 .......................................................................... 14
实验七 蛋白质的颜色反应 . .................................................................................... 16
实验八 酶的性质实验 . ........................................................................................... 18
实验九 酶的激活剂和抑制剂 ................................................................................. 21
实验十 枯草杆菌蛋白酶活力测定 .......................................................................... 23
实验十一 原子吸收法测定矿泉水中镁的含量........................................................... 26
2\11\12\16\18\
实验一 水分活度的测定
一、实验目的和要求
1．进一步了解水分活度的概念及测定原理。
2．学习测定水分活度的基本方法。
二、实验原理
水分活度反应了食品中水的存在状态，可以作为衡量微生物对食品水分可利用性的指标。控制水分活度对食品的保藏具有重要意义。无论干燥或新鲜食品中的水分，都会随环境条件的变动而变化。如果环境空气干燥湿度低，食品中的水分向空气蒸发，食品重量减轻。反之食品吸水重量增加。但不管是蒸发还是吸收水分，最终是食品与环境平衡为止。根据这一原理，食物在康威氏微量扩散皿的密封和恒温条件下，分别向A W 较高或较低的标准饱和溶液中扩散，当达到平衡后，依据样品在高A W 标准饱和溶液中重量的增加和在低A W 标准饱和溶液中重量的减少，则可计算出样品的A W 值。
三、试剂和器材
1．康威尔微量扩散皿
2．方格座标纸。
3．分析天平。
4．样品（面粉约3g ）。
5．标准饱和溶液：NaCl 及K 2CO 3•2H2O 的标准饱和溶液各式各10mL 。
四、操作步骤
1．康威氏微量扩散皿二个，分别盛氯化钠、碳酸钾饱和溶液5mL, 并在扩散皿磨口处涂一层凡士林。
2．将两个直径25mm 的玻璃皿准确称重，然后分别精确称取约1g 同一面粉于皿内（尽量做到每皿样品重量接近）。并迅速放入上述康威氏扩散皿内室中，马上加盖密封。
3．在25℃温度下放置2±0.5h ，然后依次取出玻皿准确称重。并计算每克被测样品的增减重量。
4．以饱和溶液的A W 值为横座标，样品重量增减数为纵座标，在方格座标纸上作图，将各点连接成直线，直线与横轴之交点则为该样品的A W 值。
5．讨论：
（1）康威尔皿密封一定要严。
（2）用本法测A W 值花时间较长（2个h 以上），取样和称重一定要准确。
（3）在测样品的A W 值前，应先估计一下样品的A W ，然后选择高于和低于样品A W 值的饱和溶液各两种，也可只取高于和低于样品A W 值的饱和溶液各一种。
（4）对鱼、肉等含油脂较多的食品及其它油炸食品水分活度的测定宜改用它法。
附：25℃时部分饱和溶液的水分活度值
五、思考题
1．什么叫水分活度？本实验为什么能测出样品的水分活度？
2．本实验是在25℃左右温度下测定A W 值，做此实验时，环境温度高于或低于此温度时，饱和溶液的水分活度值是否仍然为表中一样，为什么？
实验二 淀粉的显色和水解
一、实验目的和要求
1、进一步了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。
2、如何验证淀粉是否水解及其水解的条件和产物。
二、实验原理
1、淀粉与碘的反应 直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。
近年来用先进的分析技术（如X 射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。
在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。
淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。
表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色
淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。
2、淀粉的水解 淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒
会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C 6H 12O 5）m→(C6H 10O 5)n→C12H 22O 11→C6H 12O 6
淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖
葡萄糖是淀粉最重要的下游产品之一，工业生产中常常使用玉米淀粉水解来加工结晶葡萄糖。
三、试剂和器材
1、器材：试管夹、量筒、烧杯各一只、白瓷板一块、试管一支、水浴锅。
2、试剂：淀粉及0.1％溶液 、10％NaOH 溶液、20％H 2SO 4溶液、10％Na 2SO 4溶液、稀碘液、乙醇、2%CuSO4溶液。
四、操作步骤
1、淀粉与碘的反应
①取少量淀粉于白瓷板空内，加碘液两滴，观察颜色。
②取试管一支，加入0.1％的淀粉6ml ，碘两滴，摇匀，观察颜色变化。另取试管两支，将此淀粉均分为三等份并编号做如下实验：
1号管在酒精灯上加热，观察颜色变化。然后冷却，又观察颜色变化。
2号管加入10％NaOH 溶液几滴，观察颜色变化
3号管加入乙醇几滴，观察颜色变化。
记载上述实验过程和结果，并解释现象。
2、淀粉水解实验设计
设计实验方案，试验淀粉能不能水解，水解的条件和产物是什么？怎样判断淀粉是否水解了？
(1) 在试管1中加入0.5g 淀粉和4ml 水，在试管2中加入0.5g 淀粉和4ml 20%的硫酸溶液。分别加热试管3~4min。
(2) 把试管2中的一部分溶液倒入试管3中，留作下一步实验用。
(3) 向试管1和试管2中加入几滴碘溶液，观察现象。发现试管1的溶液呈蓝色（淀粉遇碘变成蓝色），试管2无明显现象。不同现象的原因是：淀粉在酸性条件并加热的条件下发生了水解反应。
(4) 向试管3中滴入10%的碱液，中和溶液中的硫酸，把溶液调呈弱碱性，使溶液的PH 值约为9~10。
(5) 另取一只试管4加入3ml 氢氧化钠溶液，并向其中滴入4滴2%的硫酸铜溶液，立即有蓝色的氢氧红铜沉淀生成。再取试管3中的水解液1ml 滴入，振荡混合均匀后，用酒精灯加热煮沸，溶液颜色常有蓝色——黄色——绿色（黄蓝两色混合）——红色等一系列变化。最终有红色沉淀生成。原因是氢氧化铜被还原生成红色难溶于水的氧化亚铜。
实验结论：
淀粉在酸的催化作用下，能发生水解；淀粉的水解过程：先生成分子量较小的糊精（淀粉不完全水解的产物），糊精继续水解生成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖。 注意事项：
淀粉水解的中间产物糊精（有分子量较大的红糊精和分子量较小的白糊精），对碘反应的颜色变化是：紫色—棕色—黄色，若淀粉水解不彻底，也会有不同的颜色出现。 问题思考：
1、试管1为什么变成了蓝色？试管2为什么无明显现象？为什么？（试管1中的淀粉未水解，淀粉遇碘变成蓝色；试管2中淀粉在酸的催化作用下水解了，所以无明显现象；不同现象的原因是：淀粉在酸性条件并加热的条件下发生了水解反应。）
2、如何验证淀粉没有还原性？（提示：不能发生银镜反应或者不能还原氢氧化铜）
3、实验延伸设计：如何验证唾液酶对淀粉水解的催化作用？（注意事项：用唾液作催化剂水解淀粉时，温度不得超过45摄氏度，因为温度过高，唾液酶易失去活性，最适宜的温度是37—40摄氏度。）
实验三 总糖和还原糖的测定——斐林氏法
一、实验目的和要求
掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。
二、实验原理
还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu 、Hg 、Fe 、Ag 等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。
本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH + CuSO 4 = Cu(OH)2+ Na2SO 4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜：
2+2+3++
在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，其反应如下：
反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。
Cu 2O + K4Fe(CN)6 + 3 H2K 2Cu 2Fe(CN)6 + 2 KOH + 2 H2O
亚铁氰化钾 亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐
滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二
价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。
三、试剂和器材
1、试剂
费林试剂：
甲液：称取15g 硫酸铜（CuSO 4·5H 2O ）及0.05g 亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000mL 。
乙液：称取50g 酒石酸钾钠及75g NaOH ，溶于蒸馏水中，再加入4g 亚铁氰化钾［K 4Fe （CN ）6］，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000mL ，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。
0.1％葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g 经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000mL 容量瓶中，加入5mL 浓HCl （防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000mL 。
6mol/L HCl：取250mL 浓HCl （35%～38%）用蒸馏水稀释到500mL 。
碘－碘化钾溶液：称取5g 碘，10g 碘化钾溶于100mL 蒸馏水中。
6mol/L NaOH：称取120gNaOH 溶于500mL 蒸馏水中。
0.1%酚酞指示剂。
2、材料
藕粉，淀粉。
3、器材
试管3.0×20cm （×1）；移液管5mL （×2）；烧杯100mL(×1);
250mL 锥形瓶; 调温电炉; 滴定管25mL(×1) 。
三、操作方法
1、样品中还原糖的提取
准确称取1~2g藕粉，放在100mL 烧杯中，先以少量
蒸馏水调成糊状，然后加入约40mL 蒸馏水，混匀，于50℃
恒温水浴中保温20min ，不时搅拌，使还原糖浸出混。过
滤，将滤液全部收集在50mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容
至刻度，即为还原糖提取液。
2、样品中总糖的水解及提取
准确称取1~2g淀粉，放在大试管中，加入6mol/L HCl
10mL ，蒸馏水15mL ，在沸水浴中加热0.5h ，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入
1
滴酚酞指示剂，以6mol/L NaOH 溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100mL ，过滤取滤液10mL 于100mL 容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。
3、空白滴定
准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL ，置于250mL 锥形瓶中，加蒸馏水10mL 。从滴定管滴加约9mL 葡萄糖标准溶液，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s ，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值，按下式计算：
式中：F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL ）相当于葡萄糖的量，mg ；
C──葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；
V──标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL 。
4、样品糖的定量测定
按图1-1装置热滴定仪器。
(1) 样品溶液预测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL ，置于250mL 锥形瓶中，加蒸馏水10mL ，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s ，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。
(2) 样品溶液测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL ，置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL ，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1mL 的样品溶液，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s ，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。
四、结果处理
式中：m──样品重量，g ；
F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL ）相当于葡萄糖的量，mg ；
V──标定时平均消耗还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL ；
V 1──还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL ；
1000──mg换算成g 的系数。
注意事项
（1）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。
（2）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。
（3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。 五、思考题
1．在费林试剂热滴定法中为什么用亚甲基蓝作为滴定终点的指示剂？
2．用费林试剂热滴定法测定还原糖，为什么整个滴定过程必须使溶液处于沸腾状态？
3．在费林试剂热滴定法中样品溶液预测定有何作用？
实验四 油脂酸价的测定
一、实验目的和要求
1．初步掌握测定油脂酸价的原理与方法。 2．了解测定油脂酸价的意义。 二、实验原理
油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有剌激性气味，使油脂产生酸败。酸败的程度是以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价（或酸值）来表示。同一种油脂若酸价高，则说明油脂水解产生的游离脂肪酸就多。
酸价是指中和1g 脂肪中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也越差。 三、试剂和器材
1．锥形瓶（250mL ）。 2．量筒（50mL ）。 3．碱式滴定管（250mL ）。 4．花生油或菜油
5．1：1乙醇——乙醚混合液 6．0.1mol/L氢氧化钾标准溶液 7． 酚酞-乙醇溶液 四、操作步骤
1．准确称取1~3g菜油于250 mL锥形瓶中。
2．在瓶内加入乙醇—乙醚混合液50 mL，充分振动，使油样完全溶解成透明溶液。 待油样完全溶解后，加入1%酚酞指示剂1~2滴，立即用0.1mol/L氢氧化钾标准溶液滴定至溶液呈微红色（放置30S 内不褪色）为终点，并记录用去的氢氧化钾的体积，并按下式计算酸价。
消耗氢氧化钾毫升数×氢氧化钾标准溶液浓度×氢氧化钾分子量
酸价== ————————————————————————
油脂样品的克数 五、思考题
1．测定油脂酸价时，装油的锥形瓶和油样中均不得混有无机酸，这是为什么？ 2．为什么酸价的高低可作为衡量油脂好坏的一个重要指标？
实验五 氨基酸的纸上层析
一、实验目的和要求
1、了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。
2、学习纸层析的操作技术，分析未知样品的氨基酸成分。 二、实验原理
纸层析法属于分配层析法的一种，是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维上分布大量的亲水性羟基，因此能吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品在滤纸上(此点称为原点) ，用有机溶剂进行展层时，样品中的各种溶质即在两相溶剂中不断进行分配。由于各种溶质在两相溶剂中的分配系数不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，于是从点样的一端向另一端展开时，样品中不同溶质被分离开来，形成距原点距离不等的层析点。样品被分离后在纸层析图谱上的位置，是用比移值R f 来表示的
R f
原点到层析斑点的中心原点到溶剂前沿的距离
距离
在一定条件下(如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变) ，某物质的R f 值是一个常数，借此可作定性分析依据。本实验只利用纸层析分离氨基酸。 三、试剂和器材
(1) 层析缸(可用标本缸代替) 。 (2) 层析滤纸(新华一号滤纸) 。
(3) 喷雾器、电吹风、三角板、铅笔、毛细管(可用微量注射器代替) 。
(4) 氨基酸标准溶液：1%的甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、缬氨酸、脯氨酸。 (5) 混合氨基酸溶液：将1%的甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、缬氨酸、脯氨酸也按1%浓度制成混合溶液。
(6) 展层剂：正丁醇：80%甲酸：水＝15：3：2 (体积分数)
(7) 色剂：0.1%茚三酮－丙酮溶液 (取0.1g 茚三酮溶于100mL 无水丙酮，贮于棕色瓶中待用。) 四、操作步骤
(1) 取滤纸二张 (12cm×12cm) ，按图要求画好平行线和样点并在样点上标号。 (2) 点样 用毛细管依次点上氨基酸标准样液和混合液于样点并记录各样点所点的氨基酸。点样时一定要注意：第一，样点直径控制在3mm 以内；第二，每样点需重复点3次，但每次需经干燥后方可再点，为了快速干燥，可用电吹风在较低档温度下风干。点好样的滤纸卷成筒状，用透明胶纸黏接，要注意在卷纸筒时，两纸不能搭接。
(3) 展层 在层析缸内放好展层剂，(展层剂液面高度约1cm) ，将一张点好样的滤纸小心地移入层析缸，点样端浸入展层剂甲中，要特别注意不要使样点浸入展层剂。盖好层析缸。当看到展层剂到达画定的溶剂前沿线时，取出滤纸，用较低档温度电吹风吹干。
(4) 显色 将上述滤纸经吹干后用喷雾器把茚三酮溶液均匀地喷在纸上(不要喷的太多) ，取下纸，放入65℃烘箱中显色数分钟，或用电吹风热风吹干显色亦可。 五、计算
计算各氨基酸的R f 。
实验六 牛奶中酪蛋白等电点测定
一、实验目的和要求
1、初步学会测定蛋白质等电点的基本方法。 2、了解蛋白质的两性解离性质。 二、实验原理
蛋白质分子中有一定数量的自由氨基和自由羧基存在(以及一些其他酸性和碱性基团) ，是两性电解质。作为带电颗粒它可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH 影响。当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子(zwitterion,净电荷为O) ，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点(isoelectric point,简写pI) 。
处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶液的pH 大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。不同蛋白质，等电点不同。在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。因此，可以借助在不同pH 溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。通过本实验可以测定酪蛋白的等电点，为提取酪蛋白打下基础。 三、试剂和器材
(1) 试管及试管架。 (2) 吸管与滴管。
(3) 100mL容量瓶和25mL 锥形瓶。 (4) 水浴锅和温度计。 (5) 1.00mol/L醋酸。 (6) 0.1mol/L醋酸。 (7) 1mol/L醋酸。 (8) 蒸馏水。 (9) 牛奶 四、操作步骤
1、取五支同种规格的试管，编号，按表4－1顺序精确加入各种试剂，然后逐一振荡试管，并使试管混合均匀。
表4－1 蛋白质的等电点测定表
2、将上述试管静置于试管架上约15分钟后，仔细观察，比较各管的浑浊度，将观察的结果记载于表内，并指出酪蛋白的等电点。
注：①本实验各种试剂的浓度及用量均要求很准确。 ②浑浊度可用－、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示。 五、思考题：
什么叫等电点？在等电点时，蛋白质为什么容易被沉淀析出？
实验七 蛋白质的颜色反应
一、实验目的和要求
1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理
1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。
2、茚三酮反应
蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。
该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 三、试剂和器材
1、试剂
①鸡蛋清②尿素③10％NaOH 溶液④1％硫酸铜溶液⑤0.1％茚三酮-乙醇溶液
2、仪器 试管及试管夹、酒精灯 四、操作步骤
1、双缩脲反应
①取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH 溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。
②另取1支试管，加入稀释过的蛋清溶液2滴，再加入5滴10％NaOH
溶液摇匀，
然后再加入1滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。
注意事项：加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。
2、茚三酮反应
①取1支试管，加入稀释的蛋清溶液4滴，0.1％茚三酮-乙醇溶液2滴，混匀后在小火上加热煮沸1～2min ，放置冷却，观察颜色变化。
②另取2支试管，用0.5％的酪蛋白和0.5％的甘氨酸溶液代表蛋白溶液，进行茚三酮反应，观察颜色变化。
五、思考题
通过实验谈一谈你对蛋白质的颜色反应有何认识。
实验八 酶的性质实验
一、实验目的和要求
1．加深对酶的性质的认识
2．学会观察酶的专一性以及温度、酸度（PH ）等因素对酶活性的重要影响。 二、实验原理
酶具有高度的专一性。淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。可用班氏（Benedict ）试剂检查糖的还原性。
酶的活性受温度的影响，在最适温度下，酶的催化反应速度最高，大多数动物酶的最适温度在37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。偏离此最适环境时，酶的活性减弱。
酶的活力受环境pH 的影响极为显著。不同酶的最适pH 值不同。本实验观察pH 对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH 为6.8。 三、试剂和器材：
1．试剂
（1）2%蔗糖溶液（至少要分析纯）。
（2）溶于0.3%氯化钠的1%淀粉溶液（需新鲜配制）。 （3）稀释200倍数的新鲜唾液。
（4）蔗糖酶溶液：将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2-3次（离心法），然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100g 置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨，提取约1小时，再加蒸馏水，使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。
（5）班氏（Benedict ）试剂：无水硫酸铜1.74g 溶于100ml 热水中，冷却后稀释至150ml ，取柠檬酸钠173g ，无水碳酸钠100g 和600ml 水共热，溶解后冷却并加水至850ml 。再将冷却的150ml 硫酸铜溶液注入。本试剂可长久保存。 （6）0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液（需新鲜配制）
（7）碘化钾-碘溶液：将碘化钾20g 及碘10g 溶于100ml 水中。使用前稀释10倍。 （8）新配制的溶于0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液 （9）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 （10）0.1mol/L柠檬酸溶液
（11）pH 试纸：pH=5、pH=5.8、pH=6.8、 pH=8
2．器材
恒温水浴、试管及试管架、锥形瓶、吸管、滴管、白瓷板等 四、操作步骤：
1．酶的专一性
（1）淀粉酶的专一性按下表操作：
管号 1%淀粉溶液(滴)
1
2 - 4 - - 1
3 4 - 1 - -
4 - 4 1 - -
5 4 - - 1 -
6 - 4 - 1 -
4
2%蔗糖溶液（滴） -
- 稀释唾液(ml)
-
煮沸过的稀释唾液
1
(ml) 蒸馏水(ml)
37℃恒温水浴15分钟
现象
（2）蔗糖酶的专一性按下表操作：
管号 1%淀粉溶液(滴) 2%蔗糖溶液（滴） 蔗糖酶溶液(ml) 煮沸过的蔗糖酶溶液(ml)
蒸馏水(ml) Benedict 试剂(ml)
现象
2．温度对酶活力的影响
淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈色。在不同的温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由其遇碘呈现的颜色来判断。
取3支试管，编号后按下表加入试剂：
1 4 - - - 1
2 - 4 - - 1
3 4 - 1 - -
4 - 4 1 - -
5 4 - - 1 -
6 - 4 - 1 -
沸水浴2～3分钟
37℃恒温水浴5分钟
1
1
1
1
1
1
沸水浴2～3分钟
管号 淀粉溶液(ml) 稀释唾液(ml)
煮沸过的稀释唾液(ml)
1 1.5 1 -
2 1.5 1 -
3 1.5 - 1
摇匀后，将1号、3号两试管放入37℃水浴中，2号试管放入冰水中。10分钟后取出，（将2号管内液体分为两半），用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10分钟后，再用碘液试验，判断结果。
3．pH 对酶活力的影响
取4个标有号码的50ml 锥形瓶。用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0-8.0的四种缓冲液。
锥形瓶 0.2mol/L磷酸氢二钠0.1mol/L柠檬酸号 1 2 3 4
（ml ） 5.15 6.05 7.72 9.72
（ml ）
4.85 3.95 2.28 0.28
5.0 5.8 6.8 8.0 pH
从4个锥形瓶中各取缓冲液3ml ，分别注入4支编好号的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2ml 和稀释200倍的唾液2ml 。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管内容物混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。
在第4管中加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第4管取出1滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为桔黄色时，向所有试管依次添加1-2滴碘化钾-碘溶液。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔，从第一管起，亦均为1分钟。观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH 对唾液淀粉酶活性的影响。 五、思考题
1．试解释酶为什么具有很高的催化效率？
2．什么是酶的专一性？试从你所做实验及其结果解释酶具有这种性质。
实验九 酶的激活剂和抑制剂
一、实验目的和要求
1、了解酶促反应的激活与抑制。
2、学习检定激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理。 二、实验原理
酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂，有些物质会使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性。而且常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。
本实验主要观察抑制剂和激活剂对唾液淀粉酶的活性影响。其中氯化钠可以作为唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜为其抑制剂。值得注意的是，氯化钠达到1/3饱和度时就会抑制唾液淀粉酶的活性。 三、试剂和器材
1、试剂 ①稀释100倍数的新鲜唾液②新配置的1％淀粉溶液③碘化钾-碘溶液④1％氯化钠溶液⑤0.5％硫酸铜溶液⑥pH 试纸：pH5、pH5.8、pH6.8、pH8.0。
2、器材 试管及试管夹、恒温水浴锅、移液管（10mL 、5mL 各1支） 四、操作步骤
取3支标有号码的试管，向第1支试管中加入1％氯化钠溶液1mL ，向第2支试管中加入0.5％硫酸铜溶液1mL ，向第3支试管中加入蒸馏水1mL 作为对照。再向每支试管各加入1％淀粉溶液3mL 和稀释的唾液1mL 。摇匀各管内容物，一齐放入37℃恒温水浴中保温，10-15min 后取出。冷却后，各滴入2-3滴碘化钠-碘溶液，混匀，观察比较3支试管颜色的深浅。
注意事项：保温时间因唾液淀粉酶活力而异。如果激活剂或抑制剂的作用不明显，可以适当延长反应时间或降低唾液稀释倍数。 五、思考题：
1、酶作为生物催化剂具有哪些特性？
2、激活剂可以分为哪几类？本实验中的氯化钠属于其中那一类？
实验十 枯草杆菌蛋白酶活力测定
一、实验目的和要求
1． 学习测定蛋白酶活力的基本原理。
2． 握用分光光度法测定蛋白酶活力的原理与技术。 二、实验原理
磷钨酸与磷钼酸的混合物，即福林—酚试剂，它在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色的物质（钼蓝和钨蓝的混合物）。酪蛋白经蛋白酶作用后产生的酪氨酸带有酚基，可与酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用分光光度法测定，从而可确定酶活力的大小。 三、试剂和器材
1．试剂
（1）酚试剂：于2000ml 磨口回流装置内加入钨酸钠（Na 2WO 4•2H2O ）100g ，钼酸钠（Na 2MoO 4•2H2O ）25g ，水700ml ，85%磷酸50ml ，浓盐酸100ml 。微火回流10小时后加入硫酸锂150g ，蒸馏水50ml 和数滴溴摇匀。煮沸约15分钟，以驱逐残溴，溶液呈黄色。冷却后定容到1000ml ，过滤，置于棕色瓶中保存。使用前1份福林试剂与2份水混合，摇匀。
（2）0.55mol/L碳酸钠溶液 （3）10%三氯乙酸溶液
（4）0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白2.5g, 用0.5 mol /L的氢氧化钠溶液4ml 润湿，加0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液少许，在水浴中加溶解。冷却后，用上述缓冲液定容至500ml ，此试剂临用时配制。
（5）0.02mol/L pH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO 4•12H2O)71.64g, 用水定容至1000ml 为A 液。称取磷酸二氢钠(NaH2PO 4•2H2O)31.21g ，用水定容至1000ml 为B 液。取A 液840ml ，B 液160ml ，混合后即成0.2mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，临用时稀释10倍。
（6）100μg/ml酪氨酸溶液：准确称取干的酪氨酸100mg, 当0.2 mol /L盐酸溶液溶解，定容至100ml ，临用时用水稀释10倍，再分别配制成几种10~60μg/ml浓度的酪氨酸溶液。
（7）酶液：称取1g 枯草杆菌蛋白酶的酶粉，用少量0.02mol/L pH7.5磷酸缓冲液溶解，然后用同一缓冲液定容至100ml ，振摇约15分钟，使其充分溶解，然后用干纱布过滤。吸取滤液5ml ，稀释至适当倍数（如20倍、30倍、40倍）供测定用（此酶液
可在冰箱中保存一周）。
2．器材
（1） 72型或721型分光光度计 （2） 恒温水浴 （3） 试管及试管架 （4） 吸管、漏斗 四、操作步骤
1．绘制标准曲线
取不同浓度（10~60μg/ml）酪氨酸溶液各1ml ，分别加入0.55mol/L碳酸钠5 ml，酚试剂1 ml。置于30℃恒温水浴中显色15分钟，用分光光度计在680nm 处测定吸光值，用空白管（只加水、碳酸钠溶液和酚试剂）作对照，以光吸收值为纵座标，以酪氨酸的微克数为横座标，绘制标准曲线。
2．酶活力测定
吸取0.5%酪蛋白溶液2 ml 置于试管中，在30℃水浴中预热5分钟后加入预热5分钟的酶液（30℃，5分钟）1ml ，立即计时，反应10分钟后，由水浴取出，并立即加入10%三氯乙酸溶液3ml ，放置15分钟后，用滤纸过滤。
同时另作一对照管，即取酶液1ml 先加入3ml 10%的三氯乙酸溶液，然后再加入0.5%酪蛋白溶液2 ml，30℃保温10分钟，放置15分钟，过滤。
取3支试管，编号。分别加入样品滤液、对照滤液和水各1ml 。然后各加入0.55mol/L碳酸钠5 ml ，混匀后再各加入酚试剂1ml ，立即混匀，在30℃显色15分钟。以加水的一管作空白，在680nm 处测对照及样品的光吸收值。
3． 计算酶活力
规定在30℃、pH7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1μg为1个酶活力单位。
则1g 枯草杆菌蛋白酶在30℃、pH7.5的条件下所具有的活力单位为：
（A 样 — A对）· K · （v /t） · N 式中A 样——样品液光吸收值
A 对——对照液光吸收值
K ——标准曲线上光吸收值为1时的酪氨酸的微克数 t —— 酶促反应的时间（分）
v —— 酶促反应管的总体积（毫升数） N —— 酶液的稀释倍数。
五、思考题
1．你对酶的活力单位是如何理解的？
2．在进行酶活力测定时为什么要做对照液吸光值的测定？
实验十一 原子吸收法测定矿泉水中镁的含量
一、实验目的和要求
1、了解原子吸收分光光度计的分析过程、掌握其使用方法。 2、掌握标准曲线定量在原子吸收法中的应用。 二、实验原理 1、基本原理
从空心阴极灯或光源中发射出一束特定波长的入射光，在原子化器中待测元素的基态原子蒸汽对其产生吸收，未被吸收的部分透射过去。通过测定吸收特定波长的光量大小，来求出待测元素的含量。 2、标准曲线法
配制数个与待测样品基本相同的标准溶液，在给定的实验条件下，测得其吸光度A 。以标准溶液中待测元素的浓度C （或分含量）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制A-C 标准曲线。然后在相同实验条件下，测量样品试液的吸光度。根据测得的吸光度由标准曲线求出试样中待测元素含量。 三、试剂和器材
1、TAS-986仪器原子吸收分光光度计、乙炔钢瓶、空气压缩机、镁空心阴极灯、100 mL容量瓶6个、10 mL吸量管1支。
2、镁储备液的配制（1.000 mg·mL -1）准确称取于800 ℃灼烧至恒重的氧化镁（A.R. ）1.6583 g，滴加1 mol·L HCl 至完全溶解，移入1000 mL容量瓶中，稀释至标线，摇匀。此溶液镁的质量浓度为1.000 mg·mL -1。 3、ρ（Mg ）=0.00500 mg·mL -1镁标准溶液 4、矿泉水：农夫山泉 四、操作步骤
1、配制镁系列标准溶液 用10 mL吸量管分别吸取ρ（Mg ）=0.00500 mg·mL 标准溶液2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL于5个100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至标线，摇匀。此溶液含Mg 为0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.30 μg·mL-1、0.40 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1。
2、制备水样 用10 mL移液管移取水样10 mL（可根据水质适当调节水样量）于100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀至标线，摇匀。 3、将仪器调试到最佳工作状态
4、测定系列标准溶液和水样的吸光度 由稀至浓逐个测量系列标准溶液的吸光度，
-1
-1
最后测量水样的吸光度。 5、结束工作
①实验结束，吸喷去离子水3～5 min后，按关机操作顺序关机。 ②清理实验台面和试剂，填写仪器使用记录。 五、数据记录及处理
1、在坐标纸上绘制镁的A-C 工作曲线。
2、根据试液吸光度从工作曲线中找出相应浓度，然后按取样体积求出水样中镁的质量浓度。 六、注意事项
1、试样的吸光度应在工作曲线的中部，否则应改变取样体积。
2、所配制的标准溶液的浓度，应使吸光度同浓度之间保持在直线关系范围内（0.1～0.5 μg/mL）。
3、空白溶液应预选喷雾测量其吸光度，从试样吸光度中扣除空白或将空白溶液用于仪器调零，以扣除本底空白。
4、每次测完一个溶液都要用去离子水喷雾调零后，再测下一个溶液。 5、整个分析过程中操作条件应保持不变。 七、思考题
1、原子吸收分光光度计为什么要用待测元素的空心阴极灯做光源？ 2、火焰分析时水封的作用是什么？
《食品生物化学》课程
实验指导书
食品工程系
二○○四年十二月
目录
目录 . ......................................................................................................................... 1
实验一 水分活度的测定 .......................................................................................... 2
实验二 淀粉的显色和水解 . ...................................................................................... 4
实验三 总糖和还原糖的测定——斐林氏法 .............................................................. 7
实验四 油脂酸价的测定 ........................................................................................ 11
实验五 氨基酸的纸上层析 . .................................................................................... 12
实验六 牛奶中酪蛋白等电点测定 .......................................................................... 14
实验七 蛋白质的颜色反应 . .................................................................................... 16
实验八 酶的性质实验 . ........................................................................................... 18
实验九 酶的激活剂和抑制剂 ................................................................................. 21
实验十 枯草杆菌蛋白酶活力测定 .......................................................................... 23
实验十一 原子吸收法测定矿泉水中镁的含量........................................................... 26
2\11\12\16\18\
实验一 水分活度的测定
一、实验目的和要求
1．进一步了解水分活度的概念及测定原理。
2．学习测定水分活度的基本方法。
二、实验原理
水分活度反应了食品中水的存在状态，可以作为衡量微生物对食品水分可利用性的指标。控制水分活度对食品的保藏具有重要意义。无论干燥或新鲜食品中的水分，都会随环境条件的变动而变化。如果环境空气干燥湿度低，食品中的水分向空气蒸发，食品重量减轻。反之食品吸水重量增加。但不管是蒸发还是吸收水分，最终是食品与环境平衡为止。根据这一原理，食物在康威氏微量扩散皿的密封和恒温条件下，分别向A W 较高或较低的标准饱和溶液中扩散，当达到平衡后，依据样品在高A W 标准饱和溶液中重量的增加和在低A W 标准饱和溶液中重量的减少，则可计算出样品的A W 值。
三、试剂和器材
1．康威尔微量扩散皿
2．方格座标纸。
3．分析天平。
4．样品（面粉约3g ）。
5．标准饱和溶液：NaCl 及K 2CO 3•2H2O 的标准饱和溶液各式各10mL 。
四、操作步骤
1．康威氏微量扩散皿二个，分别盛氯化钠、碳酸钾饱和溶液5mL, 并在扩散皿磨口处涂一层凡士林。
2．将两个直径25mm 的玻璃皿准确称重，然后分别精确称取约1g 同一面粉于皿内（尽量做到每皿样品重量接近）。并迅速放入上述康威氏扩散皿内室中，马上加盖密封。
3．在25℃温度下放置2±0.5h ，然后依次取出玻皿准确称重。并计算每克被测样品的增减重量。
4．以饱和溶液的A W 值为横座标，样品重量增减数为纵座标，在方格座标纸上作图，将各点连接成直线，直线与横轴之交点则为该样品的A W 值。
5．讨论：
（1）康威尔皿密封一定要严。
（2）用本法测A W 值花时间较长（2个h 以上），取样和称重一定要准确。
（3）在测样品的A W 值前，应先估计一下样品的A W ，然后选择高于和低于样品A W 值的饱和溶液各两种，也可只取高于和低于样品A W 值的饱和溶液各一种。
（4）对鱼、肉等含油脂较多的食品及其它油炸食品水分活度的测定宜改用它法。
附：25℃时部分饱和溶液的水分活度值
五、思考题
1．什么叫水分活度？本实验为什么能测出样品的水分活度？
2．本实验是在25℃左右温度下测定A W 值，做此实验时，环境温度高于或低于此温度时，饱和溶液的水分活度值是否仍然为表中一样，为什么？
实验二 淀粉的显色和水解
一、实验目的和要求
1、进一步了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。
2、如何验证淀粉是否水解及其水解的条件和产物。
二、实验原理
1、淀粉与碘的反应 直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。
近年来用先进的分析技术（如X 射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。
在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。
淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。
表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色
淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。
2、淀粉的水解 淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒
会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C 6H 12O 5）m→(C6H 10O 5)n→C12H 22O 11→C6H 12O 6
淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖
葡萄糖是淀粉最重要的下游产品之一，工业生产中常常使用玉米淀粉水解来加工结晶葡萄糖。
三、试剂和器材
1、器材：试管夹、量筒、烧杯各一只、白瓷板一块、试管一支、水浴锅。
2、试剂：淀粉及0.1％溶液 、10％NaOH 溶液、20％H 2SO 4溶液、10％Na 2SO 4溶液、稀碘液、乙醇、2%CuSO4溶液。
四、操作步骤
1、淀粉与碘的反应
①取少量淀粉于白瓷板空内，加碘液两滴，观察颜色。
②取试管一支，加入0.1％的淀粉6ml ，碘两滴，摇匀，观察颜色变化。另取试管两支，将此淀粉均分为三等份并编号做如下实验：
1号管在酒精灯上加热，观察颜色变化。然后冷却，又观察颜色变化。
2号管加入10％NaOH 溶液几滴，观察颜色变化
3号管加入乙醇几滴，观察颜色变化。
记载上述实验过程和结果，并解释现象。
2、淀粉水解实验设计
设计实验方案，试验淀粉能不能水解，水解的条件和产物是什么？怎样判断淀粉是否水解了？
(1) 在试管1中加入0.5g 淀粉和4ml 水，在试管2中加入0.5g 淀粉和4ml 20%的硫酸溶液。分别加热试管3~4min。
(2) 把试管2中的一部分溶液倒入试管3中，留作下一步实验用。
(3) 向试管1和试管2中加入几滴碘溶液，观察现象。发现试管1的溶液呈蓝色（淀粉遇碘变成蓝色），试管2无明显现象。不同现象的原因是：淀粉在酸性条件并加热的条件下发生了水解反应。
(4) 向试管3中滴入10%的碱液，中和溶液中的硫酸，把溶液调呈弱碱性，使溶液的PH 值约为9~10。
(5) 另取一只试管4加入3ml 氢氧化钠溶液，并向其中滴入4滴2%的硫酸铜溶液，立即有蓝色的氢氧红铜沉淀生成。再取试管3中的水解液1ml 滴入，振荡混合均匀后，用酒精灯加热煮沸，溶液颜色常有蓝色——黄色——绿色（黄蓝两色混合）——红色等一系列变化。最终有红色沉淀生成。原因是氢氧化铜被还原生成红色难溶于水的氧化亚铜。
实验结论：
淀粉在酸的催化作用下，能发生水解；淀粉的水解过程：先生成分子量较小的糊精（淀粉不完全水解的产物），糊精继续水解生成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖。 注意事项：
淀粉水解的中间产物糊精（有分子量较大的红糊精和分子量较小的白糊精），对碘反应的颜色变化是：紫色—棕色—黄色，若淀粉水解不彻底，也会有不同的颜色出现。 问题思考：
1、试管1为什么变成了蓝色？试管2为什么无明显现象？为什么？（试管1中的淀粉未水解，淀粉遇碘变成蓝色；试管2中淀粉在酸的催化作用下水解了，所以无明显现象；不同现象的原因是：淀粉在酸性条件并加热的条件下发生了水解反应。）
2、如何验证淀粉没有还原性？（提示：不能发生银镜反应或者不能还原氢氧化铜）
3、实验延伸设计：如何验证唾液酶对淀粉水解的催化作用？（注意事项：用唾液作催化剂水解淀粉时，温度不得超过45摄氏度，因为温度过高，唾液酶易失去活性，最适宜的温度是37—40摄氏度。）
实验三 总糖和还原糖的测定——斐林氏法
一、实验目的和要求
掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。
二、实验原理
还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu 、Hg 、Fe 、Ag 等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。
本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH + CuSO 4 = Cu(OH)2+ Na2SO 4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜：
2+2+3++
在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，其反应如下：
反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。
Cu 2O + K4Fe(CN)6 + 3 H2K 2Cu 2Fe(CN)6 + 2 KOH + 2 H2O
亚铁氰化钾 亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐
滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二
价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。
三、试剂和器材
1、试剂
费林试剂：
甲液：称取15g 硫酸铜（CuSO 4·5H 2O ）及0.05g 亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000mL 。
乙液：称取50g 酒石酸钾钠及75g NaOH ，溶于蒸馏水中，再加入4g 亚铁氰化钾［K 4Fe （CN ）6］，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000mL ，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。
0.1％葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g 经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000mL 容量瓶中，加入5mL 浓HCl （防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000mL 。
6mol/L HCl：取250mL 浓HCl （35%～38%）用蒸馏水稀释到500mL 。
碘－碘化钾溶液：称取5g 碘，10g 碘化钾溶于100mL 蒸馏水中。
6mol/L NaOH：称取120gNaOH 溶于500mL 蒸馏水中。
0.1%酚酞指示剂。
2、材料
藕粉，淀粉。
3、器材
试管3.0×20cm （×1）；移液管5mL （×2）；烧杯100mL(×1);
250mL 锥形瓶; 调温电炉; 滴定管25mL(×1) 。
三、操作方法
1、样品中还原糖的提取
准确称取1~2g藕粉，放在100mL 烧杯中，先以少量
蒸馏水调成糊状，然后加入约40mL 蒸馏水，混匀，于50℃
恒温水浴中保温20min ，不时搅拌，使还原糖浸出混。过
滤，将滤液全部收集在50mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容
至刻度，即为还原糖提取液。
2、样品中总糖的水解及提取
准确称取1~2g淀粉，放在大试管中，加入6mol/L HCl
10mL ，蒸馏水15mL ，在沸水浴中加热0.5h ，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入
1
滴酚酞指示剂，以6mol/L NaOH 溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100mL ，过滤取滤液10mL 于100mL 容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。
3、空白滴定
准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL ，置于250mL 锥形瓶中，加蒸馏水10mL 。从滴定管滴加约9mL 葡萄糖标准溶液，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s ，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值，按下式计算：
式中：F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL ）相当于葡萄糖的量，mg ；
C──葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；
V──标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL 。
4、样品糖的定量测定
按图1-1装置热滴定仪器。
(1) 样品溶液预测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL ，置于250mL 锥形瓶中，加蒸馏水10mL ，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s ，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。
(2) 样品溶液测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL ，置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL ，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1mL 的样品溶液，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s ，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。
四、结果处理
式中：m──样品重量，g ；
F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL ）相当于葡萄糖的量，mg ；
V──标定时平均消耗还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL ；
V 1──还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL ；
1000──mg换算成g 的系数。
注意事项
（1）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。
（2）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。
（3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。 五、思考题
1．在费林试剂热滴定法中为什么用亚甲基蓝作为滴定终点的指示剂？
2．用费林试剂热滴定法测定还原糖，为什么整个滴定过程必须使溶液处于沸腾状态？
3．在费林试剂热滴定法中样品溶液预测定有何作用？
实验四 油脂酸价的测定
一、实验目的和要求
1．初步掌握测定油脂酸价的原理与方法。 2．了解测定油脂酸价的意义。 二、实验原理
油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有剌激性气味，使油脂产生酸败。酸败的程度是以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价（或酸值）来表示。同一种油脂若酸价高，则说明油脂水解产生的游离脂肪酸就多。
酸价是指中和1g 脂肪中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也越差。 三、试剂和器材
1．锥形瓶（250mL ）。 2．量筒（50mL ）。 3．碱式滴定管（250mL ）。 4．花生油或菜油
5．1：1乙醇——乙醚混合液 6．0.1mol/L氢氧化钾标准溶液 7． 酚酞-乙醇溶液 四、操作步骤
1．准确称取1~3g菜油于250 mL锥形瓶中。
2．在瓶内加入乙醇—乙醚混合液50 mL，充分振动，使油样完全溶解成透明溶液。 待油样完全溶解后，加入1%酚酞指示剂1~2滴，立即用0.1mol/L氢氧化钾标准溶液滴定至溶液呈微红色（放置30S 内不褪色）为终点，并记录用去的氢氧化钾的体积，并按下式计算酸价。
消耗氢氧化钾毫升数×氢氧化钾标准溶液浓度×氢氧化钾分子量
酸价== ————————————————————————
油脂样品的克数 五、思考题
1．测定油脂酸价时，装油的锥形瓶和油样中均不得混有无机酸，这是为什么？ 2．为什么酸价的高低可作为衡量油脂好坏的一个重要指标？
实验五 氨基酸的纸上层析
一、实验目的和要求
1、了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。
2、学习纸层析的操作技术，分析未知样品的氨基酸成分。 二、实验原理
纸层析法属于分配层析法的一种，是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维上分布大量的亲水性羟基，因此能吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品在滤纸上(此点称为原点) ，用有机溶剂进行展层时，样品中的各种溶质即在两相溶剂中不断进行分配。由于各种溶质在两相溶剂中的分配系数不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，于是从点样的一端向另一端展开时，样品中不同溶质被分离开来，形成距原点距离不等的层析点。样品被分离后在纸层析图谱上的位置，是用比移值R f 来表示的
R f
原点到层析斑点的中心原点到溶剂前沿的距离
距离
在一定条件下(如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变) ，某物质的R f 值是一个常数，借此可作定性分析依据。本实验只利用纸层析分离氨基酸。 三、试剂和器材
(1) 层析缸(可用标本缸代替) 。 (2) 层析滤纸(新华一号滤纸) 。
(3) 喷雾器、电吹风、三角板、铅笔、毛细管(可用微量注射器代替) 。
(4) 氨基酸标准溶液：1%的甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、缬氨酸、脯氨酸。 (5) 混合氨基酸溶液：将1%的甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、缬氨酸、脯氨酸也按1%浓度制成混合溶液。
(6) 展层剂：正丁醇：80%甲酸：水＝15：3：2 (体积分数)
(7) 色剂：0.1%茚三酮－丙酮溶液 (取0.1g 茚三酮溶于100mL 无水丙酮，贮于棕色瓶中待用。) 四、操作步骤
(1) 取滤纸二张 (12cm×12cm) ，按图要求画好平行线和样点并在样点上标号。 (2) 点样 用毛细管依次点上氨基酸标准样液和混合液于样点并记录各样点所点的氨基酸。点样时一定要注意：第一，样点直径控制在3mm 以内；第二，每样点需重复点3次，但每次需经干燥后方可再点，为了快速干燥，可用电吹风在较低档温度下风干。点好样的滤纸卷成筒状，用透明胶纸黏接，要注意在卷纸筒时，两纸不能搭接。
(3) 展层 在层析缸内放好展层剂，(展层剂液面高度约1cm) ，将一张点好样的滤纸小心地移入层析缸，点样端浸入展层剂甲中，要特别注意不要使样点浸入展层剂。盖好层析缸。当看到展层剂到达画定的溶剂前沿线时，取出滤纸，用较低档温度电吹风吹干。
(4) 显色 将上述滤纸经吹干后用喷雾器把茚三酮溶液均匀地喷在纸上(不要喷的太多) ，取下纸，放入65℃烘箱中显色数分钟，或用电吹风热风吹干显色亦可。 五、计算
计算各氨基酸的R f 。
实验六 牛奶中酪蛋白等电点测定
一、实验目的和要求
1、初步学会测定蛋白质等电点的基本方法。 2、了解蛋白质的两性解离性质。 二、实验原理
蛋白质分子中有一定数量的自由氨基和自由羧基存在(以及一些其他酸性和碱性基团) ，是两性电解质。作为带电颗粒它可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH 影响。当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子(zwitterion,净电荷为O) ，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点(isoelectric point,简写pI) 。
处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶液的pH 大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。不同蛋白质，等电点不同。在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。因此，可以借助在不同pH 溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。通过本实验可以测定酪蛋白的等电点，为提取酪蛋白打下基础。 三、试剂和器材
(1) 试管及试管架。 (2) 吸管与滴管。
(3) 100mL容量瓶和25mL 锥形瓶。 (4) 水浴锅和温度计。 (5) 1.00mol/L醋酸。 (6) 0.1mol/L醋酸。 (7) 1mol/L醋酸。 (8) 蒸馏水。 (9) 牛奶 四、操作步骤
1、取五支同种规格的试管，编号，按表4－1顺序精确加入各种试剂，然后逐一振荡试管，并使试管混合均匀。
表4－1 蛋白质的等电点测定表
2、将上述试管静置于试管架上约15分钟后，仔细观察，比较各管的浑浊度，将观察的结果记载于表内，并指出酪蛋白的等电点。
注：①本实验各种试剂的浓度及用量均要求很准确。 ②浑浊度可用－、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示。 五、思考题：
什么叫等电点？在等电点时，蛋白质为什么容易被沉淀析出？
实验七 蛋白质的颜色反应
一、实验目的和要求
1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理
1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。
2、茚三酮反应
蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。
该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 三、试剂和器材
1、试剂
①鸡蛋清②尿素③10％NaOH 溶液④1％硫酸铜溶液⑤0.1％茚三酮-乙醇溶液
2、仪器 试管及试管夹、酒精灯 四、操作步骤
1、双缩脲反应
①取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH 溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。
②另取1支试管，加入稀释过的蛋清溶液2滴，再加入5滴10％NaOH
溶液摇匀，
然后再加入1滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。
注意事项：加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。
2、茚三酮反应
①取1支试管，加入稀释的蛋清溶液4滴，0.1％茚三酮-乙醇溶液2滴，混匀后在小火上加热煮沸1～2min ，放置冷却，观察颜色变化。
②另取2支试管，用0.5％的酪蛋白和0.5％的甘氨酸溶液代表蛋白溶液，进行茚三酮反应，观察颜色变化。
五、思考题
通过实验谈一谈你对蛋白质的颜色反应有何认识。
实验八 酶的性质实验
一、实验目的和要求
1．加深对酶的性质的认识
2．学会观察酶的专一性以及温度、酸度（PH ）等因素对酶活性的重要影响。 二、实验原理
酶具有高度的专一性。淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。可用班氏（Benedict ）试剂检查糖的还原性。
酶的活性受温度的影响，在最适温度下，酶的催化反应速度最高，大多数动物酶的最适温度在37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。偏离此最适环境时，酶的活性减弱。
酶的活力受环境pH 的影响极为显著。不同酶的最适pH 值不同。本实验观察pH 对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH 为6.8。 三、试剂和器材：
1．试剂
（1）2%蔗糖溶液（至少要分析纯）。
（2）溶于0.3%氯化钠的1%淀粉溶液（需新鲜配制）。 （3）稀释200倍数的新鲜唾液。
（4）蔗糖酶溶液：将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2-3次（离心法），然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100g 置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨，提取约1小时，再加蒸馏水，使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。
（5）班氏（Benedict ）试剂：无水硫酸铜1.74g 溶于100ml 热水中，冷却后稀释至150ml ，取柠檬酸钠173g ，无水碳酸钠100g 和600ml 水共热，溶解后冷却并加水至850ml 。再将冷却的150ml 硫酸铜溶液注入。本试剂可长久保存。 （6）0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液（需新鲜配制）
（7）碘化钾-碘溶液：将碘化钾20g 及碘10g 溶于100ml 水中。使用前稀释10倍。 （8）新配制的溶于0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液 （9）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 （10）0.1mol/L柠檬酸溶液
（11）pH 试纸：pH=5、pH=5.8、pH=6.8、 pH=8
2．器材
恒温水浴、试管及试管架、锥形瓶、吸管、滴管、白瓷板等 四、操作步骤：
1．酶的专一性
（1）淀粉酶的专一性按下表操作：
管号 1%淀粉溶液(滴)
1
2 - 4 - - 1
3 4 - 1 - -
4 - 4 1 - -
5 4 - - 1 -
6 - 4 - 1 -
4
2%蔗糖溶液（滴） -
- 稀释唾液(ml)
-
煮沸过的稀释唾液
1
(ml) 蒸馏水(ml)
37℃恒温水浴15分钟
现象
（2）蔗糖酶的专一性按下表操作：
管号 1%淀粉溶液(滴) 2%蔗糖溶液（滴） 蔗糖酶溶液(ml) 煮沸过的蔗糖酶溶液(ml)
蒸馏水(ml) Benedict 试剂(ml)
现象
2．温度对酶活力的影响
淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈色。在不同的温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由其遇碘呈现的颜色来判断。
取3支试管，编号后按下表加入试剂：
1 4 - - - 1
2 - 4 - - 1
3 4 - 1 - -
4 - 4 1 - -
5 4 - - 1 -
6 - 4 - 1 -
沸水浴2～3分钟
37℃恒温水浴5分钟
1
1
1
1
1
1
沸水浴2～3分钟
管号 淀粉溶液(ml) 稀释唾液(ml)
煮沸过的稀释唾液(ml)
1 1.5 1 -
2 1.5 1 -
3 1.5 - 1
摇匀后，将1号、3号两试管放入37℃水浴中，2号试管放入冰水中。10分钟后取出，（将2号管内液体分为两半），用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10分钟后，再用碘液试验，判断结果。
3．pH 对酶活力的影响
取4个标有号码的50ml 锥形瓶。用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0-8.0的四种缓冲液。
锥形瓶 0.2mol/L磷酸氢二钠0.1mol/L柠檬酸号 1 2 3 4
（ml ） 5.15 6.05 7.72 9.72
（ml ）
4.85 3.95 2.28 0.28
5.0 5.8 6.8 8.0 pH
从4个锥形瓶中各取缓冲液3ml ，分别注入4支编好号的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2ml 和稀释200倍的唾液2ml 。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管内容物混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。
在第4管中加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第4管取出1滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为桔黄色时，向所有试管依次添加1-2滴碘化钾-碘溶液。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔，从第一管起，亦均为1分钟。观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH 对唾液淀粉酶活性的影响。 五、思考题
1．试解释酶为什么具有很高的催化效率？
2．什么是酶的专一性？试从你所做实验及其结果解释酶具有这种性质。
实验九 酶的激活剂和抑制剂
一、实验目的和要求
1、了解酶促反应的激活与抑制。
2、学习检定激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理。 二、实验原理
酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂，有些物质会使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性。而且常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。
本实验主要观察抑制剂和激活剂对唾液淀粉酶的活性影响。其中氯化钠可以作为唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜为其抑制剂。值得注意的是，氯化钠达到1/3饱和度时就会抑制唾液淀粉酶的活性。 三、试剂和器材
1、试剂 ①稀释100倍数的新鲜唾液②新配置的1％淀粉溶液③碘化钾-碘溶液④1％氯化钠溶液⑤0.5％硫酸铜溶液⑥pH 试纸：pH5、pH5.8、pH6.8、pH8.0。
2、器材 试管及试管夹、恒温水浴锅、移液管（10mL 、5mL 各1支） 四、操作步骤
取3支标有号码的试管，向第1支试管中加入1％氯化钠溶液1mL ，向第2支试管中加入0.5％硫酸铜溶液1mL ，向第3支试管中加入蒸馏水1mL 作为对照。再向每支试管各加入1％淀粉溶液3mL 和稀释的唾液1mL 。摇匀各管内容物，一齐放入37℃恒温水浴中保温，10-15min 后取出。冷却后，各滴入2-3滴碘化钠-碘溶液，混匀，观察比较3支试管颜色的深浅。
注意事项：保温时间因唾液淀粉酶活力而异。如果激活剂或抑制剂的作用不明显，可以适当延长反应时间或降低唾液稀释倍数。 五、思考题：
1、酶作为生物催化剂具有哪些特性？
2、激活剂可以分为哪几类？本实验中的氯化钠属于其中那一类？
实验十 枯草杆菌蛋白酶活力测定
一、实验目的和要求
1． 学习测定蛋白酶活力的基本原理。
2． 握用分光光度法测定蛋白酶活力的原理与技术。 二、实验原理
磷钨酸与磷钼酸的混合物，即福林—酚试剂，它在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色的物质（钼蓝和钨蓝的混合物）。酪蛋白经蛋白酶作用后产生的酪氨酸带有酚基，可与酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用分光光度法测定，从而可确定酶活力的大小。 三、试剂和器材
1．试剂
（1）酚试剂：于2000ml 磨口回流装置内加入钨酸钠（Na 2WO 4•2H2O ）100g ，钼酸钠（Na 2MoO 4•2H2O ）25g ，水700ml ，85%磷酸50ml ，浓盐酸100ml 。微火回流10小时后加入硫酸锂150g ，蒸馏水50ml 和数滴溴摇匀。煮沸约15分钟，以驱逐残溴，溶液呈黄色。冷却后定容到1000ml ，过滤，置于棕色瓶中保存。使用前1份福林试剂与2份水混合，摇匀。
（2）0.55mol/L碳酸钠溶液 （3）10%三氯乙酸溶液
（4）0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白2.5g, 用0.5 mol /L的氢氧化钠溶液4ml 润湿，加0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液少许，在水浴中加溶解。冷却后，用上述缓冲液定容至500ml ，此试剂临用时配制。
（5）0.02mol/L pH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO 4•12H2O)71.64g, 用水定容至1000ml 为A 液。称取磷酸二氢钠(NaH2PO 4•2H2O)31.21g ，用水定容至1000ml 为B 液。取A 液840ml ，B 液160ml ，混合后即成0.2mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，临用时稀释10倍。
（6）100μg/ml酪氨酸溶液：准确称取干的酪氨酸100mg, 当0.2 mol /L盐酸溶液溶解，定容至100ml ，临用时用水稀释10倍，再分别配制成几种10~60μg/ml浓度的酪氨酸溶液。
（7）酶液：称取1g 枯草杆菌蛋白酶的酶粉，用少量0.02mol/L pH7.5磷酸缓冲液溶解，然后用同一缓冲液定容至100ml ，振摇约15分钟，使其充分溶解，然后用干纱布过滤。吸取滤液5ml ，稀释至适当倍数（如20倍、30倍、40倍）供测定用（此酶液
可在冰箱中保存一周）。
2．器材
（1） 72型或721型分光光度计 （2） 恒温水浴 （3） 试管及试管架 （4） 吸管、漏斗 四、操作步骤
1．绘制标准曲线
取不同浓度（10~60μg/ml）酪氨酸溶液各1ml ，分别加入0.55mol/L碳酸钠5 ml，酚试剂1 ml。置于30℃恒温水浴中显色15分钟，用分光光度计在680nm 处测定吸光值，用空白管（只加水、碳酸钠溶液和酚试剂）作对照，以光吸收值为纵座标，以酪氨酸的微克数为横座标，绘制标准曲线。
2．酶活力测定
吸取0.5%酪蛋白溶液2 ml 置于试管中，在30℃水浴中预热5分钟后加入预热5分钟的酶液（30℃，5分钟）1ml ，立即计时，反应10分钟后，由水浴取出，并立即加入10%三氯乙酸溶液3ml ，放置15分钟后，用滤纸过滤。
同时另作一对照管，即取酶液1ml 先加入3ml 10%的三氯乙酸溶液，然后再加入0.5%酪蛋白溶液2 ml，30℃保温10分钟，放置15分钟，过滤。
取3支试管，编号。分别加入样品滤液、对照滤液和水各1ml 。然后各加入0.55mol/L碳酸钠5 ml ，混匀后再各加入酚试剂1ml ，立即混匀，在30℃显色15分钟。以加水的一管作空白，在680nm 处测对照及样品的光吸收值。
3． 计算酶活力
规定在30℃、pH7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1μg为1个酶活力单位。
则1g 枯草杆菌蛋白酶在30℃、pH7.5的条件下所具有的活力单位为：
（A 样 — A对）· K · （v /t） · N 式中A 样——样品液光吸收值
A 对——对照液光吸收值
K ——标准曲线上光吸收值为1时的酪氨酸的微克数 t —— 酶促反应的时间（分）
v —— 酶促反应管的总体积（毫升数） N —— 酶液的稀释倍数。
五、思考题
1．你对酶的活力单位是如何理解的？
2．在进行酶活力测定时为什么要做对照液吸光值的测定？
实验十一 原子吸收法测定矿泉水中镁的含量
一、实验目的和要求
1、了解原子吸收分光光度计的分析过程、掌握其使用方法。 2、掌握标准曲线定量在原子吸收法中的应用。 二、实验原理 1、基本原理
从空心阴极灯或光源中发射出一束特定波长的入射光，在原子化器中待测元素的基态原子蒸汽对其产生吸收，未被吸收的部分透射过去。通过测定吸收特定波长的光量大小，来求出待测元素的含量。 2、标准曲线法
配制数个与待测样品基本相同的标准溶液，在给定的实验条件下，测得其吸光度A 。以标准溶液中待测元素的浓度C （或分含量）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制A-C 标准曲线。然后在相同实验条件下，测量样品试液的吸光度。根据测得的吸光度由标准曲线求出试样中待测元素含量。 三、试剂和器材
1、TAS-986仪器原子吸收分光光度计、乙炔钢瓶、空气压缩机、镁空心阴极灯、100 mL容量瓶6个、10 mL吸量管1支。
2、镁储备液的配制（1.000 mg·mL -1）准确称取于800 ℃灼烧至恒重的氧化镁（A.R. ）1.6583 g，滴加1 mol·L HCl 至完全溶解，移入1000 mL容量瓶中，稀释至标线，摇匀。此溶液镁的质量浓度为1.000 mg·mL -1。 3、ρ（Mg ）=0.00500 mg·mL -1镁标准溶液 4、矿泉水：农夫山泉 四、操作步骤
1、配制镁系列标准溶液 用10 mL吸量管分别吸取ρ（Mg ）=0.00500 mg·mL 标准溶液2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL于5个100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至标线，摇匀。此溶液含Mg 为0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.30 μg·mL-1、0.40 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1。
2、制备水样 用10 mL移液管移取水样10 mL（可根据水质适当调节水样量）于100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀至标线，摇匀。 3、将仪器调试到最佳工作状态
4、测定系列标准溶液和水样的吸光度 由稀至浓逐个测量系列标准溶液的吸光度，
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-1
最后测量水样的吸光度。 5、结束工作
①实验结束，吸喷去离子水3～5 min后，按关机操作顺序关机。 ②清理实验台面和试剂，填写仪器使用记录。 五、数据记录及处理
1、在坐标纸上绘制镁的A-C 工作曲线。
2、根据试液吸光度从工作曲线中找出相应浓度，然后按取样体积求出水样中镁的质量浓度。 六、注意事项
1、试样的吸光度应在工作曲线的中部，否则应改变取样体积。
2、所配制的标准溶液的浓度，应使吸光度同浓度之间保持在直线关系范围内（0.1～0.5 μg/mL）。
3、空白溶液应预选喷雾测量其吸光度，从试样吸光度中扣除空白或将空白溶液用于仪器调零，以扣除本底空白。
4、每次测完一个溶液都要用去离子水喷雾调零后，再测下一个溶液。 5、整个分析过程中操作条件应保持不变。 七、思考题
1、原子吸收分光光度计为什么要用待测元素的空心阴极灯做光源？ 2、火焰分析时水封的作用是什么？