全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性
【摘要】 目的 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC) 的方法，研究MSC的生物学特性。方法 贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代, 在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。结果 原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期, 3天后进入生长期,7天后进入平台期。
论文百事通
FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。结论 贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。
【关键词】 间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养
Abstract:Objective To establish a simple and effective method of isolation, purification and cultivation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) in vitro, and explore their biological
characteristics.Methods MSC were isolated and purified for culture in vitro and serial passage by the attachment culture method. The morphological changes of the MSC were continuously observed under the inverted
microscope. The cell growth curve was measured by MTT method, and membrane antigens were detected with flow cytometry (FCM).Results The MSC in primary culture which were adhered to plastic surface within 48 h after displacement took the oval, asteroid, short and fusiform shapes. 12 days after culture in DMEM-F12 medium containing 10% FBS, the cells reached 90% confluence in single layers, taking a long and fusiform shape. Further purification was achieved by expansion at serial passages. MSC were in latency for 2 days, converted into growth period on the 3rd day and entered the stationary phase on the 7 th day. FCM results indicated that the positive rate of CD45 and CD90 was 19.60% and 95.38%, respectively.Conclusion The attachment culture method can be effectively used to isolate and purify rat MSC. The cultured MSC are stable in growth with active proliferation and share the general biological characteristics of MSC, which will further make them ideal seed cells for tissue engineering.
Key words: mesenchymal stem cells; bone marrow; attachment culture
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) 是骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞及神经星状细胞等，且具有极强的自我修复能力。加之其具有获取简便、对供体损伤小、增殖力强、来源广泛、免疫原性弱［1］、自体移植不发生排斥反应［2］、不涉及伦理等特点，成为研究的热点。本实验通过分离培养、鉴定大鼠MSC，研究其生物学特性，从而为MSC的体外定向分化及作为种子细胞进一步应用于组织工程和再生医学提供实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM-F12培养基(Gibco公司),优级胎牛血清(杭州四季青有限公司) ，蛋白酶(Sigma公司),倒置显微镜(Nikon公司)，细胞培养箱(Sanyo公司)。实验动物为雄性SD大鼠, 3周龄, 100～150 g, 清洁级(徐州医学院实验动物中心提供)。FITC 标记CD45、CD90抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.2.1 MSC的分离纯化及培养 将大鼠脱臼处死后用碘伏浸泡5 min,无菌条件下分离出大鼠股骨和胫骨,离体的骨骼放入灭菌PBS缓冲液中冲洗。剪去干骺端, 暴露骨髓腔,无菌注射器抽取未添加肝素的含10% FBS、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM-F12培养基反复冲洗骨髓腔,直至腔内所有骨髓血冲净。接种于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基, 置于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。3天首次换液, 以后每3天换液1次, 7～14天细胞生长融合达80%以上,以0.25%胰蛋白酶消化后按1∶3 的比例传代培养。倒置显微镜下逐日观察细胞形态。
1.2.2 MSC生长曲线的测定 原代培养细胞达80%以上融合后,D-Hank 液冲洗,胰酶消化传代,并标记为P1。取生长状态良好的第3代细胞,胰酶消化后,按1×107/L接种于96孔培养板中,每孔培养液为100 μ每24 h取上述各代细胞各3孔,MTT比色法测各孔光密度值(D490值) ,连续测8天,以时间为横坐标、l。D490值为纵坐标绘制各代细胞的生长曲线。具体操作:测定前每孔加入MTT 溶液20 μl,37℃孵育4 h,尽量吸掉上清液, 每孔加入150 μl DMSO,室温振荡10 min,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的D490值,求其平均值。以时间为横坐标、光密度(D)为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.2.3 MSC细胞表面分子鉴定 取P3代生长良好的MSC,以0.25%胰酶消化细胞,按1×109/L重悬细胞,
重悬细胞并分2管,分别加入100 μl CD45、避光孵育30 min。PBS洗涤1次，CD90，1000 r/min离心5 min
沉淀细胞,倒去上清液，加500 μl PBS进行流式细胞术(FCM)分析。
2 结果
2.1 MSC的分离培养、扩增结果 将分离的未离心的MSC悬液直接接种培养24 h后,发现培养瓶内有大量悬浮细胞,主要为圆形红细胞。72 h行首次半量换液后仍不易观察MSC的贴壁情况,将首次换液的吸出液在新培养瓶内加培养液继续培养,均经过2～3次换液后,漂浮的不贴壁细胞大部分随换液除去,可见较多的贴壁细胞, 散在生长,分布不均,少部分呈集落状或单个细胞存在,胞体呈长梭形,两端有长突起,胞质内颗粒较多,折光性差,核不清楚。贴壁细胞前1～2天生长缓慢,约3天后明显增殖,细胞形态更加清晰,核明显可见,并有1～2个核仁（图1A）。在第7天时,形成明显克隆，在10～14天时,血细胞随换液全部清除,贴壁细胞形态比较一致,已基本贴满培养孔板底部,呈漩涡状或辐射状排列,细胞变得扁平,胞体狭长,核呈椭圆形（图1B）,进行第1次传代培养。传3代后培养的MSC(图1C) 形态上更加趋于一致,为成纤维细胞样,无原代存有的圆形或类圆形细胞,增殖速度较原代细胞快,形态无明显变化,每隔3天换液1次,5～7天传代1次。部分细胞传代10次后, 就变得宽大扁平，增殖速度减慢。
图1 MSC的形态学特点（倒置相差显微镜,×100）（略）
A. 原代3天MSC贴壁生长;B. 原代14天MSC长满瓶底90%以上;C.第3代MSC
2.2 大鼠骨髓MSC生长规律 MSC传代7代以前增殖速度较快,传代细胞一般7天左右能达到80%以上融合。细胞传代后1～2天为滞留期,3天后达对数生长期,第6天进入平台期。MSC体外培养生长曲线见图2。
图2 MSC 体外培养生长曲线（略）
2.3 MSC细胞表面分子鉴定 P3代大鼠骨髓MSC培养6天，经FCM检测,CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。
3 讨论
MSC广泛分布于人体各种器官和组织,但最易得到、最富集和研究最多的是来源于骨髓的MSC［3］。20世纪70年代中期，Friedenstein［4］将整个骨髓放置于塑料培养皿中，去除非贴壁细胞后可以观察到贴壁细胞呈梭形并形成2个或4个细胞的小灶，经传代及培养后能分化成类似于骨和软骨的集落。1997年，Prockop［5］更成功地分离出MSC，发现其具有多种分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和胶质细胞。由于骨髓中MSC数量少，平均每10万个有核细胞中仅含有1个MSC［6］，并且随着年龄的增长，其数量逐渐减少［7］；而且体外培养条件下,仅有少数MSC能够活跃地复制。因此,建立体外分离、纯化和大量扩增骨髓MSC 的方法,观察MSC表面分子表达,探索保持其增殖潜能与多向分化潜能的适宜培养条件,是进一步开展MSC应用研究的重要实验基础。有研究发现幼年大鼠骨髓中的MSC多于老年大鼠, 随着年龄的增加, 成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）测定显示骨髓克隆形成细胞的数量逐渐递减。动物体重对骨髓的MSC分离也有影响。体重＞250 g的大鼠骨髓中含有较多的脂肪细胞, 密度梯度离心后, 在白膜层形成颗粒状聚集物, 影响分离效果。体重＜150 g的大鼠骨骼细小, 分离所得的细胞数少。结合大鼠周龄和体重两方面的因素, 故我们的实验取3周龄、120 g左右的大鼠能在细胞分离的质和量上达到较佳效果。由于MSC体外扩增培养受不同种类、不同批次和不同浓度血清以及接种密度等因素的影响较大［8］,本研究选用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基,可以满足体外培养下MSC快速生长的要求,从P1代细胞开始,MSC增殖速率明显提高,对数生长期细胞群体倍增时间仅为20 h左右。目前从骨髓中分离MSC的方案主要有:密度梯度离心法、贴壁筛选法［9-10］、FCM离法和免疫磁珠法。通常是采用Percoll或Ficoll密度梯度离心法分离MSC, 使用该法分离的细胞虽然纯度较高, 但常影响细胞的增殖活力且操作较繁琐。FCM分离法是根据不同细胞具有不同的表面标志的特点,以荧光抗体与细胞表面标志结合,然后用FCM进行分选。该方法的优点是分离迅速、纯度高,但仪器昂贵,费用较高,含量太低的痕量细胞难以分离,要获得无菌的细胞制剂比较麻烦,而且不能处理大量的样品。免疫磁珠分选法是根据磁珠既可结合蛋白质又可被磁铁所吸附的原理，经过一定处理将抗体或抗原结合在磁珠上,使之成为抗体或抗原的载体,磁珠上抗体或抗原与特异性抗原或抗体结合后,形成抗原-抗体磁珠免疫复合物,这种复合物在磁力作用下,发生力学移动,使复合物与其他物质分离,从而达到分离特异性抗原或抗体的目的。该方法的优点是避免了免疫毒素和补体裂解带来的非特异性杀伤作用并可以处理大量的细胞样品,因此在临床和基础研究中具有很诱人的应用前景,但价格昂贵、操作复杂。因此我们仅选用贴壁筛选法分离。此法是根据MSC对底物的黏附特性而造血细胞系悬浮生长的特性将其分离, 可能混有巨噬细胞等引起纯度不足, 但由于骨髓冲出液中存在着滋养细胞和某些细胞因子, 起到了支持MSC体外扩增的作用, 从而有助于细胞的存活和功能维持。通过每次换液弃除造血细胞, 传代时严格控制胰酶的量和消化时间, 利用MSC较易脱落的特点, 保证其在短时间内与培养瓶底分开, 巨噬细胞等则因贴壁性强仍贴附于培养瓶底, 从而使MSC得到纯化。另外, 我们将原代细胞培养72 h的首次半量换液吸出液在新培养瓶内继续培养, 同样经过2～3次换液将大部分不贴壁细胞除去后, 仍有较多的贴壁细胞, 其生长性状及免疫细胞组织化学染色均无区别, 说明原代MSC 72 h仍有不贴壁的,与文献报道不完全一致［10］，为掌握分离培养MSC的时间提供了新的思路。同时我们运用该法获得的MSC增殖能力强, 其体外生长特性也与文献报道［9-10］一致。
生长曲线可分潜伏适应期、对数生长期和平台期,这些时期每个细胞系都有其特性, 生长曲线的测定对于设计常规传代以及实验方法非常重要, 从生长曲线的形状也可获得培养物繁殖潜力的信息。实验发现骨髓MSC的生长性状基本稳定,细胞为均一的成纤维细胞样,潜伏适应期在第1～2天(约24 h),对数生长期为第3～5天(约72 h) ,以后进入平台期。在对数生长期,群体倍增时间为34 h,传代周期约6天,每传代1次细胞增加约2.2倍。有人统计单个MSC经20次扩增, 细胞数可达80～150万［11］,说明MSC适应能力强,增殖速度快,体外扩增容易,有巨大的扩增潜能。另外,从理论上讲,在体外设法诱导或用外源目的基因导入等技术,
可使细胞进行对称性有丝分裂,从而无限扩增而不分化。因此,MSC可作为组织工程的种子细胞、细胞治疗和基因治疗的载体, 用于疾病和损伤的治疗。
对于MSC的鉴定目前尚无特异性的标记物［12］,研究证明分离纯化的骨髓MSC能表达多能MSC的特异性标志物CD68、CD44、CD77、CD90,而不表达CD34、CD45等造血干细胞的特异性标志物。FCM测定发现,细胞贴壁附着后均一表达SH2、 SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124 等多种表面蛋白［13］。本实验采用FCM技术，结果培养的细胞稳定表达CD90,而CD45阴性,说明本实验培养的细胞既非造血干细胞,也非成纤维细胞。目前,国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出了鉴定人来源MSC的3条最低标准［14］②通过FCM:①在标准培养条件下,MSC必须具备对塑料底物的贴附性；检测,MSC群体表达CD105、CD73及CD90阳性率≥95%,而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR 阳性率≤2%；③经体外诱导,MSC必须能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。该标准特别指出,对于动物来源的MSC ,除第2条标准不具有普遍意义的适用性外,第1条、第3条描述的生物学特征同样适用于动物来源的MSC。作为借鉴,本研究在证明了体外分离的大鼠骨髓MSC对塑料器皿的贴附特性以及细胞表面分子的初步鉴定之后,因时间、精力限制未做体外诱导试验。因此, 贴壁培养法分离培养的大鼠骨髓细胞具有MSC的一般生物学特性,所获得的细胞形态均一、增殖速度快、生长性状稳定，且具有操作简便、快速、实用、对细胞活性影响小、成本低等优点,为其作为组织工程种子细胞提供了实验基础。
【参考文献】
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全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性
【摘要】 目的 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC) 的方法，研究MSC的生物学特性。方法 贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代, 在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。结果 原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期, 3天后进入生长期,7天后进入平台期。
论文百事通
FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。结论 贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。
【关键词】 间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养
Abstract:Objective To establish a simple and effective method of isolation, purification and cultivation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) in vitro, and explore their biological
characteristics.Methods MSC were isolated and purified for culture in vitro and serial passage by the attachment culture method. The morphological changes of the MSC were continuously observed under the inverted
microscope. The cell growth curve was measured by MTT method, and membrane antigens were detected with flow cytometry (FCM).Results The MSC in primary culture which were adhered to plastic surface within 48 h after displacement took the oval, asteroid, short and fusiform shapes. 12 days after culture in DMEM-F12 medium containing 10% FBS, the cells reached 90% confluence in single layers, taking a long and fusiform shape. Further purification was achieved by expansion at serial passages. MSC were in latency for 2 days, converted into growth period on the 3rd day and entered the stationary phase on the 7 th day. FCM results indicated that the positive rate of CD45 and CD90 was 19.60% and 95.38%, respectively.Conclusion The attachment culture method can be effectively used to isolate and purify rat MSC. The cultured MSC are stable in growth with active proliferation and share the general biological characteristics of MSC, which will further make them ideal seed cells for tissue engineering.
Key words: mesenchymal stem cells; bone marrow; attachment culture
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) 是骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞及神经星状细胞等，且具有极强的自我修复能力。加之其具有获取简便、对供体损伤小、增殖力强、来源广泛、免疫原性弱［1］、自体移植不发生排斥反应［2］、不涉及伦理等特点，成为研究的热点。本实验通过分离培养、鉴定大鼠MSC，研究其生物学特性，从而为MSC的体外定向分化及作为种子细胞进一步应用于组织工程和再生医学提供实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM-F12培养基(Gibco公司),优级胎牛血清(杭州四季青有限公司) ，蛋白酶(Sigma公司),倒置显微镜(Nikon公司)，细胞培养箱(Sanyo公司)。实验动物为雄性SD大鼠, 3周龄, 100～150 g, 清洁级(徐州医学院实验动物中心提供)。FITC 标记CD45、CD90抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.2.1 MSC的分离纯化及培养 将大鼠脱臼处死后用碘伏浸泡5 min,无菌条件下分离出大鼠股骨和胫骨,离体的骨骼放入灭菌PBS缓冲液中冲洗。剪去干骺端, 暴露骨髓腔,无菌注射器抽取未添加肝素的含10% FBS、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM-F12培养基反复冲洗骨髓腔,直至腔内所有骨髓血冲净。接种于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基, 置于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。3天首次换液, 以后每3天换液1次, 7～14天细胞生长融合达80%以上,以0.25%胰蛋白酶消化后按1∶3 的比例传代培养。倒置显微镜下逐日观察细胞形态。
1.2.2 MSC生长曲线的测定 原代培养细胞达80%以上融合后,D-Hank 液冲洗,胰酶消化传代,并标记为P1。取生长状态良好的第3代细胞,胰酶消化后,按1×107/L接种于96孔培养板中,每孔培养液为100 μ每24 h取上述各代细胞各3孔,MTT比色法测各孔光密度值(D490值) ,连续测8天,以时间为横坐标、l。D490值为纵坐标绘制各代细胞的生长曲线。具体操作:测定前每孔加入MTT 溶液20 μl,37℃孵育4 h,尽量吸掉上清液, 每孔加入150 μl DMSO,室温振荡10 min,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的D490值,求其平均值。以时间为横坐标、光密度(D)为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.2.3 MSC细胞表面分子鉴定 取P3代生长良好的MSC,以0.25%胰酶消化细胞,按1×109/L重悬细胞,
重悬细胞并分2管,分别加入100 μl CD45、避光孵育30 min。PBS洗涤1次，CD90，1000 r/min离心5 min
沉淀细胞,倒去上清液，加500 μl PBS进行流式细胞术(FCM)分析。
2 结果
2.1 MSC的分离培养、扩增结果 将分离的未离心的MSC悬液直接接种培养24 h后,发现培养瓶内有大量悬浮细胞,主要为圆形红细胞。72 h行首次半量换液后仍不易观察MSC的贴壁情况,将首次换液的吸出液在新培养瓶内加培养液继续培养,均经过2～3次换液后,漂浮的不贴壁细胞大部分随换液除去,可见较多的贴壁细胞, 散在生长,分布不均,少部分呈集落状或单个细胞存在,胞体呈长梭形,两端有长突起,胞质内颗粒较多,折光性差,核不清楚。贴壁细胞前1～2天生长缓慢,约3天后明显增殖,细胞形态更加清晰,核明显可见,并有1～2个核仁（图1A）。在第7天时,形成明显克隆，在10～14天时,血细胞随换液全部清除,贴壁细胞形态比较一致,已基本贴满培养孔板底部,呈漩涡状或辐射状排列,细胞变得扁平,胞体狭长,核呈椭圆形（图1B）,进行第1次传代培养。传3代后培养的MSC(图1C) 形态上更加趋于一致,为成纤维细胞样,无原代存有的圆形或类圆形细胞,增殖速度较原代细胞快,形态无明显变化,每隔3天换液1次,5～7天传代1次。部分细胞传代10次后, 就变得宽大扁平，增殖速度减慢。
图1 MSC的形态学特点（倒置相差显微镜,×100）（略）
A. 原代3天MSC贴壁生长;B. 原代14天MSC长满瓶底90%以上;C.第3代MSC
2.2 大鼠骨髓MSC生长规律 MSC传代7代以前增殖速度较快,传代细胞一般7天左右能达到80%以上融合。细胞传代后1～2天为滞留期,3天后达对数生长期,第6天进入平台期。MSC体外培养生长曲线见图2。
图2 MSC 体外培养生长曲线（略）
2.3 MSC细胞表面分子鉴定 P3代大鼠骨髓MSC培养6天，经FCM检测,CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。
3 讨论
MSC广泛分布于人体各种器官和组织,但最易得到、最富集和研究最多的是来源于骨髓的MSC［3］。20世纪70年代中期，Friedenstein［4］将整个骨髓放置于塑料培养皿中，去除非贴壁细胞后可以观察到贴壁细胞呈梭形并形成2个或4个细胞的小灶，经传代及培养后能分化成类似于骨和软骨的集落。1997年，Prockop［5］更成功地分离出MSC，发现其具有多种分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和胶质细胞。由于骨髓中MSC数量少，平均每10万个有核细胞中仅含有1个MSC［6］，并且随着年龄的增长，其数量逐渐减少［7］；而且体外培养条件下,仅有少数MSC能够活跃地复制。因此,建立体外分离、纯化和大量扩增骨髓MSC 的方法,观察MSC表面分子表达,探索保持其增殖潜能与多向分化潜能的适宜培养条件,是进一步开展MSC应用研究的重要实验基础。有研究发现幼年大鼠骨髓中的MSC多于老年大鼠, 随着年龄的增加, 成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）测定显示骨髓克隆形成细胞的数量逐渐递减。动物体重对骨髓的MSC分离也有影响。体重＞250 g的大鼠骨髓中含有较多的脂肪细胞, 密度梯度离心后, 在白膜层形成颗粒状聚集物, 影响分离效果。体重＜150 g的大鼠骨骼细小, 分离所得的细胞数少。结合大鼠周龄和体重两方面的因素, 故我们的实验取3周龄、120 g左右的大鼠能在细胞分离的质和量上达到较佳效果。由于MSC体外扩增培养受不同种类、不同批次和不同浓度血清以及接种密度等因素的影响较大［8］,本研究选用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基,可以满足体外培养下MSC快速生长的要求,从P1代细胞开始,MSC增殖速率明显提高,对数生长期细胞群体倍增时间仅为20 h左右。目前从骨髓中分离MSC的方案主要有:密度梯度离心法、贴壁筛选法［9-10］、FCM离法和免疫磁珠法。通常是采用Percoll或Ficoll密度梯度离心法分离MSC, 使用该法分离的细胞虽然纯度较高, 但常影响细胞的增殖活力且操作较繁琐。FCM分离法是根据不同细胞具有不同的表面标志的特点,以荧光抗体与细胞表面标志结合,然后用FCM进行分选。该方法的优点是分离迅速、纯度高,但仪器昂贵,费用较高,含量太低的痕量细胞难以分离,要获得无菌的细胞制剂比较麻烦,而且不能处理大量的样品。免疫磁珠分选法是根据磁珠既可结合蛋白质又可被磁铁所吸附的原理，经过一定处理将抗体或抗原结合在磁珠上,使之成为抗体或抗原的载体,磁珠上抗体或抗原与特异性抗原或抗体结合后,形成抗原-抗体磁珠免疫复合物,这种复合物在磁力作用下,发生力学移动,使复合物与其他物质分离,从而达到分离特异性抗原或抗体的目的。该方法的优点是避免了免疫毒素和补体裂解带来的非特异性杀伤作用并可以处理大量的细胞样品,因此在临床和基础研究中具有很诱人的应用前景,但价格昂贵、操作复杂。因此我们仅选用贴壁筛选法分离。此法是根据MSC对底物的黏附特性而造血细胞系悬浮生长的特性将其分离, 可能混有巨噬细胞等引起纯度不足, 但由于骨髓冲出液中存在着滋养细胞和某些细胞因子, 起到了支持MSC体外扩增的作用, 从而有助于细胞的存活和功能维持。通过每次换液弃除造血细胞, 传代时严格控制胰酶的量和消化时间, 利用MSC较易脱落的特点, 保证其在短时间内与培养瓶底分开, 巨噬细胞等则因贴壁性强仍贴附于培养瓶底, 从而使MSC得到纯化。另外, 我们将原代细胞培养72 h的首次半量换液吸出液在新培养瓶内继续培养, 同样经过2～3次换液将大部分不贴壁细胞除去后, 仍有较多的贴壁细胞, 其生长性状及免疫细胞组织化学染色均无区别, 说明原代MSC 72 h仍有不贴壁的,与文献报道不完全一致［10］，为掌握分离培养MSC的时间提供了新的思路。同时我们运用该法获得的MSC增殖能力强, 其体外生长特性也与文献报道［9-10］一致。
生长曲线可分潜伏适应期、对数生长期和平台期,这些时期每个细胞系都有其特性, 生长曲线的测定对于设计常规传代以及实验方法非常重要, 从生长曲线的形状也可获得培养物繁殖潜力的信息。实验发现骨髓MSC的生长性状基本稳定,细胞为均一的成纤维细胞样,潜伏适应期在第1～2天(约24 h),对数生长期为第3～5天(约72 h) ,以后进入平台期。在对数生长期,群体倍增时间为34 h,传代周期约6天,每传代1次细胞增加约2.2倍。有人统计单个MSC经20次扩增, 细胞数可达80～150万［11］,说明MSC适应能力强,增殖速度快,体外扩增容易,有巨大的扩增潜能。另外,从理论上讲,在体外设法诱导或用外源目的基因导入等技术,
可使细胞进行对称性有丝分裂,从而无限扩增而不分化。因此,MSC可作为组织工程的种子细胞、细胞治疗和基因治疗的载体, 用于疾病和损伤的治疗。
对于MSC的鉴定目前尚无特异性的标记物［12］,研究证明分离纯化的骨髓MSC能表达多能MSC的特异性标志物CD68、CD44、CD77、CD90,而不表达CD34、CD45等造血干细胞的特异性标志物。FCM测定发现,细胞贴壁附着后均一表达SH2、 SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124 等多种表面蛋白［13］。本实验采用FCM技术，结果培养的细胞稳定表达CD90,而CD45阴性,说明本实验培养的细胞既非造血干细胞,也非成纤维细胞。目前,国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出了鉴定人来源MSC的3条最低标准［14］②通过FCM:①在标准培养条件下,MSC必须具备对塑料底物的贴附性；检测,MSC群体表达CD105、CD73及CD90阳性率≥95%,而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR 阳性率≤2%；③经体外诱导,MSC必须能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。该标准特别指出,对于动物来源的MSC ,除第2条标准不具有普遍意义的适用性外,第1条、第3条描述的生物学特征同样适用于动物来源的MSC。作为借鉴,本研究在证明了体外分离的大鼠骨髓MSC对塑料器皿的贴附特性以及细胞表面分子的初步鉴定之后,因时间、精力限制未做体外诱导试验。因此, 贴壁培养法分离培养的大鼠骨髓细胞具有MSC的一般生物学特性,所获得的细胞形态均一、增殖速度快、生长性状稳定，且具有操作简便、快速、实用、对细胞活性影响小、成本低等优点,为其作为组织工程种子细胞提供了实验基础。
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