微生物基础知识
第一节 基础微生物学 一、微生物概述
病毒界————-病毒
酵母菌 霉菌 -藻类
原生动物 动物界
植物界
微生物是一群形体微小，结构简单，肉眼看不到，只能借助光学显微镜或电子显微镜放大数100或数1000倍甚至数万倍才能看到的微小生物。
（二）按其大小、结构、化学组成分为三大类： 1、真核细胞型微生物（真核）：真菌（酵母菌、霉菌、担子菌）、藻类、原生虫 2、原核细胞型微生物（拟核）：细菌类（细菌、螺旋体防线菌、立克次氏体、衣原体、支原体等）、蓝细菌 3、非细胞型微生物：病毒根据活的细胞不同分为植物病毒、动物病毒、噬菌体（寄生在放线菌体内） 孢子的形成 活菌
核细胞聚集（在恶劣生长条件下） 核周围有一层厚臂形成（孢子） 细胞分解，孢子释出 孢子释出
适宜生长条件下，孢子的膜胀破，新细胞形成。
杀灭芽孢条件：121℃ 、20分钟 160℃ 、2小时
判断灭菌是否彻底，一般以芽孢是否被杀灭作为标准。 （3）微生物生长与繁殖
•大多数微生物个体很小，并且繁殖速度很快。
•大肠杆菌在适宜情况下每二十分钟分裂一次，如果按这个速度繁殖，6.5小时后就可达到上百万个微生物。 大肠杆菌的个体繁殖: 时间 (分钟) 世代 微生物数
0 0 20=1 20 1 21=2 40 2 22=4 60 3 23=8 : : :
400 20 220=1,048,576 : : :
1440 72 272=4.72*1021 生长周期
生长曲线: 代表细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。 滞留适应期（延迟期） 对数生长期
稳定期（最高生长期） 衰亡期
2、酵母菌
酵母菌的菌体为单细胞，通常为卵原形，也有的酵母为球形、柠檬形、香肠形及菌丝状，菌体无鞭毛，不能游动。酵母菌比细菌的细胞个体要大的多，有的能形成假菌丝。
酵母菌属于真核生物，具有有性繁殖和无性繁殖。无性繁殖以芽殖或裂殖为主（其中芽殖是酵母菌最主要的无性繁殖方式），有性繁殖的方式是产生子囊孢子。 3、霉菌
在培养基上生长的看到绒状，絮状蜘蛛网状的菌丝体。一部分菌丝生长在基质中吸收养分，成为基内菌丝或营养菌丝，另一部分向空中生长，成为气生菌丝。
霉菌的菌丝有两种类型：有隔菌丝（菌丝中有隔膜）和无隔菌丝（菌丝中无隔膜）。 霉菌的繁殖方式以产生孢子的形态繁殖分为有性孢子和无性孢子（为主）。 二、影响微生物的生长条件 （一）水分
水分活性，Aw：Water Activity, 即水溶液中能够自由运动的水分子的比例；指相同温度下纯水蒸汽压与食品中水的蒸汽压的比率，可以通过对食品体系中的有效含水量来测定。 1、Aw＜0.9，大部分细菌生长受到抑制 2、不同种类微生物对干燥的抵抗力不同：
革兰氏阳性菌抵抗力大于阴性菌，球菌大于杆菌，霉菌、酵母菌的孢子和具有芽孢的细菌抵抗力强 3、不同环境对干燥的抵抗力不同：糖、淀粉、蛋白质等物质存在时，抵抗力强。温度越低，抵抗力强。
（二）温度影响微生物生命活动的重要因素之一 种类 最低 最佳 最高 嗜热菌 40—45 55—75 60—90 嗜温菌 5—15 30—45 35—47
嗜冷菌 -5—5 12—15 15—20 低温菌 -5—5 25—30 30—35 （三）酸碱度
1、大部分细菌在PH=5-8生长良好，霉菌、酵母菌在PH=2-6生长良好。 2、PH小于2时，任何微生物都不能生长。 3、致病菌不能在PH低于4.5的条件下生长。 芽孢不能在PH低于4.5的条件下生长。 （四）气体
1、需氧菌：仅在有氧的环境中生长，如霉菌。 2、厌氧菌：仅在无氧的环境中生长。
3、兼性厌氧菌：在有氧和无氧的环境中均能生长。如有些芽孢、酵母菌。 （五）营养元素
碳、氢、氧、氮、硫、磷、矿物质。 三、培养基 1、定义
根据微生物对营养物质需要，经过人工配制适合微生物生长繁殖和积累代谢产物的营养基质。（为微生物生长繁殖提供必要营养物质的物质） 2、微生物的营养需要 ⑴水
⑵碳素营养 ⑶氮素营养 ⑷矿物质
⑸生长因子：微生物生长不可缺少的微量的有机营养物质。大概分三类：氨基酸、纤维素、碱基； 4、配制培养基时注意事项
⑴选择合适的培养基，试剂，药品纯净，称量准确。 ⑵加热过程中，注意补液 ⑶调PH值
⑷培养基需透明，无沉淀
⑸容器洁净,忌用铁、铜质器皿
⑹分装培养基勿沾污试管口，三角瓶口，以防污染杂菌 ⑺制作平板时，45-50OC倾注平板
⑻选合适的灭菌温度和时间（注意排冷空气） 121OC/15-30min（耐热）
115OC/20min（葡萄糖及其他不耐热成分） ⑼某些成分，如血清、AA、酶等，滤菌器除菌 ⑽无菌检查
⑾保存：4-8OC冰箱，避光 基础培养基，2周 生化培养基，1周
选择性分离鉴别培养基，最好现配现用。 四．接种、分离纯化和培养技术
（一）接种
将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法
在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３）
图３－３ 接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种：
１）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ２、无菌操作
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。 实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。
空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。（图３－４）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。
图３－４ 斜面接种时的无菌操作
(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞 （二）分离纯化
含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。 １、倾注平板法
首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。（图３－５，
a）
图３－５ 倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解 1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水 ２、涂布平板法
首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。（图３－５，b） ３、平板划线法
最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图３－６）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。（图３－７）
图３－６ 平板划线分离法
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 （三）培养
微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。
１、影响微生物生长的因素：微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到外界许多因素的影响。影响微生物生长的因素很多，简要介绍如下。 1) 营养物浓度 2）温度
在一定的温度范围内，每种微生物都有自已的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。超过最低生长温度，微生物不会生长，温度太低，甚至会死亡。超过最高生长温度，微生物也要停止生长，温度过高。也会死亡。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的。但也常受其它环境条件的影响而发生变化。
根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型： a.嗜冷微生物：其是适生长温度多数在-10℃－20℃之间 b.中温微生物：其最适生长温度一般在20℃－45℃之间 c.嗜热微生物：生长温度在45℃以上。 3）水分
水分是微生物进行生长的必要条件。芽孢、孢子萌发，首先需要水分。微生物是不能脱离水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生长，而不能生活在纯水中。各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内，均具有狭小的适当的水分活性区域。
4）氧气：按照微生物对氧气的需要情况，可将它们分为以下五个类型。 a.需氧微生物
这类微生物需要氧气供呼吸之用。没有氧气，便不能生长，但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长。绝大多数微生物都属于这个类型。 b.兼性需氧微生物
这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下，都能生长，只不过所进行的代谢途径不同罢了。在无氧气存在的条件下，它进行发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵。 c.微量需氧微生物
这类菌是需要氧气的，但只在0.2大气压下生长最好。这可能是由一它们含有在强氧化条件下失活的酶，因而只有在低压下作用。 d.耐氧微生物
这类微生物在生长过程中，不需要氧气，但也不怕氧气存在，不会被氧气所杀死。 c.厌氧微生物
这类微生物在生长过程中，不需要分子氧。分子氧存在对它们生长产生毒害，不是被抑制，就是被杀死。 ２、培养方法
1）根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。
好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。 厌氧培养：也称“厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：
a.降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。
b.化合去氧：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。 c.隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。
d.替代驱氧 用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。
２）根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。
固质培养：是将菌种接至疏松而富有营养的固体培养基中，在合适的条件下进行微生物培养的方法。 液体培养：在实验中，通过液体培养可以使微生物迅速繁殖，获得大量的培养物，在一定条件下，还是微生物选择增菌的有效方法。 五、灭菌和消毒 （一）概念
1、灭菌：杀死物体中所有的微生物包括病源及非病源微生物的方法(包括芽孢和繁殖体)。 2、消毒：（用物理或化学方法）杀死物体中病原微生物的方法。 3、防腐：阻止或抑制微生物生长繁殖的方式。
商业无菌：罐头食品经过适度的热杀菌以后不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病微生物，这种状态称为商业无菌。
(商业无菌必须符合以下条件：不含有致病微生物、不含微生物毒素、在正常的仓储、运输条件下微生物不繁殖。)
无菌：不含有活的微生物。
6、无菌操作：防止微生物进入机体或物体的方法。 （二）物理因素 1、温度：高温之所以能引起微生物死亡，主要是由于高温使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，
湿热灭菌法比干热灭菌法好：
（1）湿热灭菌时菌体蛋白质由于吸收水分较易凝固。 （2）湿热的穿透力比干热大。
（3）湿热灭菌时蒸汽与物体接触，凝结成水。放出潜热，提高物体温度。 2、紫外线：非电离辐射、穿透力弱
（1）灭菌机制：菌体中核酸吸收紫外线照射后，由于产生光化学作用而损坏核酸中DNA，导致微生物变异致死。
（2）作用范围：不能穿过普通玻璃，杀菌作用仅局限于物体表层，一般用于空气消毒、表面消毒。 3、过滤：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。 （1）原理：通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，把各种微生物菌体留在筛子上面，达到除菌的目的。 （2）适用范围：适用于一些对热不稳定的、体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。
（3）优缺点：最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。缺点是比细菌还小的病毒仍然留在液体培养基内。
（三）化学因素 1、消毒防腐剂 （1）作用原理：
使病原微生物蛋白质变性或凝固，发生沉淀。 破坏菌体的酶系统，影响病原体的代谢。
降低微生物表面张力，能破坏细胞膜的通透性，使细胞发生破裂或溶解。
2、化学治疗剂：能直接干扰病原微生物的生长繁殖，用于治疗感染性疾病的化学药物。
微生物基础知识
第一节 基础微生物学 一、微生物概述
病毒界————-病毒
酵母菌 霉菌 -藻类
原生动物 动物界
植物界
微生物是一群形体微小，结构简单，肉眼看不到，只能借助光学显微镜或电子显微镜放大数100或数1000倍甚至数万倍才能看到的微小生物。
（二）按其大小、结构、化学组成分为三大类： 1、真核细胞型微生物（真核）：真菌（酵母菌、霉菌、担子菌）、藻类、原生虫 2、原核细胞型微生物（拟核）：细菌类（细菌、螺旋体防线菌、立克次氏体、衣原体、支原体等）、蓝细菌 3、非细胞型微生物：病毒根据活的细胞不同分为植物病毒、动物病毒、噬菌体（寄生在放线菌体内） 孢子的形成 活菌
核细胞聚集（在恶劣生长条件下） 核周围有一层厚臂形成（孢子） 细胞分解，孢子释出 孢子释出
适宜生长条件下，孢子的膜胀破，新细胞形成。
杀灭芽孢条件：121℃ 、20分钟 160℃ 、2小时
判断灭菌是否彻底，一般以芽孢是否被杀灭作为标准。 （3）微生物生长与繁殖
•大多数微生物个体很小，并且繁殖速度很快。
•大肠杆菌在适宜情况下每二十分钟分裂一次，如果按这个速度繁殖，6.5小时后就可达到上百万个微生物。 大肠杆菌的个体繁殖: 时间 (分钟) 世代 微生物数
0 0 20=1 20 1 21=2 40 2 22=4 60 3 23=8 : : :
400 20 220=1,048,576 : : :
1440 72 272=4.72*1021 生长周期
生长曲线: 代表细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。 滞留适应期（延迟期） 对数生长期
稳定期（最高生长期） 衰亡期
2、酵母菌
酵母菌的菌体为单细胞，通常为卵原形，也有的酵母为球形、柠檬形、香肠形及菌丝状，菌体无鞭毛，不能游动。酵母菌比细菌的细胞个体要大的多，有的能形成假菌丝。
酵母菌属于真核生物，具有有性繁殖和无性繁殖。无性繁殖以芽殖或裂殖为主（其中芽殖是酵母菌最主要的无性繁殖方式），有性繁殖的方式是产生子囊孢子。 3、霉菌
在培养基上生长的看到绒状，絮状蜘蛛网状的菌丝体。一部分菌丝生长在基质中吸收养分，成为基内菌丝或营养菌丝，另一部分向空中生长，成为气生菌丝。
霉菌的菌丝有两种类型：有隔菌丝（菌丝中有隔膜）和无隔菌丝（菌丝中无隔膜）。 霉菌的繁殖方式以产生孢子的形态繁殖分为有性孢子和无性孢子（为主）。 二、影响微生物的生长条件 （一）水分
水分活性，Aw：Water Activity, 即水溶液中能够自由运动的水分子的比例；指相同温度下纯水蒸汽压与食品中水的蒸汽压的比率，可以通过对食品体系中的有效含水量来测定。 1、Aw＜0.9，大部分细菌生长受到抑制 2、不同种类微生物对干燥的抵抗力不同：
革兰氏阳性菌抵抗力大于阴性菌，球菌大于杆菌，霉菌、酵母菌的孢子和具有芽孢的细菌抵抗力强 3、不同环境对干燥的抵抗力不同：糖、淀粉、蛋白质等物质存在时，抵抗力强。温度越低，抵抗力强。
（二）温度影响微生物生命活动的重要因素之一 种类 最低 最佳 最高 嗜热菌 40—45 55—75 60—90 嗜温菌 5—15 30—45 35—47
嗜冷菌 -5—5 12—15 15—20 低温菌 -5—5 25—30 30—35 （三）酸碱度
1、大部分细菌在PH=5-8生长良好，霉菌、酵母菌在PH=2-6生长良好。 2、PH小于2时，任何微生物都不能生长。 3、致病菌不能在PH低于4.5的条件下生长。 芽孢不能在PH低于4.5的条件下生长。 （四）气体
1、需氧菌：仅在有氧的环境中生长，如霉菌。 2、厌氧菌：仅在无氧的环境中生长。
3、兼性厌氧菌：在有氧和无氧的环境中均能生长。如有些芽孢、酵母菌。 （五）营养元素
碳、氢、氧、氮、硫、磷、矿物质。 三、培养基 1、定义
根据微生物对营养物质需要，经过人工配制适合微生物生长繁殖和积累代谢产物的营养基质。（为微生物生长繁殖提供必要营养物质的物质） 2、微生物的营养需要 ⑴水
⑵碳素营养 ⑶氮素营养 ⑷矿物质
⑸生长因子：微生物生长不可缺少的微量的有机营养物质。大概分三类：氨基酸、纤维素、碱基； 4、配制培养基时注意事项
⑴选择合适的培养基，试剂，药品纯净，称量准确。 ⑵加热过程中，注意补液 ⑶调PH值
⑷培养基需透明，无沉淀
⑸容器洁净,忌用铁、铜质器皿
⑹分装培养基勿沾污试管口，三角瓶口，以防污染杂菌 ⑺制作平板时，45-50OC倾注平板
⑻选合适的灭菌温度和时间（注意排冷空气） 121OC/15-30min（耐热）
115OC/20min（葡萄糖及其他不耐热成分） ⑼某些成分，如血清、AA、酶等，滤菌器除菌 ⑽无菌检查
⑾保存：4-8OC冰箱，避光 基础培养基，2周 生化培养基，1周
选择性分离鉴别培养基，最好现配现用。 四．接种、分离纯化和培养技术
（一）接种
将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法
在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３）
图３－３ 接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种：
１）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ２、无菌操作
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。 实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。
空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。（图３－４）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。
图３－４ 斜面接种时的无菌操作
(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞 （二）分离纯化
含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。 １、倾注平板法
首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。（图３－５，
a）
图３－５ 倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解 1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水 ２、涂布平板法
首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。（图３－５，b） ３、平板划线法
最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图３－６）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。（图３－７）
图３－６ 平板划线分离法
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 （三）培养
微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。
１、影响微生物生长的因素：微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到外界许多因素的影响。影响微生物生长的因素很多，简要介绍如下。 1) 营养物浓度 2）温度
在一定的温度范围内，每种微生物都有自已的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。超过最低生长温度，微生物不会生长，温度太低，甚至会死亡。超过最高生长温度，微生物也要停止生长，温度过高。也会死亡。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的。但也常受其它环境条件的影响而发生变化。
根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型： a.嗜冷微生物：其是适生长温度多数在-10℃－20℃之间 b.中温微生物：其最适生长温度一般在20℃－45℃之间 c.嗜热微生物：生长温度在45℃以上。 3）水分
水分是微生物进行生长的必要条件。芽孢、孢子萌发，首先需要水分。微生物是不能脱离水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生长，而不能生活在纯水中。各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内，均具有狭小的适当的水分活性区域。
4）氧气：按照微生物对氧气的需要情况，可将它们分为以下五个类型。 a.需氧微生物
这类微生物需要氧气供呼吸之用。没有氧气，便不能生长，但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长。绝大多数微生物都属于这个类型。 b.兼性需氧微生物
这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下，都能生长，只不过所进行的代谢途径不同罢了。在无氧气存在的条件下，它进行发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵。 c.微量需氧微生物
这类菌是需要氧气的，但只在0.2大气压下生长最好。这可能是由一它们含有在强氧化条件下失活的酶，因而只有在低压下作用。 d.耐氧微生物
这类微生物在生长过程中，不需要氧气，但也不怕氧气存在，不会被氧气所杀死。 c.厌氧微生物
这类微生物在生长过程中，不需要分子氧。分子氧存在对它们生长产生毒害，不是被抑制，就是被杀死。 ２、培养方法
1）根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。
好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。 厌氧培养：也称“厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：
a.降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。
b.化合去氧：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。 c.隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。
d.替代驱氧 用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。
２）根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。
固质培养：是将菌种接至疏松而富有营养的固体培养基中，在合适的条件下进行微生物培养的方法。 液体培养：在实验中，通过液体培养可以使微生物迅速繁殖，获得大量的培养物，在一定条件下，还是微生物选择增菌的有效方法。 五、灭菌和消毒 （一）概念
1、灭菌：杀死物体中所有的微生物包括病源及非病源微生物的方法(包括芽孢和繁殖体)。 2、消毒：（用物理或化学方法）杀死物体中病原微生物的方法。 3、防腐：阻止或抑制微生物生长繁殖的方式。
商业无菌：罐头食品经过适度的热杀菌以后不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病微生物，这种状态称为商业无菌。
(商业无菌必须符合以下条件：不含有致病微生物、不含微生物毒素、在正常的仓储、运输条件下微生物不繁殖。)
无菌：不含有活的微生物。
6、无菌操作：防止微生物进入机体或物体的方法。 （二）物理因素 1、温度：高温之所以能引起微生物死亡，主要是由于高温使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，
湿热灭菌法比干热灭菌法好：
（1）湿热灭菌时菌体蛋白质由于吸收水分较易凝固。 （2）湿热的穿透力比干热大。
（3）湿热灭菌时蒸汽与物体接触，凝结成水。放出潜热，提高物体温度。 2、紫外线：非电离辐射、穿透力弱
（1）灭菌机制：菌体中核酸吸收紫外线照射后，由于产生光化学作用而损坏核酸中DNA，导致微生物变异致死。
（2）作用范围：不能穿过普通玻璃，杀菌作用仅局限于物体表层，一般用于空气消毒、表面消毒。 3、过滤：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。 （1）原理：通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，把各种微生物菌体留在筛子上面，达到除菌的目的。 （2）适用范围：适用于一些对热不稳定的、体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。
（3）优缺点：最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。缺点是比细菌还小的病毒仍然留在液体培养基内。
（三）化学因素 1、消毒防腐剂 （1）作用原理：
使病原微生物蛋白质变性或凝固，发生沉淀。 破坏菌体的酶系统，影响病原体的代谢。
降低微生物表面张力，能破坏细胞膜的通透性，使细胞发生破裂或溶解。
2、化学治疗剂：能直接干扰病原微生物的生长繁殖，用于治疗感染性疾病的化学药物。