实验一 根系活性的测定
1．原理：植物的根系能氧化吸附在根表面的α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-奈胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色。根对α-萘胺氧化能力与其呼吸强度有密切关系，日本人相见、松中等人认为α-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力愈强，对α-萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可以根据染色深浅定性的判断根的活力。 α-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，可供比色测定α-奈胺含量。
2.药品：
（1） 40ppm（ug/ml）α-萘胺溶液：精确称取0.10g分析纯α-萘胺，先用2ml95%酒精溶
解，加约50ml蒸馏水移入100ml容量瓶中，然后稀释至刻度，保存于棕色瓶中，置于低温暗处保存。用前稀释25倍（40ml稀释至1000ml）即为40ppm溶液。
（2） １％对氨基苯磺酸溶液：称1ｇ对氨基苯磺酸溶于100ml30%乙酸（醋酸）中。 （3） 100ppm亚硝酸钠溶液：称0.10g亚硝酸钠溶于1000ml蒸馏水中。 （4） 0.067mol/L pH7.0磷酸缓冲液
分子量 0.067mol PH7.0(1000ml磷酸缓冲液)所需量（ｇ）
Ｎa2HPO4.2H2O 178.05 7.1184g Ｎa2HPO4.12H2O 358.22 14.4004g KH2PO4 136.09 3.6292g
Ｎa2HPO4.2H2O 7.1184g (或Ｎa2HPO4.12H2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g定容到1000ml容量瓶中。
3.方法与步骤：
(1) α-萘胺标准曲线的绘制：用40ppmα-萘胺溶液配制成0、5、10、20、30、40ppm
各浓度α-萘胺的配制：用40ppm溶液配制
混匀，置室温（20~25度）下５分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为25ml,
摇匀，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，以对照光密度为０，读取光密度，以α-萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。
(2) 将待测根系吸净吸干附着水称取1g放入100ml三角瓶中，加40ppm的α-萘胺溶液和磷
酸缓冲液各25ml，混匀。
(3) 静置5-10分钟后（根吸附以完毕），从瓶中取2ml溶液放入25ml容量瓶。将其余的溶
液塞好瓶塞后，放在震荡器上，在25℃下震荡3-6小时（如无震荡器时要在反应期间，
定时的摇动），反应时间完毕后，再取2mL溶液放入另一刻度试管，因为α-萘胺溶液会自动氧化，所以要同时做无根的同样操作的空白试验（根样最好用整根；用切碎的根，α-萘胺溶液的氧化量会意外增加）。
(4) 在上述两次及空白试验所吸取的2ml测定液中，各加入10ml蒸馏水，混匀后再加入1%
对氨基苯磺酸1ml和100ppm的亚硝酸钠溶液1ml，混匀，置于室温下5分钟使之显色，然后加入蒸馏水，使整个容积为25ml，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，读取光密度，由标准曲线查出α-萘胺含量。也可以将根系烘干，以干重计算根系活力（更为准确些）。 (5) 结果计算
根系对α-萘胺的生物氧化量Y（ug.g-1.h-1）按下式进行计算 Y=[（A-B）-（C-D）]*E/（t*W） 式中：A-第一次取液测定值（ug.ml-1），作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶促反应；
B-第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如3小时）剩余的α-萘胺浓度（ug.ml-1）。
A-B即α-萘胺氧化总量；
C-第一次空白测定值（ug.ml-1）； D-第二次空白测定值；
C-D即α-萘胺自发氧化量； E-稀释倍数24（48/2）（因从48ml中又取2ml）； t-3小时；
W-样品鲜重（也可以用干重计算）；
实验二、 硝酸还原酶活性的测定 -活体法
[原理]：
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂]
1． 亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然
后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；
2． 0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离
子水溶解后定容至1 000ml；
3． 1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定
容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；
4． 0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色
瓶中；
5． 0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中； 6． 0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶
于1 000ml去离子水中；
7． 30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法]
摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
1. 2. 3.
4. 5.
2. 样品中硝酸还原酶活力测定
在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中1份作对照，另外2份作酶活性测定用。
反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。
比色测定：将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺，摇匀后再加入1ml萘基乙烯胺，再在35℃水浴中显色15min ，后比色，540nm
空白溶液：2ml蒸馏水+1ml磺胺+1mlα-萘胺。同样和样液一样进行水浴15min。
三、结果计算
x
单位鲜重样品中硝酸还原酶活性=
⨯v1
[μg/ (g .h)]
2
W⨯t
式中：为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg ；V1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml；V2为酶反应时加人的粗酶液体积，ml；W为样品鲜重，g；t为反应时间，h。
实验三 外渗电导法
方法：
1. 清洗用具：三角瓶一定要清洗干净。 2. 取样与浸泡，最好用完整叶和根，以消除伤口的影响，用天平准确称取一定量的材料（如
0.1-1.0g）对应放入已编号的三角瓶中，加入一定量的去离子水浸泡，自然浸泡2小时，可在震荡器上震荡，注意：各处理浸泡时间和测定温度要一致，一般应在室温条件下进行。
3. 测定电导率：在测定前先将各管浸泡上下搅拌或摇匀再测定电导率，为了测定相对外渗
电导值，需将测国电导率的材料，再放入沸水中煮沸10-20分钟，冷却至室温后再测一次总电导率值。
4. 电解质外渗量的表示：直接用电导率值表示
电解质渗出率（%）=浸泡液电导率值/煮沸后电导率值*100] 温度校正：X25=At[1+0.02（t-25）]
X25为校正成25℃时的电导率，At为在t℃下实测电导率值。
参考《植物生理学实验技术》张宪政 P333，辽宁科学技术出版社
实验四、植物中氮磷钾元素的测定
一、 代测液制备：
1、 硫酸—过氧化氢消煮法
试剂配制：
（1） 浓硫酸：分析纯 （2） 30%过氧化氢
测定步骤：
称取0.5000-1.000克（通过0.42mm孔径）样品置50ml小开氏瓶中，用少量水湿润样本后，加入浓硫酸5ml，摇动使硫酸与样本混合，放置半小时或过夜，在电炉上加热至瓶内硫酸开始回流（消化液呈酱红色，冒大量白烟），微沸5min，取下冷却，逐滴加入30%H2O2约0.5ml，再加热微沸5min，取下稍冷却，添加H2O2，反复操作，直至消化液完全清亮为止(最高温度不要超过350度)。添加H2O2量应每次逐渐减少。最后一次应微沸5min，以除尽剩余的H2O2。冷却后先加入10ml蒸馏水，再无损地移如100ml容量瓶中定容，摇匀备用。（注意：H2O2不能沾在开氏瓶上，以免影响磷的测定）
二、 氮的测定
用2N KCl提取：取新鲜土壤10g，放入100ml三角瓶，加入2N KCl50ml，用橡皮塞塞紧，振荡30分钟，立即过滤于50ml三角瓶中（含量第可以2.5：1） A试剂：
1） 复合液：28g NOH、5 gNa2EDTA.2H2O和50 g酒石酸钾钠溶于1L去离子水中，保存于
棕色瓶中。
2） 催化液：150 g水杨酸钠和0.3 g硝普钠溶于1L去离子水中，保存于棕色瓶中。 3） 显色液：200 g NOH和250 g苯酚定溶到1L，保存于棕色瓶中。 4） 混合液：催化液和显色液1：1混合，用前进行配制。
5） 次氯酸溶液：60ml5.25%次氯酸钠溶液稀释到1L，保存于棕色瓶中。 6） 氮标准液：
a：2.5mgNH4+-N/ml储备液：11.79g(NH4)2SO4定容到1L。
b：10ugNH4+-N/ml工作溶液：吸收1ml储备液，稀释到250ml。 B步骤
1） 打开分光光度计，预热30分钟。
2） 吸收1ml样品液加入10ml容量瓶或刻度试管中。
3） 吸收0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ml工作溶液加入10ml容量瓶中，铵离子的浓度分别为
0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ug/ml。若超过0.8ug/ml，就不成线形关系。 4） 加入5滴0.25%正硝基酚；
5） 用5N NOH中和。在碱性条件下，溶液显黄色； 6） 加入1ml复合液和1ml的混合液，摇匀； 7） 加入1ml次氯酸钠溶液，摇匀；
8） 稀释到10ml，室温放置60min后，在626nm 处比色； 9） 绘制工作曲线，并寻找样品氮浓度。 C 计算：
含氮率（mg/kg）=(C*Vs)/Ws
C：标准曲线上查的铵浓度（ug/ml）Vs：样品溶液总体积（mL）Ws：样本重量。
紫外分光光度法测定硝态氮
1、 试剂：
1） 氮标准储存溶液[p(N)=100mg L-1]，称取0.7218g 硝酸钾（KNO3，分析纯），溶于
水中，转人1000 mL容量瓶中，定容摇均。
2） 氮标准溶液[p(N)=10mg L-1]：将氮标准储存溶液准确稀释10倍。 2、 操作步骤：
1） 工作曲线：吸取氮标准溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL分别于
50mL的比色管中，用水定容至刻度，得到氮的标准系列溶液0mg L-1、0.2mg L-1、0.4mg L-1、0.6mg L-1、0.8mg L-1、1.0mg L-1、1.2mg L-1，测定A220和A275 。以A（A= A220- A275）为纵坐标，氮的浓度为横坐标绘制工作线。
2） 直接吸收样品溶液测定A220和A275，根据样品A值（A=A220-A275）查得测定液的
浓度。
3、 计算结果
p(N)=pV/W
p(N)：样品中总氮含量，mg kg-1
p： 从工作曲线中查得氮浓度mg L-1 V： 提取液体积，mL W： 样品重量，g
注意：1、两测定方法中，标准溶液的配制均应用提取土壤的氯化钾溶液进行配制。 2、铵态氮的测定中：2）2ml样品加入到20ml的刻度试管中。
3）吸取0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.4ml工作溶液加入20ml容量
瓶中，铵离子的浓度分别为0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ug/ml。
8）稀释到10ml，室温放置60min后，比色；
三、 植物全磷的测定（H2SO4-H2O2消煮-钒钼黄比色法）
原理：待测液中的正磷酸盐能和偏钒酸盐在酸性条件下作用形成黄色的杂聚化合物钒钼酸盐，溶液的黄色很稳定，其深浅与磷含量成正比，可以用比色法定量磷。比色时根据所用比色计的型号和溶液中磷浓度选用波长400-490nm（紫-蓝）或相应的滤光片。
试剂配制： 1． 标准曲线：（1）50ppm磷（P）标准液：准确称取经105度烘干的磷酸二氢钾（KH2PO4）
0.2197g，溶于水中，转入1000毫升的容量瓶中，加水至约400毫升，加浓硫酸5毫升，用水定容，即为50ppm标准液。测定时分别吸取此标准液0，2.5，5，7.5，10，15，20 毫升于50毫升容量瓶中按待测液测定步骤显色后，即为0，2.5，5，7.5，10，15，20ppm的系列标准液。
2． 钒钼酸铵试剂 12.5g钼酸铵[ （NH4）另将0.625g6Mo7O24。4H2O]溶于200毫升水中。
偏钒酸铵（NH4VO3）溶于150毫升沸水中，冷却后加入125毫升浓硝酸，再冷至室温。将钼酸铵溶液缓慢地注入偏矾酸铵溶液中，混匀，再用蒸馏水稀释至500毫升。 3． 6N氢氧化钠溶液 24g 氢氧化钠溶于水稀释至100毫升。
4． 2，6（或2，4）-二硝基酚指示剂 0.25g二硝基酚溶于100毫升蒸馏水中（饱和）。2，
6-二硝基酚的变色范围PH2.4（无色）-4.0(黄色)。变色点是PH3.1。 测定步骤：
吸取适量待测液（含P2O5 0.5-2毫克）20-25毫升于50毫升容量瓶中，加蒸馏水使体积约为35毫升，加2滴二硝基酚指示剂，用6N氢氧化钠和6N硝酸，中和至溶液刚成微黄色，准确加入10毫升钒钼酸铵试剂，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置15分钟后比色（450nm和1cm光径比色杯），同时作空白试验，进行比色，在标准曲线上查的各自ppm值。
结果计算：
P2O5%=[（A-B）*V/W]*取用量倍数*10
-4
式中：A-在标准曲线上查的的待测液ppm值； B-空白试验查得的ppm； V-显色时溶液体积（50毫升）； W-样重（克）
取用量倍数-待测液总体积与测定时所取体积之比； 10-4- 将ppm换算成%。 注释：
（1） 此处所用钒钼酸铵试剂是硝酸系统的，适用于采用硝酸溶液制备的待测液。如
待测液是用盐酸溶液制备的，则本实验应改用下列盐酸-钒钼酸铵试剂的配方：
四、 植物全钾的测定（H2SO4-H2O2消煮-火焰光度计法）
1 2
火焰光度法 ：吸取待测液5ml，移入25ml容量瓶中，用水定容。此溶液钾离子浓度约为10-50ppm（钾）。和钾系列标准液同时在火焰光度计上测读电流计读数。 标准曲线：称取0.1907克KCL（在110度烘2小时）溶于水中，定容至1升，即为100ppm钾标准液。吸取此标准液0、1、2.5、10、20、30ml于50ml容量瓶中，加入与待测液等体积得空白消煮液后定容。此系列标准为0、2、5、20、40、60ppm钾，在火焰光度计上测度后绘制工作曲线。 结果计算：
3
K2O%=〔查得ppmK*消化液定容体积*取用量倍数〕/W*104
4
式中：ppm-根据样品测得读数后，在工作曲线上查得的ppm；
4.1.1 、50-火焰光度计上测读时该溶液定容的体积（ml）；
4.1.2 、取用量倍数-待测液总体积（100ml）与从中分取体积（ml）之比；
4
4.1.3 、10-将ppm换算成%； 4.1.4 、W-样品重（克）。
实验五、 蔗糖、淀粉、可溶性总糖测定
0.1g干样品 (过100目筛)
10ml 80%乙醇 80℃水浴30min
冷却 残渣
2000rpm
离
心
20min
10ml 80%乙醇 80℃水浴30min 冷却
2000rpm20min 残渣
离
心
合并上清液
10ml 80%乙醇 80℃水浴30min
冷却
2000rpm离心20min 残渣
80℃烘干 冷却
吸0.9ml提取液
吸1.0ml提取液+1.0ml水
0.1ml 2N NaOH (或0.5ml提取液+1.5ml水)
沸水浴4ml 0.2%蒽酮试剂(用浓H2SO4配制)摇匀
加2ml蒸馏水
沸水浴20min，不断搅动
15min 冷却
1ml 0.1%间苯二酚
冷却
2ml 9.2N HClO4 10min不断振荡
加水6ml
2000rpm离心25min
残渣
2ml 4.6N HClO4 合并上清液 10min不断振荡 加水6ml
过滤
残渣
(方法同可溶性总糖测定)
弃去
(注意：①加蒽酮试剂时，试管置于冷水浴中；②测蔗糖用0.9ml蒸馏水 + 0.1ml 2N NaOH+1ml 0.1%间苯二酚 +3ml 10N HCl作参比；③测可溶性糖用2ml蒸馏水 +4ml蒽酮试剂作参比。）
实验六、过氧化物酶、超氧化物岐化酶SOD活性及丙二醛含量的测定
一、原理
1、过氧化物酶：在代谢中调控ZAA含量水平，免除机体内产生H2O2的毒害作用。在过氧
化氢存在下，过氧化氢酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色4-邻甲氧基苯酚。用分光光
度计测量生成物的含量。
2、SOD酶：能消除逆境生理生成的氧自由基作用。
氮基四唑在蛋氨酸和核黄素存在的条件下，照光后能发生光化还原反应而生成蓝甲，后者在560nm处有最大光吸收；超氧化物岐化酶能抑制氮基四唑的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。
3、MDA：是生物膜系统脂质过氧化产物之一，其浓度表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程
度，所以是逆境生理指标。丙二醛在酸性环境中和高温下，发生异硫代巴比妥酸反应，形成在波长532nm具有最大光吸收的有色三甲基复合物，这复合物的克分子消光系数为1.55*105cm-1（mol/L）-1，由此，可计算丙二醛的含量。
二、试剂
0.0625mol/L PH7.8磷酸缓冲液（PBS）， H2O2（PVP）聚乙烯吡咯啉酮，100mmol/L， PH 7.0PBS、20mmol/L愈创木酚（现配）、0.06mmol/L核黄素、0.205mol/l蛋氨酸.0.003mmol/l乙二胺四乙酸（EDTA）.1.125mmol/L氮蓝四唑（NBT现配）.10%三氯乙酸（TCA）[含0.3%硫代巴比妥酸（TBA）]。 三、实验步骤
1、丙二醛含量测定
取叶片1g，加入10%TCA2ml和少量的石英沙，再加8mlTCA进一步的研磨，然后在4000
转下离心，上清液为提取液 取上述上清液3ml（对照加3ml蒸馏水），加入3ml 0.6% TBA（用10%的TCA配置）溶液，混匀于沸水上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清夜测定532、600、450nm 波长下的消光度。（硫代巴比妥酸要在热水中配置，如100ml：50ml20%TCA50ml水，水沸后加TCA）
-1
MDA含量（umol.g）= MDA浓度*提取液体积/鲜重 C2（umol/L）=6.45（D532-D600）-0.56D450
2、过氧化物酶活性测定 取适量酶液（用PBS代替酶液作空白）加3ml反应混合液 （100mmol/LpH7.0PBS，20mmol/L愈创木酚），混匀，25℃温育5分钟，加20μlh2O2启动反应于470nm波长处作时间扫描，扫描曲线斜率为酶反应速率 ，以每分钟O.D.470增加0.01为一个酶活单位（n），酶活性以u/mg蛋白表示。
3、超氧化物歧化酶活性的测定 加入5倍于样品量的50mmol/L PH7.8磷酸缓冲液[0.1 mmol/L EDTA，0.3%W/V TX-100，4% W/VPVPP]研磨，在10500r/min离心20min。
在3ml反应混合液（在54ml 14.5 mmol/Ldl 甲硫氨酸中分别加入均以50 mmol/L PH7.8磷酸缓冲液配置的3umol/LEDTA,2.25mmol/LNBT，和60umol/L核黄素各2ml，各个试剂用前配置、闭光）的试管中，加入适量的SOD酶液，然后放在光下照光10min，迅速测定OD560值，以不加酶液的照光管为对照。（酶加10、20、30、40、50ul） 酶单位/样品量=反应被抑制%/[50%*3ml 反应混合液中加的样品量]
实验 气相色谱法测定乙烯含量
[实验原理] 乙烯是植物内源激素之一，以气体形式存在，可以直接用气相色谱法测定。所有植物组织都能产生乙烯，而准确测定乙烯释放量，对认识乙烯在植物逆境生理、发育生理、
开花生理学生理过程中的作用有着重要意义。气象色谱仪中的分离系统包括固定相和流动相。由于固定相和流动相对各种物质的吸附能力不同，因此各种物质的分配系数（或吸附能力）不一样，当含混合物的待测样（含乙烯的混合气）进入固定相以后，不断通以流动相（通常为H2或N2），待测物不断地再分配，最后，依照分配系数大小顺序依次被分离，并进入检测系统得到检测。检测信号的大小反映出物质含量的多少。 [实验材料]
[仪器设备及试剂]
（1） 气相色谱仪（配氢火焰离子化检测器）；
（2） 带橡皮塞的三角瓶或真空干燥器（使用前先测量体积），100ul、1ml注射器。 （3） 氮、氢及空气钢瓶。 （4） 标准乙烯。 [实验步骤]
（1） 材料处理。将试验材料称重后装入 密封容器中，置于室温（25℃）下1-2h。 （2） 测定条件。柱温为80℃，气化室温度为120℃，以氮气为载气，流速为50ml/min，
空气流速为500ml/min，氢气流速为60ml/min。
（3） 配制一定浓度的标准乙烯气体。
（4） 用注射器抽取1ml气样，测定乙烯峰高度。取标准乙烯气体，测定峰高值。 [结果计算]
气样中乙烯的浓度=样品峰高*标样的浓度（μl/L）/标准乙烯峰高 乙烯生成速率=乙烯浓度*容器体积/密封时间*样品重量[μl/（g.h）]
实验 α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的测定
[实验原理]
α-淀粉酶能将淀粉分子的α-1，4糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精及少量麦芽糖和
葡萄糖，使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末端分解2个葡萄糖单位的α-1，4糖苷键生成麦芽糖，因此可用DNS法测定溶液中还原糖的含量。 [实验材料]
发芽的水稻种子。 [仪器设备]
分光光度计，恒温水浴锅。 [实验步骤]
1， 粗酶液制备
取新鲜植物材料10g，洗净，剪碎，按1：2（m/V）比例加20ml0.1mol/LnaAc 缓
冲液（含6mmol/LcaCl2，PH5.0）及少量石英砂研磨，用一层尼龙布过滤。滤液在20000r/min。离心20min，取上清液用10mmol/LnaAc缓冲液透析。过夜后用20000r/min离心10min，取上清液定容，备用。
2.绘制β-极限糊精标准曲线
称取100mgβ-极限糊精加少量水调成糊状，倾入10ml沸蒸馏水，不断的搅入.加热，煮至透明。流水冷却后定容至10ml即每毫升含10mgβ-极限糊精。取25——200mlβ-极限糊精（0.25——2.0mg）加水定容至0.5ml，再加5.0ml0.01%I2-KI溶液于560nm处测定其光密度（OD）值。以光密度为纵坐标，β-极限糊精含量为横坐标绘制β-极限糊精标准曲线。 3. α-淀粉酶活力的测定
取0.1——0.5ml粗酶液（相当于含0.1——0.2g鲜重），加0.5mlβ-极限糊精，加10mmol/LnaAc缓冲液定容至1.0ml，摇匀后在30℃保温。隔不同时间取0.1ml反应液加5.0ml0.01%的I2-IK试剂，0.4mlH2O，摇匀后在560nm处测其光密度。按OD值查标准曲线。计算单位为：mgβ-极限糊精降解/g（鲜重）.h。
4. β-淀粉酶活力的测定
（1） 酶反应。在具塞试管中加5ml2%可溶性淀粉.1ml0.1mol/LnaAc（Ph5.0）缓
冲液.3.9mlH2O，在37℃预热5分钟，加0.1ml酶液 ，保温30分钟后煮沸10分钟。冷却后用DNS法测定还原糖。以每小时生成1mg麦芽糖所需的酶量作为1个酶活力单位。
酶活力（mg/ml）=1.9K*OD*10*（n/0.5）*0.1
式中，n为酶液稀释倍数；K为每一OD值所相当的葡萄糖量，mg；1.9为葡萄糖换算成麦芽糖的换算因子。
2.DNS法定糖。取试管加1.5mmlDNS试剂0.5ml样品，沸水浴中加热15分钟，冷却后加10.5ml水，摇匀后用分光光度计在540nm处测定其光密度。同时，用不同浓度的葡萄糖制作标准曲线，求K值。
（注：DNS试剂：称10克3，5二销基水杨酸，溶解于水中，加20克氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，水500毫升，加热溶解后加重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。加热搅拌，冷却后定容至1000毫升贮存于棕色瓶中，放置1星期后使用）。
实验 几种抗氧化剂含量的测定
抗坏血酸（ASA）含量的测定
[实验原理]
抗坏血酸（ASA）是植物细胞重要的抗氧化剂，它可还原O2及清除H2O2，还可再生维生素C。
ASA可将铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与二联吡啶反应，生成红色螯合物。在525nm波长处的光吸收与ASA含量正相关，从而可利用比色法测定ASA含量. [实验材料] 水稻叶片。 [仪器设备]
天平，离心机，恒温水浴锅，分光光度计。 [试剂药品]
① 5%三氯乙酸（TCA）溶液（W/V）：5克三氯乙酸，用蒸馏水配成100毫升溶液。 ② 150mmol/LNaH2PO4（PH7.4）溶液； ③ 10%三氯乙酸（TCA）溶液； ④ 44%H3PO4；
⑤ 4%2，2-二联吡啶； ⑥ 3%FeCl3。 [实验步骤]
1. 标准曲线的制作
称取17.613mg的ASA，溶解并定容至100ml，得到1mmol/L的标准母液，利用该标准母液分别配制浓度分别为0mmol/L，0.2mmol/L，0.3mmol/L，0.4mmol/L.0.5mmol/L，0.6mmol/L，0.7mmol/L的ASA标准液。吸取上述各标准液200μL于编好的对应的不同试管中，分别往各管中加入150mmol/LNaH2PO4200μL，H2O200μL，混合均匀。超过30s后再分别往各管中加入10%TCA溶液400μL，44%H3PO4400μL，4%2，2-二联吡啶400μL3%FeCl3200μL，混匀后在37℃水浴中保温60分钟，然后测525nm处的OD值。将测定结果以ASA浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标作标准曲线。 2. 提取
称0.5克水稻叶2分，1份用于测定干重1份用于ASA的提取。将样品剪碎加入5ml5%三氯乙酸，研磨，15000*g离心10分钟，上清液定容至5ml。 3. 测定
吸取上述制备好的样品上清夜0.2ml，分别加入150mmol/L的NaH2PO4（PH7.4）0.2ml，H2O 0.2ml，混合均匀，至少30s后，再依次分别往各管中加入10%TCA0.4ml，44%H3PO40.4ml，4%2，2-二联吡啶0.4ml和3%FeCl30.2ml，混合后在37℃水浴中保温60分钟，然后测525nm处的光吸值。根据标准曲线计算样品中的ASA含量。 [实验结果与计算]
ASA含量用μg/gFW表示。
二.还原型谷光干肽（GSH）含量的测定
[实验原理 ]
还原型谷光干肽（GSH）是植物细胞内另一种重要的抗氧化剂。它含有活性的疏基，极易被氧化。GSH可以抑制不饱和脂肪酸生物膜组分及其他敏感部位的氧化分解，防止膜脂过氧化，从而保持细胞膜系统的完整性，延缓细胞的衰老和增强植物抗逆行。 本实验利用疏基试剂DTNBGSHJ的含量 。 [实验材料] 水稻叶片。
[仪器设备] 天平，离心机，恒温水浴锅，分光光度计 ，研钵等。 [试剂药品]
① 5%三氯乙酸（TCA）溶液；
② 150mmol/LNaH2PO4（PH7.7）溶液； ③ 100mmol/LPH6.8的PBS；
④ DTNB试剂；75.3mgDTNB溶于30ml100mmol/LPH6.8PBS中。
[实验步骤]
1) GSH标准曲线的制作
a) 配置浓度分别为0mmol/L，0.02mmol/L，0.04mmol/L，0.006mmol/L0.08mmol/L，
0.10mmol/L，0.12mmol/L，的标准GSH溶液，吸取上述标准液各0.25ml分别加入150mmol/L的NaH2PO（2.60ml，混合均匀后，往各管中加入DTNB试剂0.18ml，4PH7.7）
摇匀后，30℃保温反应5分钟，测A412nm（以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白对照）。将测定结果以GSH浓度为横坐标，光密度值为纵坐标作标准曲线。
2) GSH的提取 方法同ASA的提取 3) GSH的含量的测定
a) 分别取上述的样品提取液0.25ml，各加入150mmol/LNaH2PO4（PH7.7）2.6mlDTNB
试剂0.18ml，以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白。摇匀后，于30℃反应5分钟，测定412nm波长下的光吸收值。根据标准曲线计算样品的GSH含量。
4) [实验结果及计算] GSH含量用μg/gFW表示。
实验一 根系活性的测定
1．原理：植物的根系能氧化吸附在根表面的α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-奈胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色。根对α-萘胺氧化能力与其呼吸强度有密切关系，日本人相见、松中等人认为α-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力愈强，对α-萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可以根据染色深浅定性的判断根的活力。 α-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，可供比色测定α-奈胺含量。
2.药品：
（1） 40ppm（ug/ml）α-萘胺溶液：精确称取0.10g分析纯α-萘胺，先用2ml95%酒精溶
解，加约50ml蒸馏水移入100ml容量瓶中，然后稀释至刻度，保存于棕色瓶中，置于低温暗处保存。用前稀释25倍（40ml稀释至1000ml）即为40ppm溶液。
（2） １％对氨基苯磺酸溶液：称1ｇ对氨基苯磺酸溶于100ml30%乙酸（醋酸）中。 （3） 100ppm亚硝酸钠溶液：称0.10g亚硝酸钠溶于1000ml蒸馏水中。 （4） 0.067mol/L pH7.0磷酸缓冲液
分子量 0.067mol PH7.0(1000ml磷酸缓冲液)所需量（ｇ）
Ｎa2HPO4.2H2O 178.05 7.1184g Ｎa2HPO4.12H2O 358.22 14.4004g KH2PO4 136.09 3.6292g
Ｎa2HPO4.2H2O 7.1184g (或Ｎa2HPO4.12H2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g定容到1000ml容量瓶中。
3.方法与步骤：
(1) α-萘胺标准曲线的绘制：用40ppmα-萘胺溶液配制成0、5、10、20、30、40ppm
各浓度α-萘胺的配制：用40ppm溶液配制
混匀，置室温（20~25度）下５分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为25ml,
摇匀，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，以对照光密度为０，读取光密度，以α-萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。
(2) 将待测根系吸净吸干附着水称取1g放入100ml三角瓶中，加40ppm的α-萘胺溶液和磷
酸缓冲液各25ml，混匀。
(3) 静置5-10分钟后（根吸附以完毕），从瓶中取2ml溶液放入25ml容量瓶。将其余的溶
液塞好瓶塞后，放在震荡器上，在25℃下震荡3-6小时（如无震荡器时要在反应期间，
定时的摇动），反应时间完毕后，再取2mL溶液放入另一刻度试管，因为α-萘胺溶液会自动氧化，所以要同时做无根的同样操作的空白试验（根样最好用整根；用切碎的根，α-萘胺溶液的氧化量会意外增加）。
(4) 在上述两次及空白试验所吸取的2ml测定液中，各加入10ml蒸馏水，混匀后再加入1%
对氨基苯磺酸1ml和100ppm的亚硝酸钠溶液1ml，混匀，置于室温下5分钟使之显色，然后加入蒸馏水，使整个容积为25ml，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，读取光密度，由标准曲线查出α-萘胺含量。也可以将根系烘干，以干重计算根系活力（更为准确些）。 (5) 结果计算
根系对α-萘胺的生物氧化量Y（ug.g-1.h-1）按下式进行计算 Y=[（A-B）-（C-D）]*E/（t*W） 式中：A-第一次取液测定值（ug.ml-1），作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶促反应；
B-第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如3小时）剩余的α-萘胺浓度（ug.ml-1）。
A-B即α-萘胺氧化总量；
C-第一次空白测定值（ug.ml-1）； D-第二次空白测定值；
C-D即α-萘胺自发氧化量； E-稀释倍数24（48/2）（因从48ml中又取2ml）； t-3小时；
W-样品鲜重（也可以用干重计算）；
实验二、 硝酸还原酶活性的测定 -活体法
[原理]：
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂]
1． 亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然
后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；
2． 0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离
子水溶解后定容至1 000ml；
3． 1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定
容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；
4． 0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色
瓶中；
5． 0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中； 6． 0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶
于1 000ml去离子水中；
7． 30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法]
摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
1. 2. 3.
4. 5.
2. 样品中硝酸还原酶活力测定
在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中1份作对照，另外2份作酶活性测定用。
反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。
比色测定：将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺，摇匀后再加入1ml萘基乙烯胺，再在35℃水浴中显色15min ，后比色，540nm
空白溶液：2ml蒸馏水+1ml磺胺+1mlα-萘胺。同样和样液一样进行水浴15min。
三、结果计算
x
单位鲜重样品中硝酸还原酶活性=
⨯v1
[μg/ (g .h)]
2
W⨯t
式中：为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg ；V1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml；V2为酶反应时加人的粗酶液体积，ml；W为样品鲜重，g；t为反应时间，h。
实验三 外渗电导法
方法：
1. 清洗用具：三角瓶一定要清洗干净。 2. 取样与浸泡，最好用完整叶和根，以消除伤口的影响，用天平准确称取一定量的材料（如
0.1-1.0g）对应放入已编号的三角瓶中，加入一定量的去离子水浸泡，自然浸泡2小时，可在震荡器上震荡，注意：各处理浸泡时间和测定温度要一致，一般应在室温条件下进行。
3. 测定电导率：在测定前先将各管浸泡上下搅拌或摇匀再测定电导率，为了测定相对外渗
电导值，需将测国电导率的材料，再放入沸水中煮沸10-20分钟，冷却至室温后再测一次总电导率值。
4. 电解质外渗量的表示：直接用电导率值表示
电解质渗出率（%）=浸泡液电导率值/煮沸后电导率值*100] 温度校正：X25=At[1+0.02（t-25）]
X25为校正成25℃时的电导率，At为在t℃下实测电导率值。
参考《植物生理学实验技术》张宪政 P333，辽宁科学技术出版社
实验四、植物中氮磷钾元素的测定
一、 代测液制备：
1、 硫酸—过氧化氢消煮法
试剂配制：
（1） 浓硫酸：分析纯 （2） 30%过氧化氢
测定步骤：
称取0.5000-1.000克（通过0.42mm孔径）样品置50ml小开氏瓶中，用少量水湿润样本后，加入浓硫酸5ml，摇动使硫酸与样本混合，放置半小时或过夜，在电炉上加热至瓶内硫酸开始回流（消化液呈酱红色，冒大量白烟），微沸5min，取下冷却，逐滴加入30%H2O2约0.5ml，再加热微沸5min，取下稍冷却，添加H2O2，反复操作，直至消化液完全清亮为止(最高温度不要超过350度)。添加H2O2量应每次逐渐减少。最后一次应微沸5min，以除尽剩余的H2O2。冷却后先加入10ml蒸馏水，再无损地移如100ml容量瓶中定容，摇匀备用。（注意：H2O2不能沾在开氏瓶上，以免影响磷的测定）
二、 氮的测定
用2N KCl提取：取新鲜土壤10g，放入100ml三角瓶，加入2N KCl50ml，用橡皮塞塞紧，振荡30分钟，立即过滤于50ml三角瓶中（含量第可以2.5：1） A试剂：
1） 复合液：28g NOH、5 gNa2EDTA.2H2O和50 g酒石酸钾钠溶于1L去离子水中，保存于
棕色瓶中。
2） 催化液：150 g水杨酸钠和0.3 g硝普钠溶于1L去离子水中，保存于棕色瓶中。 3） 显色液：200 g NOH和250 g苯酚定溶到1L，保存于棕色瓶中。 4） 混合液：催化液和显色液1：1混合，用前进行配制。
5） 次氯酸溶液：60ml5.25%次氯酸钠溶液稀释到1L，保存于棕色瓶中。 6） 氮标准液：
a：2.5mgNH4+-N/ml储备液：11.79g(NH4)2SO4定容到1L。
b：10ugNH4+-N/ml工作溶液：吸收1ml储备液，稀释到250ml。 B步骤
1） 打开分光光度计，预热30分钟。
2） 吸收1ml样品液加入10ml容量瓶或刻度试管中。
3） 吸收0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ml工作溶液加入10ml容量瓶中，铵离子的浓度分别为
0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ug/ml。若超过0.8ug/ml，就不成线形关系。 4） 加入5滴0.25%正硝基酚；
5） 用5N NOH中和。在碱性条件下，溶液显黄色； 6） 加入1ml复合液和1ml的混合液，摇匀； 7） 加入1ml次氯酸钠溶液，摇匀；
8） 稀释到10ml，室温放置60min后，在626nm 处比色； 9） 绘制工作曲线，并寻找样品氮浓度。 C 计算：
含氮率（mg/kg）=(C*Vs)/Ws
C：标准曲线上查的铵浓度（ug/ml）Vs：样品溶液总体积（mL）Ws：样本重量。
紫外分光光度法测定硝态氮
1、 试剂：
1） 氮标准储存溶液[p(N)=100mg L-1]，称取0.7218g 硝酸钾（KNO3，分析纯），溶于
水中，转人1000 mL容量瓶中，定容摇均。
2） 氮标准溶液[p(N)=10mg L-1]：将氮标准储存溶液准确稀释10倍。 2、 操作步骤：
1） 工作曲线：吸取氮标准溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL分别于
50mL的比色管中，用水定容至刻度，得到氮的标准系列溶液0mg L-1、0.2mg L-1、0.4mg L-1、0.6mg L-1、0.8mg L-1、1.0mg L-1、1.2mg L-1，测定A220和A275 。以A（A= A220- A275）为纵坐标，氮的浓度为横坐标绘制工作线。
2） 直接吸收样品溶液测定A220和A275，根据样品A值（A=A220-A275）查得测定液的
浓度。
3、 计算结果
p(N)=pV/W
p(N)：样品中总氮含量，mg kg-1
p： 从工作曲线中查得氮浓度mg L-1 V： 提取液体积，mL W： 样品重量，g
注意：1、两测定方法中，标准溶液的配制均应用提取土壤的氯化钾溶液进行配制。 2、铵态氮的测定中：2）2ml样品加入到20ml的刻度试管中。
3）吸取0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.4ml工作溶液加入20ml容量
瓶中，铵离子的浓度分别为0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ug/ml。
8）稀释到10ml，室温放置60min后，比色；
三、 植物全磷的测定（H2SO4-H2O2消煮-钒钼黄比色法）
原理：待测液中的正磷酸盐能和偏钒酸盐在酸性条件下作用形成黄色的杂聚化合物钒钼酸盐，溶液的黄色很稳定，其深浅与磷含量成正比，可以用比色法定量磷。比色时根据所用比色计的型号和溶液中磷浓度选用波长400-490nm（紫-蓝）或相应的滤光片。
试剂配制： 1． 标准曲线：（1）50ppm磷（P）标准液：准确称取经105度烘干的磷酸二氢钾（KH2PO4）
0.2197g，溶于水中，转入1000毫升的容量瓶中，加水至约400毫升，加浓硫酸5毫升，用水定容，即为50ppm标准液。测定时分别吸取此标准液0，2.5，5，7.5，10，15，20 毫升于50毫升容量瓶中按待测液测定步骤显色后，即为0，2.5，5，7.5，10，15，20ppm的系列标准液。
2． 钒钼酸铵试剂 12.5g钼酸铵[ （NH4）另将0.625g6Mo7O24。4H2O]溶于200毫升水中。
偏钒酸铵（NH4VO3）溶于150毫升沸水中，冷却后加入125毫升浓硝酸，再冷至室温。将钼酸铵溶液缓慢地注入偏矾酸铵溶液中，混匀，再用蒸馏水稀释至500毫升。 3． 6N氢氧化钠溶液 24g 氢氧化钠溶于水稀释至100毫升。
4． 2，6（或2，4）-二硝基酚指示剂 0.25g二硝基酚溶于100毫升蒸馏水中（饱和）。2，
6-二硝基酚的变色范围PH2.4（无色）-4.0(黄色)。变色点是PH3.1。 测定步骤：
吸取适量待测液（含P2O5 0.5-2毫克）20-25毫升于50毫升容量瓶中，加蒸馏水使体积约为35毫升，加2滴二硝基酚指示剂，用6N氢氧化钠和6N硝酸，中和至溶液刚成微黄色，准确加入10毫升钒钼酸铵试剂，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置15分钟后比色（450nm和1cm光径比色杯），同时作空白试验，进行比色，在标准曲线上查的各自ppm值。
结果计算：
P2O5%=[（A-B）*V/W]*取用量倍数*10
-4
式中：A-在标准曲线上查的的待测液ppm值； B-空白试验查得的ppm； V-显色时溶液体积（50毫升）； W-样重（克）
取用量倍数-待测液总体积与测定时所取体积之比； 10-4- 将ppm换算成%。 注释：
（1） 此处所用钒钼酸铵试剂是硝酸系统的，适用于采用硝酸溶液制备的待测液。如
待测液是用盐酸溶液制备的，则本实验应改用下列盐酸-钒钼酸铵试剂的配方：
四、 植物全钾的测定（H2SO4-H2O2消煮-火焰光度计法）
1 2
火焰光度法 ：吸取待测液5ml，移入25ml容量瓶中，用水定容。此溶液钾离子浓度约为10-50ppm（钾）。和钾系列标准液同时在火焰光度计上测读电流计读数。 标准曲线：称取0.1907克KCL（在110度烘2小时）溶于水中，定容至1升，即为100ppm钾标准液。吸取此标准液0、1、2.5、10、20、30ml于50ml容量瓶中，加入与待测液等体积得空白消煮液后定容。此系列标准为0、2、5、20、40、60ppm钾，在火焰光度计上测度后绘制工作曲线。 结果计算：
3
K2O%=〔查得ppmK*消化液定容体积*取用量倍数〕/W*104
4
式中：ppm-根据样品测得读数后，在工作曲线上查得的ppm；
4.1.1 、50-火焰光度计上测读时该溶液定容的体积（ml）；
4.1.2 、取用量倍数-待测液总体积（100ml）与从中分取体积（ml）之比；
4
4.1.3 、10-将ppm换算成%； 4.1.4 、W-样品重（克）。
实验五、 蔗糖、淀粉、可溶性总糖测定
0.1g干样品 (过100目筛)
10ml 80%乙醇 80℃水浴30min
冷却 残渣
2000rpm
离
心
20min
10ml 80%乙醇 80℃水浴30min 冷却
2000rpm20min 残渣
离
心
合并上清液
10ml 80%乙醇 80℃水浴30min
冷却
2000rpm离心20min 残渣
80℃烘干 冷却
吸0.9ml提取液
吸1.0ml提取液+1.0ml水
0.1ml 2N NaOH (或0.5ml提取液+1.5ml水)
沸水浴4ml 0.2%蒽酮试剂(用浓H2SO4配制)摇匀
加2ml蒸馏水
沸水浴20min，不断搅动
15min 冷却
1ml 0.1%间苯二酚
冷却
2ml 9.2N HClO4 10min不断振荡
加水6ml
2000rpm离心25min
残渣
2ml 4.6N HClO4 合并上清液 10min不断振荡 加水6ml
过滤
残渣
(方法同可溶性总糖测定)
弃去
(注意：①加蒽酮试剂时，试管置于冷水浴中；②测蔗糖用0.9ml蒸馏水 + 0.1ml 2N NaOH+1ml 0.1%间苯二酚 +3ml 10N HCl作参比；③测可溶性糖用2ml蒸馏水 +4ml蒽酮试剂作参比。）
实验六、过氧化物酶、超氧化物岐化酶SOD活性及丙二醛含量的测定
一、原理
1、过氧化物酶：在代谢中调控ZAA含量水平，免除机体内产生H2O2的毒害作用。在过氧
化氢存在下，过氧化氢酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色4-邻甲氧基苯酚。用分光光
度计测量生成物的含量。
2、SOD酶：能消除逆境生理生成的氧自由基作用。
氮基四唑在蛋氨酸和核黄素存在的条件下，照光后能发生光化还原反应而生成蓝甲，后者在560nm处有最大光吸收；超氧化物岐化酶能抑制氮基四唑的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。
3、MDA：是生物膜系统脂质过氧化产物之一，其浓度表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程
度，所以是逆境生理指标。丙二醛在酸性环境中和高温下，发生异硫代巴比妥酸反应，形成在波长532nm具有最大光吸收的有色三甲基复合物，这复合物的克分子消光系数为1.55*105cm-1（mol/L）-1，由此，可计算丙二醛的含量。
二、试剂
0.0625mol/L PH7.8磷酸缓冲液（PBS）， H2O2（PVP）聚乙烯吡咯啉酮，100mmol/L， PH 7.0PBS、20mmol/L愈创木酚（现配）、0.06mmol/L核黄素、0.205mol/l蛋氨酸.0.003mmol/l乙二胺四乙酸（EDTA）.1.125mmol/L氮蓝四唑（NBT现配）.10%三氯乙酸（TCA）[含0.3%硫代巴比妥酸（TBA）]。 三、实验步骤
1、丙二醛含量测定
取叶片1g，加入10%TCA2ml和少量的石英沙，再加8mlTCA进一步的研磨，然后在4000
转下离心，上清液为提取液 取上述上清液3ml（对照加3ml蒸馏水），加入3ml 0.6% TBA（用10%的TCA配置）溶液，混匀于沸水上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清夜测定532、600、450nm 波长下的消光度。（硫代巴比妥酸要在热水中配置，如100ml：50ml20%TCA50ml水，水沸后加TCA）
-1
MDA含量（umol.g）= MDA浓度*提取液体积/鲜重 C2（umol/L）=6.45（D532-D600）-0.56D450
2、过氧化物酶活性测定 取适量酶液（用PBS代替酶液作空白）加3ml反应混合液 （100mmol/LpH7.0PBS，20mmol/L愈创木酚），混匀，25℃温育5分钟，加20μlh2O2启动反应于470nm波长处作时间扫描，扫描曲线斜率为酶反应速率 ，以每分钟O.D.470增加0.01为一个酶活单位（n），酶活性以u/mg蛋白表示。
3、超氧化物歧化酶活性的测定 加入5倍于样品量的50mmol/L PH7.8磷酸缓冲液[0.1 mmol/L EDTA，0.3%W/V TX-100，4% W/VPVPP]研磨，在10500r/min离心20min。
在3ml反应混合液（在54ml 14.5 mmol/Ldl 甲硫氨酸中分别加入均以50 mmol/L PH7.8磷酸缓冲液配置的3umol/LEDTA,2.25mmol/LNBT，和60umol/L核黄素各2ml，各个试剂用前配置、闭光）的试管中，加入适量的SOD酶液，然后放在光下照光10min，迅速测定OD560值，以不加酶液的照光管为对照。（酶加10、20、30、40、50ul） 酶单位/样品量=反应被抑制%/[50%*3ml 反应混合液中加的样品量]
实验 气相色谱法测定乙烯含量
[实验原理] 乙烯是植物内源激素之一，以气体形式存在，可以直接用气相色谱法测定。所有植物组织都能产生乙烯，而准确测定乙烯释放量，对认识乙烯在植物逆境生理、发育生理、
开花生理学生理过程中的作用有着重要意义。气象色谱仪中的分离系统包括固定相和流动相。由于固定相和流动相对各种物质的吸附能力不同，因此各种物质的分配系数（或吸附能力）不一样，当含混合物的待测样（含乙烯的混合气）进入固定相以后，不断通以流动相（通常为H2或N2），待测物不断地再分配，最后，依照分配系数大小顺序依次被分离，并进入检测系统得到检测。检测信号的大小反映出物质含量的多少。 [实验材料]
[仪器设备及试剂]
（1） 气相色谱仪（配氢火焰离子化检测器）；
（2） 带橡皮塞的三角瓶或真空干燥器（使用前先测量体积），100ul、1ml注射器。 （3） 氮、氢及空气钢瓶。 （4） 标准乙烯。 [实验步骤]
（1） 材料处理。将试验材料称重后装入 密封容器中，置于室温（25℃）下1-2h。 （2） 测定条件。柱温为80℃，气化室温度为120℃，以氮气为载气，流速为50ml/min，
空气流速为500ml/min，氢气流速为60ml/min。
（3） 配制一定浓度的标准乙烯气体。
（4） 用注射器抽取1ml气样，测定乙烯峰高度。取标准乙烯气体，测定峰高值。 [结果计算]
气样中乙烯的浓度=样品峰高*标样的浓度（μl/L）/标准乙烯峰高 乙烯生成速率=乙烯浓度*容器体积/密封时间*样品重量[μl/（g.h）]
实验 α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的测定
[实验原理]
α-淀粉酶能将淀粉分子的α-1，4糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精及少量麦芽糖和
葡萄糖，使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末端分解2个葡萄糖单位的α-1，4糖苷键生成麦芽糖，因此可用DNS法测定溶液中还原糖的含量。 [实验材料]
发芽的水稻种子。 [仪器设备]
分光光度计，恒温水浴锅。 [实验步骤]
1， 粗酶液制备
取新鲜植物材料10g，洗净，剪碎，按1：2（m/V）比例加20ml0.1mol/LnaAc 缓
冲液（含6mmol/LcaCl2，PH5.0）及少量石英砂研磨，用一层尼龙布过滤。滤液在20000r/min。离心20min，取上清液用10mmol/LnaAc缓冲液透析。过夜后用20000r/min离心10min，取上清液定容，备用。
2.绘制β-极限糊精标准曲线
称取100mgβ-极限糊精加少量水调成糊状，倾入10ml沸蒸馏水，不断的搅入.加热，煮至透明。流水冷却后定容至10ml即每毫升含10mgβ-极限糊精。取25——200mlβ-极限糊精（0.25——2.0mg）加水定容至0.5ml，再加5.0ml0.01%I2-KI溶液于560nm处测定其光密度（OD）值。以光密度为纵坐标，β-极限糊精含量为横坐标绘制β-极限糊精标准曲线。 3. α-淀粉酶活力的测定
取0.1——0.5ml粗酶液（相当于含0.1——0.2g鲜重），加0.5mlβ-极限糊精，加10mmol/LnaAc缓冲液定容至1.0ml，摇匀后在30℃保温。隔不同时间取0.1ml反应液加5.0ml0.01%的I2-IK试剂，0.4mlH2O，摇匀后在560nm处测其光密度。按OD值查标准曲线。计算单位为：mgβ-极限糊精降解/g（鲜重）.h。
4. β-淀粉酶活力的测定
（1） 酶反应。在具塞试管中加5ml2%可溶性淀粉.1ml0.1mol/LnaAc（Ph5.0）缓
冲液.3.9mlH2O，在37℃预热5分钟，加0.1ml酶液 ，保温30分钟后煮沸10分钟。冷却后用DNS法测定还原糖。以每小时生成1mg麦芽糖所需的酶量作为1个酶活力单位。
酶活力（mg/ml）=1.9K*OD*10*（n/0.5）*0.1
式中，n为酶液稀释倍数；K为每一OD值所相当的葡萄糖量，mg；1.9为葡萄糖换算成麦芽糖的换算因子。
2.DNS法定糖。取试管加1.5mmlDNS试剂0.5ml样品，沸水浴中加热15分钟，冷却后加10.5ml水，摇匀后用分光光度计在540nm处测定其光密度。同时，用不同浓度的葡萄糖制作标准曲线，求K值。
（注：DNS试剂：称10克3，5二销基水杨酸，溶解于水中，加20克氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，水500毫升，加热溶解后加重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。加热搅拌，冷却后定容至1000毫升贮存于棕色瓶中，放置1星期后使用）。
实验 几种抗氧化剂含量的测定
抗坏血酸（ASA）含量的测定
[实验原理]
抗坏血酸（ASA）是植物细胞重要的抗氧化剂，它可还原O2及清除H2O2，还可再生维生素C。
ASA可将铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与二联吡啶反应，生成红色螯合物。在525nm波长处的光吸收与ASA含量正相关，从而可利用比色法测定ASA含量. [实验材料] 水稻叶片。 [仪器设备]
天平，离心机，恒温水浴锅，分光光度计。 [试剂药品]
① 5%三氯乙酸（TCA）溶液（W/V）：5克三氯乙酸，用蒸馏水配成100毫升溶液。 ② 150mmol/LNaH2PO4（PH7.4）溶液； ③ 10%三氯乙酸（TCA）溶液； ④ 44%H3PO4；
⑤ 4%2，2-二联吡啶； ⑥ 3%FeCl3。 [实验步骤]
1. 标准曲线的制作
称取17.613mg的ASA，溶解并定容至100ml，得到1mmol/L的标准母液，利用该标准母液分别配制浓度分别为0mmol/L，0.2mmol/L，0.3mmol/L，0.4mmol/L.0.5mmol/L，0.6mmol/L，0.7mmol/L的ASA标准液。吸取上述各标准液200μL于编好的对应的不同试管中，分别往各管中加入150mmol/LNaH2PO4200μL，H2O200μL，混合均匀。超过30s后再分别往各管中加入10%TCA溶液400μL，44%H3PO4400μL，4%2，2-二联吡啶400μL3%FeCl3200μL，混匀后在37℃水浴中保温60分钟，然后测525nm处的OD值。将测定结果以ASA浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标作标准曲线。 2. 提取
称0.5克水稻叶2分，1份用于测定干重1份用于ASA的提取。将样品剪碎加入5ml5%三氯乙酸，研磨，15000*g离心10分钟，上清液定容至5ml。 3. 测定
吸取上述制备好的样品上清夜0.2ml，分别加入150mmol/L的NaH2PO4（PH7.4）0.2ml，H2O 0.2ml，混合均匀，至少30s后，再依次分别往各管中加入10%TCA0.4ml，44%H3PO40.4ml，4%2，2-二联吡啶0.4ml和3%FeCl30.2ml，混合后在37℃水浴中保温60分钟，然后测525nm处的光吸值。根据标准曲线计算样品中的ASA含量。 [实验结果与计算]
ASA含量用μg/gFW表示。
二.还原型谷光干肽（GSH）含量的测定
[实验原理 ]
还原型谷光干肽（GSH）是植物细胞内另一种重要的抗氧化剂。它含有活性的疏基，极易被氧化。GSH可以抑制不饱和脂肪酸生物膜组分及其他敏感部位的氧化分解，防止膜脂过氧化，从而保持细胞膜系统的完整性，延缓细胞的衰老和增强植物抗逆行。 本实验利用疏基试剂DTNBGSHJ的含量 。 [实验材料] 水稻叶片。
[仪器设备] 天平，离心机，恒温水浴锅，分光光度计 ，研钵等。 [试剂药品]
① 5%三氯乙酸（TCA）溶液；
② 150mmol/LNaH2PO4（PH7.7）溶液； ③ 100mmol/LPH6.8的PBS；
④ DTNB试剂；75.3mgDTNB溶于30ml100mmol/LPH6.8PBS中。
[实验步骤]
1) GSH标准曲线的制作
a) 配置浓度分别为0mmol/L，0.02mmol/L，0.04mmol/L，0.006mmol/L0.08mmol/L，
0.10mmol/L，0.12mmol/L，的标准GSH溶液，吸取上述标准液各0.25ml分别加入150mmol/L的NaH2PO（2.60ml，混合均匀后，往各管中加入DTNB试剂0.18ml，4PH7.7）
摇匀后，30℃保温反应5分钟，测A412nm（以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白对照）。将测定结果以GSH浓度为横坐标，光密度值为纵坐标作标准曲线。
2) GSH的提取 方法同ASA的提取 3) GSH的含量的测定
a) 分别取上述的样品提取液0.25ml，各加入150mmol/LNaH2PO4（PH7.7）2.6mlDTNB
试剂0.18ml，以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白。摇匀后，于30℃反应5分钟，测定412nm波长下的光吸收值。根据标准曲线计算样品的GSH含量。
4) [实验结果及计算] GSH含量用μg/gFW表示。