铜锈环棱螺对微囊藻的摄食及其毒素积累研究

第21卷 第4期 2008年12月

宁波大学学报(理工版)

JOURNAL OF NINGBO UNIVERSITY ( NSEE )

Vol.21 No.4 Dec. 2008

文章编号:1001-5132(2008)04-0479-06

铜锈环棱螺对微囊藻的摄食及其毒素积累研究

潘洁慧,陆开宏*

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室,浙江 宁波 315211)

摘要:设计了2组室内实验研究铜锈环棱螺对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的摄食与毒素积累,其中摄食试验分别以铜绿微囊藻和小球藻(Chlorella vulgaris)为饵投喂不同密度铜锈环棱螺,对其清滤率CR(mL·ind-1·h-1)和滤食率FR(cells·ind-1·h-1)进行测定. 结果表明:饵料种类和实验动物密度对铜锈环棱螺的清滤率和滤食率均有显著影响. 毒素积累试验分别以单一四尾栅藻(Scenedesmus quadricanda)、50%铜绿微囊藻+50%四尾栅藻的混合藻液和单一铜绿微囊藻3种处理投喂铜锈环棱螺达15d,用ELISA法检测,得到了微囊藻毒素(MCs)在螺体内的动态变化曲线. 试验同时表明,藻毒素在铜锈环棱螺各组织中的分布有显著差异,藻毒素积累量依次为肝脏>鳃>消化道>头足部.

关键词:铜锈环棱螺;铜绿微囊藻;滤食率;藻毒素;积累 中图分类号:Q958.8

文献标识码:A

水体富营养化已成为我国乃至世界所面临的重大环境问题. 根据最近调查,欧洲、非洲、北美洲和南美洲分别有53%、28%、48%和41%的湖泊存在不同程度的富营养化现象,亚太地区54%的湖泊处于富营养化状态[1],我国则是60%[2]. 水体富营养化最重要的表症是浮游藻类特别是蓝藻的大量繁殖. 蓝藻的过度繁殖会影响水体的质量,造成水味腥臭,透明度下降,水体溶解氧下降,致使鱼类等水生生物死亡. 水华习见种铜绿微囊藻(Mi- crocystis aeruginosa)能产生肝毒性微囊藻毒素,不仅仅对水生动、植物有明显的毒害作用,而且能通过其他途径直接威胁人类健康,因而备受人们的关注[3-7].

螺类作为淡水生态系统中重要的底栖动物,一般认为其取食活动对着生藻类群落的生物组成与生产力有强烈的影响,事实上螺类的摄食与生理代谢显著影响着水层中包括颗粒悬浮物、营养盐和浮游藻类的种类和数量组成,螺类在构建水生群落结构和食物链传递中发挥着重要作用[8]. 铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)是我国最为常见的一种淡水底栖螺类,目前已有一些研究表明它能通过摄取水体营养物质,有效降低水体中氮、磷等含量,起到净化水质的作用[9,10]. 本文就铜锈环棱螺对铜绿微囊藻的摄食与毒素积累进行了试验研究,以期为探明淡水螺类调控浮游藻类、改良富营养化水体水质的生理生态机制提供基础资料.

收稿日期:2007-08-01. 宁波大学学报(理工版)网址:http://3xb.nbu.edu.cn 基金项目:浙江省自然科学基金(Z505319);宁波市自然科学基金(2006A610081). 第一作者:潘洁慧(1982-),女,浙江温州人,在读硕士研究生,主要研究方向:渔业环境保护. E-mail: [email protected] *通讯作者:陆开宏(1964-),男,浙江慈溪人,教授,主要研究方向:渔业环境保护及水域生态. E-mail: [email protected]

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1 材料和方法

1.1 材料

实验所用铜锈环棱螺采自宁波市江北区姚江流域. 螺类采回后,清除其体表附着生物及污物,于玻璃缸内暂养48h后,挑选体重1.2g左右的健康个体进行试验.

铜绿微囊藻、小球藻(Chlorella vulgaris)和四尾栅藻(Scenedesmus quadricanda)藻种由宁波大学水域生态与环境实验室提供,铜绿微囊藻采用BG11培养基[11]于三角锥形瓶内培养. 温度(25±1)℃,光照3000Lx,光暗比12h:12h. 小球藻和四尾栅藻采用“浙水院3号”培养基[12],通气大量培养,温度(25±1)℃,自然光照. 1.2 方法 1.2.1 摄食试验

采用静水实验系统,在装有400mL藻液的实验烧杯中分别放入1、2、3个铜锈环棱螺,并设2个对照组,每组3个重复,在(24±0.5)℃恒温,12h:12h光照条件下进行铜锈环棱螺对铜绿微囊藻和小球藻的摄食试验. 实验中铜绿微囊藻和小球藻液的起始浓度分别为1.384×107 cells·mL-1和7.434×106 cells·mL-1. 1.2.2 毒素积累试验

试验分3组:(1)单独投喂四尾栅藻(以下简称绿藻组);(2)投喂50%铜绿微囊藻+50%四尾栅藻的混合藻液(以下简称蓝藻+绿藻组);(3)单独投喂铜绿微囊藻(以下简称蓝藻组). 实验藻类的总浓度恒定为1×106 cells·mL-1. 每组设3个重复,共9只试验缸. 每个玻璃缸(20cm×10cm×20cm)放洗净后的螺30个,初始时,每个缸放3L试验藻液,保持每只螺负荷100mL藻液的密度. 试验进行至第1 d、3d、5d、10d、15d时,每个缸取2只螺,检测肝脏中的藻毒素含量,第10d时蓝藻组试验缸各取2个螺,取肝脏、肠、鳃、头足4部分组织,测其藻毒素在积累期间不同组织中的分布情况. 试验

期间,随着试验螺数量的减少,藻液也相应减少. 将所有的试验缸放于光照培养箱中. 温度(25±1)℃,光照3000Lx,光暗比12h:12h. 试验期间每天更换藻液,死亡的螺及时挑出. 1.2.3 藻生物量测定

分别取不同藻细胞浓度的铜绿微囊藻和小球藻藻液,于650nm处测定吸光度,再用血球计数板计算其浓度,得到两者的标准工作曲线方程:Y=95.021X+0.3483(R2=0.9992)和Y=50.956X− 0.0568(R2=0.9992),其中Y为藻细胞浓度(1×106

cells·mL-1),X为吸光度[13-15]. 实验中每隔12h测定1次藻液在650nm处的光吸收值,并由此换算出相应的藻液浓度. 1.2.4 清滤率和滤食率计算

铜锈环棱螺对单胞藻的清滤率(Clearance Rate)和滤食率(Filtration Rate)的计算采用大森信等[16]的公式,即:

CR=(V/N)×(lnCt−lnCtf)/t, FR=CR×(Ctf−C0)/(lnCtf−lnC0),

其中,CR为清滤率(mL·ind-1·h-1),

是指每个试验动物在单位时间内所滤过的水的体积;FR为滤食率(cells·ind-1·h-1),

是指单位时间内滤食性动物所滤食的藻细胞数;V为试验溶液体积(mL);N为铜锈环棱螺个数;C0、Ct和Ctf分别为藻液的起始浓度、对照组藻液终浓度和实验组藻液终浓度(cell· mL-1);t为实验持续时间(h). 1.2.5 藻毒素分析

用Beacon公司生产的微囊藻毒素检测试剂盒对试验所用的微囊藻、小球藻、栅藻和铜锈环棱螺进行ELISA法检测. 取试验用藻液1mL,冻融3次后于10000r·min-1离心10min,取上清液进行ELISA分析. 将螺去壳后取其组织,称湿重. 样品 处理方法参照文献[17]. 取一定量样品与2mL甲醇- 水(8+2)及8mL丙酮混合于玻璃匀浆器中,充分匀浆后将样品倾入离心管中离心10min (4000r·min-1). 取上清液与10mL正己烷混合并置于振荡器中振摇

第4期

潘洁慧,等:铜锈环棱螺对微囊藻的摄食及其毒素积累研究 481

30 min后,离心10min (4000r·min-1). 将上层有机相弃去,水相用C18固相萃取柱净化. 固相萃取柱装样前以5mL 100%甲醇、5mL去离子水预活化. 将水相提取物装样后以10mL 20%甲醇淋洗,再用10mL甲醇将藻毒素洗脱. 洗脱液旋转蒸发干,于-20℃贮藏待分析. 分析前将其溶于1mL去离子水中,用微囊藻毒素检测试剂盒进行测定.

势,与此相反,螺类对绿藻的清滤率和滤食率呈上升趋势.

导致这一结果的原因可能是:在正常生理状态下,铜锈环棱螺摄食蓝藻的能力要强于绿藻,但由于本实验采用的蓝藻铜绿微囊藻是一毒性很强的藻株,24h后,铜锈环棱螺可能因蓝藻藻毒素的毒害作用,影响其正常的摄食功能,从而导致CR和

FR值的下降. 实验中发现,实验开始24h后,摄

2 结果与分析

2.1 摄食试验

2.1.1 饵料种类对铜锈环棱螺摄食的影响

实验用浮游藻类分蓝藻(铜绿微囊藻)和绿藻(小球藻)2种,结果表明(图1,图2),铜锈环棱螺对不同饵料的清滤率和滤食率有显著差异(P

在实验开始后的前24h内,铜锈环棱螺对蓝藻的清滤率和滤食率都明显高于绿藻,但随着实验的继续,螺类对蓝藻的清滤率和滤食率出现下降趋

食蓝藻的铜锈环棱螺运动迟缓,活力明显不如摄食绿藻的螺类. 另一方面,由于实验动物本身对变化的环境具有一定的生理适应性,经过对某一特定环境一段时间的适应后,其清滤率和滤食率可能增加,因而就不难理解绿藻悬浮液中铜锈环棱螺清滤率和滤食率的上升.

2.1.2 实验动物密度对铜锈环棱螺摄食的影响

分别在400mL蓝、绿藻液中加入1、2、3个铜锈环棱螺,以观察实验动物密度对铜锈环棱螺的清滤率和滤食率的影响,结果见图1和图2. 经统计分析,

实验动物密度对清滤率和滤食率的影响是

1 实验动物密度对铜锈环棱螺清滤率的影响

图2 实验动物密度对铜锈环棱螺滤食率的影响

482 宁波大学学报(理工版) 2008

高度显著的(P

从图1和图2可以看出,当以单一绿藻作为饵料时,初始阶段实验动物密度越高,单个个体的平均CR、FR值也越高. 随着实验的进行,3种不同密度铜锈环棱螺的CR和FR值均有不同程度提高,密度小的CR值和FR值提高得较快. 实验结束时铜锈环棱螺对浮游藻类的清滤率和滤食率均与实验动物密度成明显的反比. 蓝藻摄食试验时,实验螺CR和FR的变化趋势与绿藻摄食试验时略有不同,实验开始后不久,CR与FR值即呈下降趋势. 从整个实验过程来看,螺对蓝藻的清滤率和滤食率与实验动物密度均成反比.

陆开宏[16]、

高亚辉[17,18]等的工作均验证了实验动物密度对桡足类滤食率的影响,这在个体较大或运动性较强的种类中尤为突出. 究其原因,除动物因过分拥挤、频繁碰撞影响其生理状态外,动物密度增加使代谢产物积累增多,溶氧减少,也能使实验动物产生明显的不适应. 笔者认为,实验动物密度对铜锈环棱螺滤食率的影响也有相似之处. 随着实验时间的增加,铜锈环棱螺代谢产物积累增多,水中溶解氧减少,实验动物密度对摄食的影响也愈发明显. 2.2 积累试验

毒性积累试验期间,蓝藻组水相和藻相中的总微囊藻毒素浓度平均为(29.47±0.43)μg·L-1;蓝藻+绿藻组(14.47±0.22)μg·L-1;四尾栅藻藻液没有检测到藻毒素.

积累试验开始后,藻毒素含量在铜锈环棱螺体内迅速上升,但2种处理方式螺体内微囊藻毒素的积累速率不同(图3),整个积累期间蓝藻+绿藻组肝脏中藻毒素的含量都明显高于蓝藻组(P<0.01). 蓝藻+绿藻组在第3 d肝脏中藻毒素的积累量就达到了(208.10±41.79)ng·g-1DW,是第1 d的19倍;在第15 d,肝脏中微囊藻毒素含量达到本次积累试验蓝藻+绿藻组的最高值(623.62±60.67)ng·g-1DW. 蓝藻组试验螺肝脏中微囊藻毒素积累量在第15d上

升至本次试验蓝藻组最高值(373.69±86.59)ng·g-1 DW. 这和Ozawa等[19]的研究结果不一样,他们在对石田螺的积累试验时第10d就达到最高值436 μg·g-1DW,在第15d时肝脏中的藻毒素含量已有所回落

.

图3 微囊藻毒素在铜锈环棱螺体内的积累

图4 微囊藻毒素在螺体内不同组织中的分布

图4可见,积累试验第10d,MCs在螺体内不同组织中的分布具有明显差异(P<0.01),其中肝脏的MCs含量高达(96.58±19.54)ng·g-1DW,其次为鳃中的MCs含量,平均为(41.23±9.75)ng·g-1DW;消化道中的MCs含量为(14.51±2.14)ng·g-1DW;藻毒素含量最低是头足部,仅为(1.97±0.53)ng·g-1DW. 由此表明铜锈环棱螺的肝脏对MCs具有较强的生物富集能力.

3 讨论

铜锈环棱螺的取食方式是刮食,它对悬浮颗粒和浮游藻类的摄取可能是水管形成的水动力作用、黏液的絮凝沉降和齿舌刮食行为的综合结果,但由

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于本研究设计的实验容器中只有1种或2种藻类的悬浮液作为其唯一的食物来源,故本研究采用研究滤食性贝类的成熟实验方法.

滤食率和摄食率均可以用来描述动物的滤食能力. 对于贝类,滤食率是指单位时间内滤食性动物经鳃滤食的水中颗粒物的重量;摄食率为单位时间内经唇瓣摄食入口的颗粒物重量,是指贝类实际摄食进入消化道的颗粒物的重量. 在贝类没有产生假粪的情况下滤食率和摄食率是一致的. 当贝类产生假粪时摄食率等于滤食率减去单位时间内产生的假粪量. 这主要是由于滤食性贝类对饵料颗粒具有选择性,可以将经鳃滤过但不适宜摄食的颗粒以假粪的形式经唇瓣排出体外,从而引起这两者的差异. 我们在实验过程中发现假粪现象普遍存在,但是由于粪便的收集与测定十分不便,而本实验的饵料成分单一且本实验主要探讨铜锈环棱螺对水体环境的影响,因此在考虑不影响结果分析的前提下,本文选择直接用滤食率来描述铜锈环棱螺的摄食能力.

将铜锈环棱螺暴露于铜绿微囊藻中,微囊藻毒素在螺体内得到迅速积累. 表面看来,环境中微囊藻毒素越高,螺体内MCs的积累应该越高. 但本试验结果显示,低浓度的微囊藻毒素暴露比高浓度的暴露在肝脏中的积累量更高. 这可能是低浓度的藻毒素暴露对螺的生物毒性较小,从而较少影响其正常的生活、生理和摄食活动,藻毒素在其体内的积累量就高. 但是高浓度的藻毒素暴露,可能会促使螺本身出现一种抵御机制,以减少微囊藻毒素对其自身的伤害. 李效宇等[20]对澳洲水泡螺的急性毒性实验表明,澳洲水泡螺对微囊藻毒素有很强的耐受力,甚至当微囊藻毒素高达1335.2μg·L-1时,仍无死亡. Williams等[21]用有毒微囊藻对海水贝进行为期3d的急性毒性试验,也得到了相同的结果. Ozawa等

[19]

用石田螺(Sinotaia histrica)做微囊藻毒

素的积累试验时,藻毒素在肝脏中的积累也不是一直上升. 结合国内外资料,笔者认为高浓度的微囊

藻毒素暴露会使螺本身出现一种抵御机制. 在试验过程中发现蓝藻组的螺大都紧闭其厣,这很有可能也是一种螺体减少与外界毒素直接接触的保护机制. 此外高浓度的藻毒素对螺类摄食的强力抑制 作用也减少了螺类对蓝藻的摄取,从而减少了MCs在螺体内的积累.

已有一些研究表明铜锈环棱螺能够显著改善水体透明度,有效降解富营养化水体中的N、P含量,同时由于螺类还具有较高的食用价值,便有专家建议在富营养化水体中大量投放,以期在获得环境效益的同时收获经济效益. 但值得注意的是富营养化水体的生物群落往往由产毒的水华蓝藻占绝对优势,人们在关注螺类对水体生态调控作用的同时,不能忽视螺类对藻毒素的积累及迁移可能对人类和其他经济动物产生的负面影响. 参考文献:

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宁波大学学报(理工版) 2008

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Ingestion of Microcystis aeruginosa and Accumulation of

Microcystins in Bellamya aeruginosa

PAN Jie-hui, LU Kai-hong*

( Application of Marine Biotechnology Key Laboratory of the Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China )

Abstract: In order to understand the mechanism of ingestion of Microcystis aeruginosa and accumulation of Microcystins(MCs) in Bellamya aeruginosa, two experiments are conducted. In the ingestion experiment, snails of different density are fed with Microcystis aeruginosa and Chlorella vulgaris separately in order to find their effects on Clearance Rates (CR, mL·ind-1·h-1) and Filtration Rates (FR, cells·ind-1·h-1) of Bellamya aeruginosa. The results demonstrate that both the bait type and snail density have significant effects on CR and FR. Accumulation experiments are performed with: (1) Scenedesmus quadricanda as the only food; (2)a 50:50 mixture of Scenedesmus quadricanda and Microcystis aeruginosa based on carbon concentration; and (3)

Microcystis aeruginosa as the only food. MCs inside Bellamya aeruginosa are tested with ELISA, and a curve for the dynamic variation of MCs is obtained. It is also found that the distribution of MCs in different tissues of

Bellamya aeruginosa show significant differences, which may be listed in decreasing order of value for liver, gill, intestine and foot.

Key words: Bellamya aeruginosa; Microcystis aeruginosa; filtration rate; microcystins; accumulation CLC number: Q958.8

Document code: A

(责任编辑 史小丽)

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文章编号:1001-5132(2008)04-0479-06

铜锈环棱螺对微囊藻的摄食及其毒素积累研究

潘洁慧,陆开宏*

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室,浙江 宁波 315211)

摘要:设计了2组室内实验研究铜锈环棱螺对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的摄食与毒素积累,其中摄食试验分别以铜绿微囊藻和小球藻(Chlorella vulgaris)为饵投喂不同密度铜锈环棱螺,对其清滤率CR(mL·ind-1·h-1)和滤食率FR(cells·ind-1·h-1)进行测定. 结果表明:饵料种类和实验动物密度对铜锈环棱螺的清滤率和滤食率均有显著影响. 毒素积累试验分别以单一四尾栅藻(Scenedesmus quadricanda)、50%铜绿微囊藻+50%四尾栅藻的混合藻液和单一铜绿微囊藻3种处理投喂铜锈环棱螺达15d,用ELISA法检测,得到了微囊藻毒素(MCs)在螺体内的动态变化曲线. 试验同时表明,藻毒素在铜锈环棱螺各组织中的分布有显著差异,藻毒素积累量依次为肝脏>鳃>消化道>头足部.

关键词:铜锈环棱螺;铜绿微囊藻;滤食率;藻毒素;积累 中图分类号:Q958.8

文献标识码:A

水体富营养化已成为我国乃至世界所面临的重大环境问题. 根据最近调查,欧洲、非洲、北美洲和南美洲分别有53%、28%、48%和41%的湖泊存在不同程度的富营养化现象,亚太地区54%的湖泊处于富营养化状态[1],我国则是60%[2]. 水体富营养化最重要的表症是浮游藻类特别是蓝藻的大量繁殖. 蓝藻的过度繁殖会影响水体的质量,造成水味腥臭,透明度下降,水体溶解氧下降,致使鱼类等水生生物死亡. 水华习见种铜绿微囊藻(Mi- crocystis aeruginosa)能产生肝毒性微囊藻毒素,不仅仅对水生动、植物有明显的毒害作用,而且能通过其他途径直接威胁人类健康,因而备受人们的关注[3-7].

螺类作为淡水生态系统中重要的底栖动物,一般认为其取食活动对着生藻类群落的生物组成与生产力有强烈的影响,事实上螺类的摄食与生理代谢显著影响着水层中包括颗粒悬浮物、营养盐和浮游藻类的种类和数量组成,螺类在构建水生群落结构和食物链传递中发挥着重要作用[8]. 铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)是我国最为常见的一种淡水底栖螺类,目前已有一些研究表明它能通过摄取水体营养物质,有效降低水体中氮、磷等含量,起到净化水质的作用[9,10]. 本文就铜锈环棱螺对铜绿微囊藻的摄食与毒素积累进行了试验研究,以期为探明淡水螺类调控浮游藻类、改良富营养化水体水质的生理生态机制提供基础资料.

收稿日期:2007-08-01. 宁波大学学报(理工版)网址:http://3xb.nbu.edu.cn 基金项目:浙江省自然科学基金(Z505319);宁波市自然科学基金(2006A610081). 第一作者:潘洁慧(1982-),女,浙江温州人,在读硕士研究生,主要研究方向:渔业环境保护. E-mail: [email protected] *通讯作者:陆开宏(1964-),男,浙江慈溪人,教授,主要研究方向:渔业环境保护及水域生态. E-mail: [email protected]

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1 材料和方法

1.1 材料

实验所用铜锈环棱螺采自宁波市江北区姚江流域. 螺类采回后,清除其体表附着生物及污物,于玻璃缸内暂养48h后,挑选体重1.2g左右的健康个体进行试验.

铜绿微囊藻、小球藻(Chlorella vulgaris)和四尾栅藻(Scenedesmus quadricanda)藻种由宁波大学水域生态与环境实验室提供,铜绿微囊藻采用BG11培养基[11]于三角锥形瓶内培养. 温度(25±1)℃,光照3000Lx,光暗比12h:12h. 小球藻和四尾栅藻采用“浙水院3号”培养基[12],通气大量培养,温度(25±1)℃,自然光照. 1.2 方法 1.2.1 摄食试验

采用静水实验系统,在装有400mL藻液的实验烧杯中分别放入1、2、3个铜锈环棱螺,并设2个对照组,每组3个重复,在(24±0.5)℃恒温,12h:12h光照条件下进行铜锈环棱螺对铜绿微囊藻和小球藻的摄食试验. 实验中铜绿微囊藻和小球藻液的起始浓度分别为1.384×107 cells·mL-1和7.434×106 cells·mL-1. 1.2.2 毒素积累试验

试验分3组:(1)单独投喂四尾栅藻(以下简称绿藻组);(2)投喂50%铜绿微囊藻+50%四尾栅藻的混合藻液(以下简称蓝藻+绿藻组);(3)单独投喂铜绿微囊藻(以下简称蓝藻组). 实验藻类的总浓度恒定为1×106 cells·mL-1. 每组设3个重复,共9只试验缸. 每个玻璃缸(20cm×10cm×20cm)放洗净后的螺30个,初始时,每个缸放3L试验藻液,保持每只螺负荷100mL藻液的密度. 试验进行至第1 d、3d、5d、10d、15d时,每个缸取2只螺,检测肝脏中的藻毒素含量,第10d时蓝藻组试验缸各取2个螺,取肝脏、肠、鳃、头足4部分组织,测其藻毒素在积累期间不同组织中的分布情况. 试验

期间,随着试验螺数量的减少,藻液也相应减少. 将所有的试验缸放于光照培养箱中. 温度(25±1)℃,光照3000Lx,光暗比12h:12h. 试验期间每天更换藻液,死亡的螺及时挑出. 1.2.3 藻生物量测定

分别取不同藻细胞浓度的铜绿微囊藻和小球藻藻液,于650nm处测定吸光度,再用血球计数板计算其浓度,得到两者的标准工作曲线方程:Y=95.021X+0.3483(R2=0.9992)和Y=50.956X− 0.0568(R2=0.9992),其中Y为藻细胞浓度(1×106

cells·mL-1),X为吸光度[13-15]. 实验中每隔12h测定1次藻液在650nm处的光吸收值,并由此换算出相应的藻液浓度. 1.2.4 清滤率和滤食率计算

铜锈环棱螺对单胞藻的清滤率(Clearance Rate)和滤食率(Filtration Rate)的计算采用大森信等[16]的公式,即:

CR=(V/N)×(lnCt−lnCtf)/t, FR=CR×(Ctf−C0)/(lnCtf−lnC0),

其中,CR为清滤率(mL·ind-1·h-1),

是指每个试验动物在单位时间内所滤过的水的体积;FR为滤食率(cells·ind-1·h-1),

是指单位时间内滤食性动物所滤食的藻细胞数;V为试验溶液体积(mL);N为铜锈环棱螺个数;C0、Ct和Ctf分别为藻液的起始浓度、对照组藻液终浓度和实验组藻液终浓度(cell· mL-1);t为实验持续时间(h). 1.2.5 藻毒素分析

用Beacon公司生产的微囊藻毒素检测试剂盒对试验所用的微囊藻、小球藻、栅藻和铜锈环棱螺进行ELISA法检测. 取试验用藻液1mL,冻融3次后于10000r·min-1离心10min,取上清液进行ELISA分析. 将螺去壳后取其组织,称湿重. 样品 处理方法参照文献[17]. 取一定量样品与2mL甲醇- 水(8+2)及8mL丙酮混合于玻璃匀浆器中,充分匀浆后将样品倾入离心管中离心10min (4000r·min-1). 取上清液与10mL正己烷混合并置于振荡器中振摇

第4期

潘洁慧,等:铜锈环棱螺对微囊藻的摄食及其毒素积累研究 481

30 min后,离心10min (4000r·min-1). 将上层有机相弃去,水相用C18固相萃取柱净化. 固相萃取柱装样前以5mL 100%甲醇、5mL去离子水预活化. 将水相提取物装样后以10mL 20%甲醇淋洗,再用10mL甲醇将藻毒素洗脱. 洗脱液旋转蒸发干,于-20℃贮藏待分析. 分析前将其溶于1mL去离子水中,用微囊藻毒素检测试剂盒进行测定.

势,与此相反,螺类对绿藻的清滤率和滤食率呈上升趋势.

导致这一结果的原因可能是:在正常生理状态下,铜锈环棱螺摄食蓝藻的能力要强于绿藻,但由于本实验采用的蓝藻铜绿微囊藻是一毒性很强的藻株,24h后,铜锈环棱螺可能因蓝藻藻毒素的毒害作用,影响其正常的摄食功能,从而导致CR和

FR值的下降. 实验中发现,实验开始24h后,摄

2 结果与分析

2.1 摄食试验

2.1.1 饵料种类对铜锈环棱螺摄食的影响

实验用浮游藻类分蓝藻(铜绿微囊藻)和绿藻(小球藻)2种,结果表明(图1,图2),铜锈环棱螺对不同饵料的清滤率和滤食率有显著差异(P

在实验开始后的前24h内,铜锈环棱螺对蓝藻的清滤率和滤食率都明显高于绿藻,但随着实验的继续,螺类对蓝藻的清滤率和滤食率出现下降趋

食蓝藻的铜锈环棱螺运动迟缓,活力明显不如摄食绿藻的螺类. 另一方面,由于实验动物本身对变化的环境具有一定的生理适应性,经过对某一特定环境一段时间的适应后,其清滤率和滤食率可能增加,因而就不难理解绿藻悬浮液中铜锈环棱螺清滤率和滤食率的上升.

2.1.2 实验动物密度对铜锈环棱螺摄食的影响

分别在400mL蓝、绿藻液中加入1、2、3个铜锈环棱螺,以观察实验动物密度对铜锈环棱螺的清滤率和滤食率的影响,结果见图1和图2. 经统计分析,

实验动物密度对清滤率和滤食率的影响是

1 实验动物密度对铜锈环棱螺清滤率的影响

图2 实验动物密度对铜锈环棱螺滤食率的影响

482 宁波大学学报(理工版) 2008

高度显著的(P

从图1和图2可以看出,当以单一绿藻作为饵料时,初始阶段实验动物密度越高,单个个体的平均CR、FR值也越高. 随着实验的进行,3种不同密度铜锈环棱螺的CR和FR值均有不同程度提高,密度小的CR值和FR值提高得较快. 实验结束时铜锈环棱螺对浮游藻类的清滤率和滤食率均与实验动物密度成明显的反比. 蓝藻摄食试验时,实验螺CR和FR的变化趋势与绿藻摄食试验时略有不同,实验开始后不久,CR与FR值即呈下降趋势. 从整个实验过程来看,螺对蓝藻的清滤率和滤食率与实验动物密度均成反比.

陆开宏[16]、

高亚辉[17,18]等的工作均验证了实验动物密度对桡足类滤食率的影响,这在个体较大或运动性较强的种类中尤为突出. 究其原因,除动物因过分拥挤、频繁碰撞影响其生理状态外,动物密度增加使代谢产物积累增多,溶氧减少,也能使实验动物产生明显的不适应. 笔者认为,实验动物密度对铜锈环棱螺滤食率的影响也有相似之处. 随着实验时间的增加,铜锈环棱螺代谢产物积累增多,水中溶解氧减少,实验动物密度对摄食的影响也愈发明显. 2.2 积累试验

毒性积累试验期间,蓝藻组水相和藻相中的总微囊藻毒素浓度平均为(29.47±0.43)μg·L-1;蓝藻+绿藻组(14.47±0.22)μg·L-1;四尾栅藻藻液没有检测到藻毒素.

积累试验开始后,藻毒素含量在铜锈环棱螺体内迅速上升,但2种处理方式螺体内微囊藻毒素的积累速率不同(图3),整个积累期间蓝藻+绿藻组肝脏中藻毒素的含量都明显高于蓝藻组(P<0.01). 蓝藻+绿藻组在第3 d肝脏中藻毒素的积累量就达到了(208.10±41.79)ng·g-1DW,是第1 d的19倍;在第15 d,肝脏中微囊藻毒素含量达到本次积累试验蓝藻+绿藻组的最高值(623.62±60.67)ng·g-1DW. 蓝藻组试验螺肝脏中微囊藻毒素积累量在第15d上

升至本次试验蓝藻组最高值(373.69±86.59)ng·g-1 DW. 这和Ozawa等[19]的研究结果不一样,他们在对石田螺的积累试验时第10d就达到最高值436 μg·g-1DW,在第15d时肝脏中的藻毒素含量已有所回落

.

图3 微囊藻毒素在铜锈环棱螺体内的积累

图4 微囊藻毒素在螺体内不同组织中的分布

图4可见,积累试验第10d,MCs在螺体内不同组织中的分布具有明显差异(P<0.01),其中肝脏的MCs含量高达(96.58±19.54)ng·g-1DW,其次为鳃中的MCs含量,平均为(41.23±9.75)ng·g-1DW;消化道中的MCs含量为(14.51±2.14)ng·g-1DW;藻毒素含量最低是头足部,仅为(1.97±0.53)ng·g-1DW. 由此表明铜锈环棱螺的肝脏对MCs具有较强的生物富集能力.

3 讨论

铜锈环棱螺的取食方式是刮食,它对悬浮颗粒和浮游藻类的摄取可能是水管形成的水动力作用、黏液的絮凝沉降和齿舌刮食行为的综合结果,但由

第4期 潘洁慧,等:铜锈环棱螺对微囊藻的摄食及其毒素积累研究 483

于本研究设计的实验容器中只有1种或2种藻类的悬浮液作为其唯一的食物来源,故本研究采用研究滤食性贝类的成熟实验方法.

滤食率和摄食率均可以用来描述动物的滤食能力. 对于贝类,滤食率是指单位时间内滤食性动物经鳃滤食的水中颗粒物的重量;摄食率为单位时间内经唇瓣摄食入口的颗粒物重量,是指贝类实际摄食进入消化道的颗粒物的重量. 在贝类没有产生假粪的情况下滤食率和摄食率是一致的. 当贝类产生假粪时摄食率等于滤食率减去单位时间内产生的假粪量. 这主要是由于滤食性贝类对饵料颗粒具有选择性,可以将经鳃滤过但不适宜摄食的颗粒以假粪的形式经唇瓣排出体外,从而引起这两者的差异. 我们在实验过程中发现假粪现象普遍存在,但是由于粪便的收集与测定十分不便,而本实验的饵料成分单一且本实验主要探讨铜锈环棱螺对水体环境的影响,因此在考虑不影响结果分析的前提下,本文选择直接用滤食率来描述铜锈环棱螺的摄食能力.

将铜锈环棱螺暴露于铜绿微囊藻中,微囊藻毒素在螺体内得到迅速积累. 表面看来,环境中微囊藻毒素越高,螺体内MCs的积累应该越高. 但本试验结果显示,低浓度的微囊藻毒素暴露比高浓度的暴露在肝脏中的积累量更高. 这可能是低浓度的藻毒素暴露对螺的生物毒性较小,从而较少影响其正常的生活、生理和摄食活动,藻毒素在其体内的积累量就高. 但是高浓度的藻毒素暴露,可能会促使螺本身出现一种抵御机制,以减少微囊藻毒素对其自身的伤害. 李效宇等[20]对澳洲水泡螺的急性毒性实验表明,澳洲水泡螺对微囊藻毒素有很强的耐受力,甚至当微囊藻毒素高达1335.2μg·L-1时,仍无死亡. Williams等[21]用有毒微囊藻对海水贝进行为期3d的急性毒性试验,也得到了相同的结果. Ozawa等

[19]

用石田螺(Sinotaia histrica)做微囊藻毒

素的积累试验时,藻毒素在肝脏中的积累也不是一直上升. 结合国内外资料,笔者认为高浓度的微囊

藻毒素暴露会使螺本身出现一种抵御机制. 在试验过程中发现蓝藻组的螺大都紧闭其厣,这很有可能也是一种螺体减少与外界毒素直接接触的保护机制. 此外高浓度的藻毒素对螺类摄食的强力抑制 作用也减少了螺类对蓝藻的摄取,从而减少了MCs在螺体内的积累.

已有一些研究表明铜锈环棱螺能够显著改善水体透明度,有效降解富营养化水体中的N、P含量,同时由于螺类还具有较高的食用价值,便有专家建议在富营养化水体中大量投放,以期在获得环境效益的同时收获经济效益. 但值得注意的是富营养化水体的生物群落往往由产毒的水华蓝藻占绝对优势,人们在关注螺类对水体生态调控作用的同时,不能忽视螺类对藻毒素的积累及迁移可能对人类和其他经济动物产生的负面影响. 参考文献:

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Ingestion of Microcystis aeruginosa and Accumulation of

Microcystins in Bellamya aeruginosa

PAN Jie-hui, LU Kai-hong*

( Application of Marine Biotechnology Key Laboratory of the Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China )

Abstract: In order to understand the mechanism of ingestion of Microcystis aeruginosa and accumulation of Microcystins(MCs) in Bellamya aeruginosa, two experiments are conducted. In the ingestion experiment, snails of different density are fed with Microcystis aeruginosa and Chlorella vulgaris separately in order to find their effects on Clearance Rates (CR, mL·ind-1·h-1) and Filtration Rates (FR, cells·ind-1·h-1) of Bellamya aeruginosa. The results demonstrate that both the bait type and snail density have significant effects on CR and FR. Accumulation experiments are performed with: (1) Scenedesmus quadricanda as the only food; (2)a 50:50 mixture of Scenedesmus quadricanda and Microcystis aeruginosa based on carbon concentration; and (3)

Microcystis aeruginosa as the only food. MCs inside Bellamya aeruginosa are tested with ELISA, and a curve for the dynamic variation of MCs is obtained. It is also found that the distribution of MCs in different tissues of

Bellamya aeruginosa show significant differences, which may be listed in decreasing order of value for liver, gill, intestine and foot.

Key words: Bellamya aeruginosa; Microcystis aeruginosa; filtration rate; microcystins; accumulation CLC number: Q958.8

Document code: A

(责任编辑 史小丽)


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