中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2000年第21卷第4期175
羧甲基壳聚糖的制备研究
李继珩 虞有文 于燕玲 沈 伟
摘 要 目的:研究壳聚糖羧甲基化条件、收率及产物的某些性质:合成羧甲基壳聚糖,产物用等电点沉淀法分离纯化,。90%～
95%之间。等电点为7.17～7.56,除了溶液的pH。结论:壳聚糖羧甲基
化后,溶解性改变,。 关键词 壳聚糖,, 中图分类号StudiesonPreparationofCarboxymethylchitosanLiJiheng,YuYouwen,YuYanling,ShenWei
BiopharmaceuticalDepartment,ChinaPharmaceuticalUniversity(Nanjing210009)
Abstract Purpose:Topreparecarboxymethylchitosan(CMCTS)fromchitosan(CTS)andchloraceticacid(CAA),andthentodeterminesomepropertiesoftheproducts.Methods:Inanalkalinesetting,CTSandCAAwerecondensatedtoformCMCTS,whichwasthenisolatedandpurifiedbythewayof
isoelectricpoint(pI)precipitation.Furthermore,thepIoftheproductwasdetermined.Results:CM2CTSwasobtainedintheyieldof90%～95%andthepIofitis7.17～7.56.ExceptforatthepointofpI,theproductcompletelysolubleinwatersolution.Conclusion:Afterthecourseofcarboxymethy2lation,the
changeinsolubilityofCTSgreatlyimprovesitsusesinthefieldofmedicine.Keywords Carboxymethylchitosan,Chitosan,pI
壳聚糖(chitosan,CTS)在医药、食品、化妆品行业,及化工、环保及农业各领域中用途广泛[1～3],但由于其仅溶于稀酸,在浓酸中水解,在水及碱性水溶液中不溶解,使其应用受到一定限制。为改变其溶解性能,扩大应用范围,许多学者致力于其结构修饰研究[4,5]。CTS与一氯醋酸(chloraceticacid,CAA)反应可合成羧甲基壳聚糖(carboxymethylchitosan,CMCTS),其反应为:
但如何判断反应过程和终点,迄今未见报道。本研究根据CMCTS的两性电解质性质,建立了判断反应过程和终点的方法,探索了影响反应的某些因素,测定了产物的等电点(pI)、元素组成及红外光谱,研
η)和透光度的影究溶液pH值对CMCTS的粘度(
响,为开发CMCTS奠定了理论基础并提供了有关技术参数。1 材料和仪器
CTS均为本室自制,海虾CTS脱乙酰度84.03%,元素组成为C40.
63%、H6.89%及N7.11%;海蟹CTS脱乙酰度81.65%,元素组成C41.82%、H7.53%及N7.15%;河龙虾CTS脱乙
作者单位 210009 南京,中国药科大学(李继珩、于燕玲);江苏医学生物制品研究所(虞有文);宿迁伟伟精细化工厂(沈伟) 收稿日期 1999210228 修回日期 1999212215
酰度80.31%,元素组成为C44.90%、H7.11%及N7.02%;一氯醋酸,CP,常州市新华活性材料研究所,使用时中和成钠盐。
721分光光度计,上海第三分析仪器厂;R2983
176中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2000年第21卷第4期
200ml及50%NaOH溶液150ml,用水补充至总体
红外光谱仪,PerkinElmer;1106元素分析仪,CarloErba;NDJ21粘度计,上海天平仪器厂;PHS23B精密pH计,上海雷磁仪器厂。2 方法与结果2.1 CMCTS的制备
积为1450ml,室温下间歇搅拌,每间隔0.5～2h,
取样测定波长630nm处的T,结果如图2。由图2可知,当反应进行4h后即达到终点。
取CTS10g加1%醋酸溶液1000ml,60℃搅拌溶解,过滤。向滤液中加CAANa及,,,溶于碱液,过滤,,,水洗,滤干,烘干粉碎得成品、pI及元素组成见表1。
表1 用CTS制备CMCTS的结果
CTS来源
CTSCMCTS(g)101010
(g)9.09.59.0
pI7.177.567.37
图1 CAA浓度的影响
---粘度曲线;———透光率曲线
元素组成(%)
NCH
6.3643.167.257.0142.347.116.7341.967.08
河龙虾
海蟹海虾
由表1可知,从CTS制备CMCTS的收率在90%～95%之间,各产物均有相应pI,含氮量均较
其相应CTS为低。海蟹CMCTS溴化钾压片经红外光谱分析,有3410、2923、1760及1070cm-1处的2NH2、2CH2、2COOH及C2O2C特征吸收峰。2.2 缩合反应条件探索
2.2.1 CAA浓度的影响 取海龙虾CTS14g,加1%醋酸溶液至1400ml,60℃搅拌溶解,过滤,取滤
图2 反应时间的影响
2.3 CMCTS的某些性质研究
2.3.1 一般性质 CMCTS是一种无定形粉末状
液分成6份,每份200ml,分别加4mol/LCAANa溶液10、20、30、40、50及60ml,各加水至总体积为260ml,再加入50%NaOH溶液30ml,室温下间歇
固体物质,其色泽与CTS原料相同。本研究产物为
两性电解质,与蛋白质相似,具有pI。在偏离pI的水溶液中形成粘性胶体溶液,有乳光;在pI时难溶并形成小麦面筋样高持水量、机械性能良好的多孔网状团块沉淀;在浓酸中可水解成单糖和小分子CMCTS衍生物。不溶于乙醇、丙酮
、甲醇、乙醚及苯等有机溶剂。与蛋白质不同的是,在水中加热不变性,无茚三酮显色反应,能吸附铜离子形成天蓝色絮状物,但不产生双缩脲反应;与亚硝酸作用,但不产生黄色反应;能吸附重金属离子产生白色絮状沉淀;与三氯醋酸不产生沉淀反应。2.3.2 pH值对CMCTS溶液T和η的影响及pI测定 取一定量海龙虾CMCTS加适量水,滴加1%醋酸至溶液pH5.5左右,60℃搅拌溶解,过滤,
搅拌反应24h,测定各反应液25℃时的η(CPS)。同时,另取10ml容量瓶7只,各加5%NaOH溶液5.0ml,再分别取各CAANa浓度的反应液定容至10.0ml,混匀后测定各反应液在波长630nm处的
透光率[T(%)],结果见图1。由图1可知,当
CAA浓度为65mg/ml时,室温反应24h,反应已基本达到平衡。但溶液粘度仍不断升高
。
2.2.2 反应时间的影响 取海蟹CTS(日本进口,
脱乙酰度73.15%)10g加1%醋酸溶液至800ml,60℃搅拌溶解,过滤,不溶物再加1%醋酸溶液溶解
两次,每次100ml。合并滤液,再加CAANa溶液
分取滤液5份,每份40ml。取其中一份用1%NaOH溶液调至CMCTS形成团块状沉淀,此时溶
李继珩,等.羧甲基壳聚糖的制备研究
液pH值接近CMCTS的pI,其余4份分别调pH值至pI两侧较狭pH值范围内,最后用水补充至CM2CTS浓度为0.25%。5份溶液经酸度计测得其pH值分别为7.05、7.15、7.37、7.90及8.04。各溶液分别离心除去沉淀,测定其上层液在波长630nm处的T及25℃的η,结果见图3
。经测试三批样品的pI分别为7.17、7.56及7.37(见表1)。
177
程度越高,产物溶解度越大,此时反应液的T和η
均增大,故可根据反应液T的变化判断羧甲基化程度和反应终点。在碱性条件下,当CTS与CAA的重量比为1∶7.5时,室温反应4h以上即可达到终点。产物经IR分析亦证明主要与糖残基的羟,但由于,每批产物的pI均不可能是常数,只是一个参数。本研究测定了产物pI,根据此特性,将产物溶解于pI以外的溶液中,经过滤、透析或超滤、沉淀及干燥等过程制取高纯度CMCTS。因此测定产物pI对控制CMCTS的生产工艺、纯化过程及其应用具有重要的理论指导意义。
CMCTS是一种安全无毒的CTS类衍生物,具
图3 pH值对CMCTS溶液T和η的影响
---粘度曲线;———透光率曲线
由图3可知,当溶液pH值在7.05～8.04的范
围内,随着pH值的微小改变,CMCTS溶液的T及η则产生很大变化。当pH为7.37时,T为100%η,值最低;当pH值高于或低于7.37时,T均降低而η均升高,偏离pI越远变化越大;pH7.37时CMCTS溶解度最小,故可认为该产物pI接近pH7.37。3 讨 论
有良好的溶解性能,在偏离其pI的溶液中均可形成
具有乳光的胶体溶液,来源于蟹和鲎的CMCTS乳光轻微,海龙虾及河龙虾CMCTS乳光较严重,可能是它们的空间结构差异所致,但均不影响其应用。由于CMCTS的成膜性及保湿性优良,因此其在医药、食品、化妆品及酶和细胞固定化方面将有广泛而重要的用途。
参考文献
1 王爱勤,李平.甲壳素及其衍生物在药物制剂中的应用进展.中国
药房杂志,1994,5(6)∶32～36
2 曾名勇.
几种甲壳素衍生物在医药上的应用.中国海洋药物,1995,14(1)∶49～52
3 严俊.甲壳素的化学和应用.化学通报,1984,11∶26～31
4 张秋华,骆赞春,徐敏.水溶性甲壳素衍生物溶液粘度的研究.化
由CTS和CAA合成CMCTS收率较高。CTS
是一种碱性高分子多糖,在水中和稀碱中均不溶解;但CMCTS是两性电解质,除了在其pI时的溶液中外,在酸碱溶液中均溶解。因此,CTS在羧甲基化反应过程中,随着CTS逐渐生成CMCTS,反应液中CTS悬浮颗粒逐渐生成CMCTS而溶解,羧甲基化
学世界,1997,1∶35～38
5 王爱勤,闫志宏,贾宝全,等.羧甲基壳聚糖的制备与质量分析.中
国生化药物杂志,1996,17(4)∶147～149
粗品肝素、半成品肠衣新技术设备信息发布会通知
由全国生化药物情报中心站和南京生物化学制药研究所组织的粗品肠衣、肝素新技术设备信息发布会拟定于2000年9月上旬在江苏省南京市召开。此次信息发布会将有以下几项内容:①机械刮肠衣与手工刮肠衣的比较及不同型号刮肠衣机展出。②蛋白水解酶及新型离子交换树脂在粗品肝素生产中的专题介绍。③膜材料在粗品肝素生产中应用介绍及不同规格浓缩机展出。④邀请粗品肝素收购的著名企业负责人到会介绍有关情况。
会期二天,除邀请有关专家讲座之外,将组织到应用上述技术及设备的生产单位实地参观。会务费:500元/人,交通费自理。电话报名截止:8月25日。
联系人:严东红 秦重桢 电话:025-8801179 手机:[1**********]
中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2000年第21卷第4期175
羧甲基壳聚糖的制备研究
李继珩 虞有文 于燕玲 沈 伟
摘 要 目的:研究壳聚糖羧甲基化条件、收率及产物的某些性质:合成羧甲基壳聚糖,产物用等电点沉淀法分离纯化,。90%～
95%之间。等电点为7.17～7.56,除了溶液的pH。结论:壳聚糖羧甲基
化后,溶解性改变,。 关键词 壳聚糖,, 中图分类号StudiesonPreparationofCarboxymethylchitosanLiJiheng,YuYouwen,YuYanling,ShenWei
BiopharmaceuticalDepartment,ChinaPharmaceuticalUniversity(Nanjing210009)
Abstract Purpose:Topreparecarboxymethylchitosan(CMCTS)fromchitosan(CTS)andchloraceticacid(CAA),andthentodeterminesomepropertiesoftheproducts.Methods:Inanalkalinesetting,CTSandCAAwerecondensatedtoformCMCTS,whichwasthenisolatedandpurifiedbythewayof
isoelectricpoint(pI)precipitation.Furthermore,thepIoftheproductwasdetermined.Results:CM2CTSwasobtainedintheyieldof90%～95%andthepIofitis7.17～7.56.ExceptforatthepointofpI,theproductcompletelysolubleinwatersolution.Conclusion:Afterthecourseofcarboxymethy2lation,the
changeinsolubilityofCTSgreatlyimprovesitsusesinthefieldofmedicine.Keywords Carboxymethylchitosan,Chitosan,pI
壳聚糖(chitosan,CTS)在医药、食品、化妆品行业,及化工、环保及农业各领域中用途广泛[1～3],但由于其仅溶于稀酸,在浓酸中水解,在水及碱性水溶液中不溶解,使其应用受到一定限制。为改变其溶解性能,扩大应用范围,许多学者致力于其结构修饰研究[4,5]。CTS与一氯醋酸(chloraceticacid,CAA)反应可合成羧甲基壳聚糖(carboxymethylchitosan,CMCTS),其反应为:
但如何判断反应过程和终点,迄今未见报道。本研究根据CMCTS的两性电解质性质,建立了判断反应过程和终点的方法,探索了影响反应的某些因素,测定了产物的等电点(pI)、元素组成及红外光谱,研
η)和透光度的影究溶液pH值对CMCTS的粘度(
响,为开发CMCTS奠定了理论基础并提供了有关技术参数。1 材料和仪器
CTS均为本室自制,海虾CTS脱乙酰度84.03%,元素组成为C40.
63%、H6.89%及N7.11%;海蟹CTS脱乙酰度81.65%,元素组成C41.82%、H7.53%及N7.15%;河龙虾CTS脱乙
作者单位 210009 南京,中国药科大学(李继珩、于燕玲);江苏医学生物制品研究所(虞有文);宿迁伟伟精细化工厂(沈伟) 收稿日期 1999210228 修回日期 1999212215
酰度80.31%,元素组成为C44.90%、H7.11%及N7.02%;一氯醋酸,CP,常州市新华活性材料研究所,使用时中和成钠盐。
721分光光度计,上海第三分析仪器厂;R2983
176中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2000年第21卷第4期
200ml及50%NaOH溶液150ml,用水补充至总体
红外光谱仪,PerkinElmer;1106元素分析仪,CarloErba;NDJ21粘度计,上海天平仪器厂;PHS23B精密pH计,上海雷磁仪器厂。2 方法与结果2.1 CMCTS的制备
积为1450ml,室温下间歇搅拌,每间隔0.5～2h,
取样测定波长630nm处的T,结果如图2。由图2可知,当反应进行4h后即达到终点。
取CTS10g加1%醋酸溶液1000ml,60℃搅拌溶解,过滤。向滤液中加CAANa及,,,溶于碱液,过滤,,,水洗,滤干,烘干粉碎得成品、pI及元素组成见表1。
表1 用CTS制备CMCTS的结果
CTS来源
CTSCMCTS(g)101010
(g)9.09.59.0
pI7.177.567.37
图1 CAA浓度的影响
---粘度曲线;———透光率曲线
元素组成(%)
NCH
6.3643.167.257.0142.347.116.7341.967.08
河龙虾
海蟹海虾
由表1可知,从CTS制备CMCTS的收率在90%～95%之间,各产物均有相应pI,含氮量均较
其相应CTS为低。海蟹CMCTS溴化钾压片经红外光谱分析,有3410、2923、1760及1070cm-1处的2NH2、2CH2、2COOH及C2O2C特征吸收峰。2.2 缩合反应条件探索
2.2.1 CAA浓度的影响 取海龙虾CTS14g,加1%醋酸溶液至1400ml,60℃搅拌溶解,过滤,取滤
图2 反应时间的影响
2.3 CMCTS的某些性质研究
2.3.1 一般性质 CMCTS是一种无定形粉末状
液分成6份,每份200ml,分别加4mol/LCAANa溶液10、20、30、40、50及60ml,各加水至总体积为260ml,再加入50%NaOH溶液30ml,室温下间歇
固体物质,其色泽与CTS原料相同。本研究产物为
两性电解质,与蛋白质相似,具有pI。在偏离pI的水溶液中形成粘性胶体溶液,有乳光;在pI时难溶并形成小麦面筋样高持水量、机械性能良好的多孔网状团块沉淀;在浓酸中可水解成单糖和小分子CMCTS衍生物。不溶于乙醇、丙酮
、甲醇、乙醚及苯等有机溶剂。与蛋白质不同的是,在水中加热不变性,无茚三酮显色反应,能吸附铜离子形成天蓝色絮状物,但不产生双缩脲反应;与亚硝酸作用,但不产生黄色反应;能吸附重金属离子产生白色絮状沉淀;与三氯醋酸不产生沉淀反应。2.3.2 pH值对CMCTS溶液T和η的影响及pI测定 取一定量海龙虾CMCTS加适量水,滴加1%醋酸至溶液pH5.5左右,60℃搅拌溶解,过滤,
搅拌反应24h,测定各反应液25℃时的η(CPS)。同时,另取10ml容量瓶7只,各加5%NaOH溶液5.0ml,再分别取各CAANa浓度的反应液定容至10.0ml,混匀后测定各反应液在波长630nm处的
透光率[T(%)],结果见图1。由图1可知,当
CAA浓度为65mg/ml时,室温反应24h,反应已基本达到平衡。但溶液粘度仍不断升高
。
2.2.2 反应时间的影响 取海蟹CTS(日本进口,
脱乙酰度73.15%)10g加1%醋酸溶液至800ml,60℃搅拌溶解,过滤,不溶物再加1%醋酸溶液溶解
两次,每次100ml。合并滤液,再加CAANa溶液
分取滤液5份,每份40ml。取其中一份用1%NaOH溶液调至CMCTS形成团块状沉淀,此时溶
李继珩,等.羧甲基壳聚糖的制备研究
液pH值接近CMCTS的pI,其余4份分别调pH值至pI两侧较狭pH值范围内,最后用水补充至CM2CTS浓度为0.25%。5份溶液经酸度计测得其pH值分别为7.05、7.15、7.37、7.90及8.04。各溶液分别离心除去沉淀,测定其上层液在波长630nm处的T及25℃的η,结果见图3
。经测试三批样品的pI分别为7.17、7.56及7.37(见表1)。
177
程度越高,产物溶解度越大,此时反应液的T和η
均增大,故可根据反应液T的变化判断羧甲基化程度和反应终点。在碱性条件下,当CTS与CAA的重量比为1∶7.5时,室温反应4h以上即可达到终点。产物经IR分析亦证明主要与糖残基的羟,但由于,每批产物的pI均不可能是常数,只是一个参数。本研究测定了产物pI,根据此特性,将产物溶解于pI以外的溶液中,经过滤、透析或超滤、沉淀及干燥等过程制取高纯度CMCTS。因此测定产物pI对控制CMCTS的生产工艺、纯化过程及其应用具有重要的理论指导意义。
CMCTS是一种安全无毒的CTS类衍生物,具
图3 pH值对CMCTS溶液T和η的影响
---粘度曲线;———透光率曲线
由图3可知,当溶液pH值在7.05～8.04的范
围内,随着pH值的微小改变,CMCTS溶液的T及η则产生很大变化。当pH为7.37时,T为100%η,值最低;当pH值高于或低于7.37时,T均降低而η均升高,偏离pI越远变化越大;pH7.37时CMCTS溶解度最小,故可认为该产物pI接近pH7.37。3 讨 论
有良好的溶解性能,在偏离其pI的溶液中均可形成
具有乳光的胶体溶液,来源于蟹和鲎的CMCTS乳光轻微,海龙虾及河龙虾CMCTS乳光较严重,可能是它们的空间结构差异所致,但均不影响其应用。由于CMCTS的成膜性及保湿性优良,因此其在医药、食品、化妆品及酶和细胞固定化方面将有广泛而重要的用途。
参考文献
1 王爱勤,李平.甲壳素及其衍生物在药物制剂中的应用进展.中国
药房杂志,1994,5(6)∶32～36
2 曾名勇.
几种甲壳素衍生物在医药上的应用.中国海洋药物,1995,14(1)∶49～52
3 严俊.甲壳素的化学和应用.化学通报,1984,11∶26～31
4 张秋华,骆赞春,徐敏.水溶性甲壳素衍生物溶液粘度的研究.化
由CTS和CAA合成CMCTS收率较高。CTS
是一种碱性高分子多糖,在水中和稀碱中均不溶解;但CMCTS是两性电解质,除了在其pI时的溶液中外,在酸碱溶液中均溶解。因此,CTS在羧甲基化反应过程中,随着CTS逐渐生成CMCTS,反应液中CTS悬浮颗粒逐渐生成CMCTS而溶解,羧甲基化
学世界,1997,1∶35～38
5 王爱勤,闫志宏,贾宝全,等.羧甲基壳聚糖的制备与质量分析.中
国生化药物杂志,1996,17(4)∶147～149
粗品肝素、半成品肠衣新技术设备信息发布会通知
由全国生化药物情报中心站和南京生物化学制药研究所组织的粗品肠衣、肝素新技术设备信息发布会拟定于2000年9月上旬在江苏省南京市召开。此次信息发布会将有以下几项内容:①机械刮肠衣与手工刮肠衣的比较及不同型号刮肠衣机展出。②蛋白水解酶及新型离子交换树脂在粗品肝素生产中的专题介绍。③膜材料在粗品肝素生产中应用介绍及不同规格浓缩机展出。④邀请粗品肝素收购的著名企业负责人到会介绍有关情况。
会期二天,除邀请有关专家讲座之外,将组织到应用上述技术及设备的生产单位实地参观。会务费:500元/人,交通费自理。电话报名截止:8月25日。
联系人:严东红 秦重桢 电话:025-8801179 手机:[1**********]