可溶性蛋白含量测定(考马斯亮蓝染色法)
1. 试剂配制
(1) 考马斯亮蓝溶液配制:称取100 mg考马斯亮蓝,溶于50ml 90%乙醇中,加入100ml 85%(W/V)磷酸,再用蒸馏水定容到1L。贮于棕色瓶中,常温下可保存一个月。
90% 乙醇配制:95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制,即95%乙醇37.5ml,75%乙醇12.5ml或取45ml无水乙醇直接定容至50ml。
(2) 100 g/ml 牛血清蛋白(BSA)标准溶液:称取10mg BSA,用质量分数为0.9%的氯化钠溶解,并定容至100 ml即为100 g/ml。 2. 标准曲线绘制
取6支具塞试管,按下表加入试剂,摇匀,向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂,5min左右,以0号试管为空白对照,在595nm下比色测定吸光度,以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
3. 样品测定
(1) 样品提取:取鲜样2g,加2ml蒸馏水研磨成匀浆后,移到离心管中,然后用6ml蒸馏水分次洗涤研钵,完全转移至离心管后,放置0.5-1小时以充分提取,然后4000r/min离心20min,弃去沉淀,上清液转移至容量瓶,以蒸馏水定容至10ml,待测。 (2) 吸取样品提取液1.0ml(视蛋白质含量适当稀释),放入带塞试管中(每个样品重复两次),加入5ml考马斯亮蓝试剂,摇匀,放置2min待反应完成,在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查蛋白质含量。 4. 蛋白质含量计算
可溶性蛋白含量(mg/g)=(C·VT)/(1000VS·WF) C—查标准曲线值,g; VT—提取液总体积,ml; WF—样品鲜重,g; VS—测定时加样量,ml
可溶性蛋白含量测定(考马斯亮蓝染色法)
1. 试剂配制
(1) 考马斯亮蓝溶液配制:称取100 mg考马斯亮蓝,溶于50ml 90%乙醇中,加入100ml 85%(W/V)磷酸,再用蒸馏水定容到1L。贮于棕色瓶中,常温下可保存一个月。
90% 乙醇配制:95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制,即95%乙醇37.5ml,75%乙醇12.5ml或取45ml无水乙醇直接定容至50ml。
(2) 100 g/ml 牛血清蛋白(BSA)标准溶液:称取10mg BSA,用质量分数为0.9%的氯化钠溶解,并定容至100 ml即为100 g/ml。 2. 标准曲线绘制
取6支具塞试管,按下表加入试剂,摇匀,向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂,5min左右,以0号试管为空白对照,在595nm下比色测定吸光度,以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
3. 样品测定
(1) 样品提取:取鲜样2g,加2ml蒸馏水研磨成匀浆后,移到离心管中,然后用6ml蒸馏水分次洗涤研钵,完全转移至离心管后,放置0.5-1小时以充分提取,然后4000r/min离心20min,弃去沉淀,上清液转移至容量瓶,以蒸馏水定容至10ml,待测。 (2) 吸取样品提取液1.0ml(视蛋白质含量适当稀释),放入带塞试管中(每个样品重复两次),加入5ml考马斯亮蓝试剂,摇匀,放置2min待反应完成,在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查蛋白质含量。 4. 蛋白质含量计算
可溶性蛋白含量(mg/g)=(C·VT)/(1000VS·WF) C—查标准曲线值,g; VT—提取液总体积,ml; WF—样品鲜重,g; VS—测定时加样量,ml