龙志敏 [1**********]1 09制药一班
实验二 绿豆芽的蛋白质含量测定
(考马斯亮蓝G-250比色法)
一、实验目的
1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理，掌握其测定方法。 2、熟练掌握分光光度计的使用技术。
二、实验原理
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，该结合物在595nm波长下有最大光吸收。在一定的蛋白质浓度范围内(0～1000μg/mL)，其吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于可溶性蛋白质的定量测定。
三、仪器、试剂和材料
1、仪器设备
分析天平、10mL塑料离心管、5mL移液管、研钵、量筒、50mL离心管、10mL容量瓶、离心机、722型分光光度计 2、试剂
（1）标准蛋白质原液：称取100mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，即为1mg/mL的标准蛋白质原液。
（2）考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入 85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 3、材料： 绿豆芽
四、操作步骤
（一）绿豆芽蛋白质样品的制备
1、准确称取新鲜绿豆芽下胚轴2g，放入研钵中，加入2mL蒸馏水研成匀浆，转移至50mL 离心管中，再用6mL蒸馏水充分洗涤研钵，洗涤液收集于同一量筒中，定容至10ml,混匀； 2、冰浴中放置10-20 min以充分提取；
3、从量筒中取1ml至离心管，12000rpm离心5min，将上清液倒入10mL量筒，以蒸馏水定容至10mL，即得绿豆芽蛋白质样品溶液。 （二）标准曲线制作
2、高浓度标准曲线的制作（0～1000μg/mL）
取6 支1.5mL 的离心管，按表1.2 加入试剂，配制不同浓度的蛋白质标准液
另取6 支10 mL 的离心管，编号标记，从上述各管中分别吸取0.1mL 溶液，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置3min 后在595 nm 波长下比色测定（比色应在 l h 内完成），记录各管测定的光密度值OD595nm。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，制作蛋白质浓度为0～1000μg/mL的标准曲线如下：
（三）绿豆芽蛋白质样品溶液浓度的测定
另取2 支10 mL 的离心管，分别加入0.l mL 绿豆芽蛋白质样品溶液，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置3min 后在595 nm 波长下比色，记录吸光度，如下表：
计算吸光度平均值得：（0.224+0.235）/2=0.229
五、结果与分析
所测样品提取液的吸光度为0.229，代进标准曲线方程：Y=0.0008X得其相应的蛋白质含量为286.25μg
计算绿豆芽蛋白质含量=14.3μg
六、注意事项
1、蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合的反应迅速，反应在2 min左右达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定。因此，比色应在出现蓝色3 min～l h内完成，不可放置太久。
2、考马斯亮蓝染色能力强，所用比色皿应及时清洗，否则会污染比色皿，影响吸光值测定。切不可使用石英比色皿测定。
3、高浓度的Tris 、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂对测定有干扰。
七、思考题
1、做好本实验的关键问题有哪些？
答：研磨绿豆芽要充分；冰愈离心时间要足；比色应在出现蓝色3 min～l h内完成 2、如何正确使用分光光度计？
答：1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。
2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）
3.根据所需波长转动波长选择钮。
4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。
5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。 6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。
7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。
龙志敏 [1**********]1 09制药一班
实验二 绿豆芽的蛋白质含量测定
(考马斯亮蓝G-250比色法)
一、实验目的
1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理，掌握其测定方法。 2、熟练掌握分光光度计的使用技术。
二、实验原理
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，该结合物在595nm波长下有最大光吸收。在一定的蛋白质浓度范围内(0～1000μg/mL)，其吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于可溶性蛋白质的定量测定。
三、仪器、试剂和材料
1、仪器设备
分析天平、10mL塑料离心管、5mL移液管、研钵、量筒、50mL离心管、10mL容量瓶、离心机、722型分光光度计 2、试剂
（1）标准蛋白质原液：称取100mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，即为1mg/mL的标准蛋白质原液。
（2）考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入 85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 3、材料： 绿豆芽
四、操作步骤
（一）绿豆芽蛋白质样品的制备
1、准确称取新鲜绿豆芽下胚轴2g，放入研钵中，加入2mL蒸馏水研成匀浆，转移至50mL 离心管中，再用6mL蒸馏水充分洗涤研钵，洗涤液收集于同一量筒中，定容至10ml,混匀； 2、冰浴中放置10-20 min以充分提取；
3、从量筒中取1ml至离心管，12000rpm离心5min，将上清液倒入10mL量筒，以蒸馏水定容至10mL，即得绿豆芽蛋白质样品溶液。 （二）标准曲线制作
2、高浓度标准曲线的制作（0～1000μg/mL）
取6 支1.5mL 的离心管，按表1.2 加入试剂，配制不同浓度的蛋白质标准液
另取6 支10 mL 的离心管，编号标记，从上述各管中分别吸取0.1mL 溶液，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置3min 后在595 nm 波长下比色测定（比色应在 l h 内完成），记录各管测定的光密度值OD595nm。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，制作蛋白质浓度为0～1000μg/mL的标准曲线如下：
（三）绿豆芽蛋白质样品溶液浓度的测定
另取2 支10 mL 的离心管，分别加入0.l mL 绿豆芽蛋白质样品溶液，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置3min 后在595 nm 波长下比色，记录吸光度，如下表：
计算吸光度平均值得：（0.224+0.235）/2=0.229
五、结果与分析
所测样品提取液的吸光度为0.229，代进标准曲线方程：Y=0.0008X得其相应的蛋白质含量为286.25μg
计算绿豆芽蛋白质含量=14.3μg
六、注意事项
1、蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合的反应迅速，反应在2 min左右达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定。因此，比色应在出现蓝色3 min～l h内完成，不可放置太久。
2、考马斯亮蓝染色能力强，所用比色皿应及时清洗，否则会污染比色皿，影响吸光值测定。切不可使用石英比色皿测定。
3、高浓度的Tris 、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂对测定有干扰。
七、思考题
1、做好本实验的关键问题有哪些？
答：研磨绿豆芽要充分；冰愈离心时间要足；比色应在出现蓝色3 min～l h内完成 2、如何正确使用分光光度计？
答：1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。
2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）
3.根据所需波长转动波长选择钮。
4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。
5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。 6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。
7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。