再生医学在中国：必要性与研究成果
中国拥有超过13亿人口，迫切需要开展组织修复与再生医疗技术研究，服务于广大民众卫生保健的需求。据国家卫生部报道，在城镇地区因机体损伤、意外事故或者其它因素导致的人数占住院治疗人数的9%，该比例仅次于呼吸道疾病（12%）和消化道疾病（10%）。包括遗传性疾病、代谢性疾病和慢性疾病等原因导致的创伤，据估计每年大约有超过1亿的病人需接受组织修复和再生性治疗。
再生医学在中国甚至全球都是一个历史悠久的医疗话题，拥有深刻的现代意义。过去20几年来，科学家在遗传学、发展生物学、干细胞生物学以及组织工程学等领域取得了重要研究成果，逐步提高了我们对再生医学的认知，并将有关研究成果用于临床治疗。在中国，这些学科的融合促使组织修复与再生医学成为医学研究与治疗中最活跃的领域之一。有关基础性研究成果正逐步应用于临床并改变着医疗方式。
在中国，有三大领域发展得尤为迅速：干细胞生物学、组织构造与再生以及创伤性治疗的组织工程医疗产品的研究。如近年来通过利用诱导性多功能干细胞（iPSCs）产生的复制性四倍体胚胎互补性iPS小鼠。同时，成体干细胞的分离与培养技术的发展使得因外伤或糖尿病引起的血管损伤后皮肤汗腺的再生。组织工程学领域也取得一些进展，尤其是在自定义矩阵以及机体相关调控因子功能的认识等领域，使得骨组织、软骨组织、神经组织、血管以及肌腱能够重建。且相关研究成果已进入临床试验阶段，试验结果令人欣慰。创伤的愈合阶段要达到机体不同组织的同步再生是一个关键性研究领域，科学家正在探索防止疤痕形成的方法，包括利用皮肤干细胞不需经过iPSC阶段而直接分化成不同组织类型的技术方法。
在中国开展的再生医学研究紧跟全球医学研究趋势，并且逐步将基础性研究理论转化为临床应用。国家政府也非常重视再生医学的研究。由中国科学院和中国组织工程学中长期发展战略研究规划的“2050蓝图”中，将再生医学列入重点发展方向。另外，中国国家食品与药品监督管理局已在组织转移性治疗技术管理章程中将干细胞研究列为三级医疗技术。此外，在2005年和2010年召开的香山科学会议中，均对再生医学研究中的研究成果与需注意的问题展开讨论，为国家政府继续支持和资助再生医学研究奠定了坚实基础。
在接下来的十年间，中国将开展以下再生医学领域的研究：运用诱导性干细胞技术开展不同组织类型的协同修复与再生研究；运用组织工程学开展大型组织的重建以及组织工程学医疗产品的大规模应用。以上研究成果均为医疗服务的提高灌注了希望，将开创一个更健康和谐的社会。
付小兵，博士，中国工程院院士。中国人民解放军总医院基础医学院组织工程学重点实验室室主任。
第一部分 干细胞与再生
多功能干细胞的发展及其价值
干细胞治疗非常有潜力取代其他对细胞有损伤的治疗方法。虽然免疫排斥一直有待于解决，但通过运用体细胞核转移技术建立源自病人自体细胞的同源胚胎干细胞系是一中具有可行性的方案。这种体细胞核转移技术生成的胚胎干细胞，且使其分化为所需特定细胞类型，用于疾病治疗，称之为治疗性克隆。现已成功培育出小鼠核转移胚胎干细胞，且没有发现这种核转移胚胎干细胞与常规胚胎干细胞存在任何显著的差异。但是，体细胞核转移技术还有待于进一步成熟。因此，科学家正试图改良重构胚的培养条件，发现连续性培养法（细胞核转移阶段用M16培养介质，而在后两个细胞生长阶段用KSOM培养介质）可明显提高囊胚的生长速度。同时，也尝试通过使用小分子添加剂提高克隆效率，如使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂CBHA，可显著提高SCNT重构胚技术中的囊胚生长速度（表1）。另外，同常用的组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A相比，CBHA还可提高囊胚的质量。
卵母细胞来源问题一直阻碍着人类治疗性克隆研究进程。我们正在探索重组受精胚胎的可行性。研究发现有丝分裂期间捕获到的小鼠2细胞期胚胎，经电转导融合后能有助于细胞核重组，从捐赠者胚叶细胞到体细胞均有效。研究表明，运用2细胞期电转导融合小鼠胚胎的技术，培育出源健康足月的母乳的克隆幼仔以及多功能胚胎干细胞，而胚胎或体细胞均源自捐赠者（3）。这种研究方法表明植入前胚胎可能成为人类治疗性克隆的重要资源。
要将治疗性克隆技术从小鼠推广到人类，我们已经在这方面做了一系列研究。根据卵细胞形态学评估标准，我们已将分裂期Ⅱ的卵母细胞分成四个阶段。从中发现胚胎能从A和B阶段的卵母细胞发育到囊胚阶段。但出于C和D阶段的胚胎却不能发育到囊胚阶段，大多数胚胎细胞均停滞在2-4细胞期（4）。而在国内，人们常把绝大多数的卵母细胞均分类到C和D阶段，者也许是造成治疗性克隆失败的原因。我国已将人类卵母细胞培育到囊胚阶段，并且还运用人类包皮细胞器从这些胚胎细胞中派生出一些人类单性生殖胚胎干细胞。胚胎干细胞具有正常的形态，能正常表达各种特定干细胞表面标记物，并且还能分化成三种胚芽层的派生物。这些技术的发展均能推动我国治疗性克隆的研究和临床应用（5）。
2006年，我国科学家通过转录因子的表达成功从小鼠体细胞分化出鼠胚胎干细胞样诱导多功能干细胞，这是一个开创性的研究成果（6）。但诱导胚胎干细胞所具备的多功能性是否与其胚胎干细胞所具有的功能一致，起初还不得而知。此外，通过四倍体互补分析技术培育出的动物还未经证实，且经严格审查证明这些细胞并非完全具有多功能潜能。现已经改良培育技术，能在一个月内诱导培育出iPSC，同时还能从鼠胚胎细胞和成纤维细胞派生一系列iPSC细胞系。这表明源自体细胞的iPSC拥有像胚胎干细胞类似的全能性（7）。为找到一种能有
效快速地评价iPSC细胞的多功能性，我们从不同多功能水平进行了比较。我们鉴别了一个叫Dlk1-Dio3区域，它位于鼠基因组的保守性压印区，在全能性鼠干细胞被激活而在部分多功能干细胞中被抑制，可作为干细胞多功能性的标志（8）。
安全问题一直在iPSC临床应用中受广泛关注，我们通过四倍体互补分析技术观察成年iPSC的小鼠来评估iPSC是否有潜在的致瘤性。我们再iPSC F0代小鼠中鉴定出23.1%的致肿瘤的细胞，但在ESC诱导的小鼠中未发（表2），证明这些iPSC具有肿瘤倾向。用定量PCR的方法验证4个iPSC诱导因子（c-Myc, Klf4, Oct4 和Sox2）的内源性和转基因表达水平。研究发现在iPSC诱导的小鼠中，c-Myc活性因子的表达水平在肿瘤组织中明显高于肺肿瘤组织（P
再生医学领域种间嵌合体的应用
多功能胚胎干细胞或诱导型多功能干细胞近年来一直受到医学领域的广泛关注，这很大程度上是由于其具有潜力分化成各种特定的细胞，用于细胞治疗（1，2）。但干细胞的体外分化过程中同样存在以下主要问题：（1）因为体外培育不能模拟体内高度复杂的环境，而导致只能产生有限的细胞类型；（2）体外培育分化出的细胞类型可能与与体内组份不同。（3）在体外培育出高度复杂的组织器官似乎看起来不大可能。
其中有一种方法可能解决以上问题，比如说在囊胚期出于分化阶段时将其进行替换。但是，由于受伦理道德和可操作性的限制，不能将人类胚胎干细胞或诱导型多功能干细胞替换进入人类囊胚中。鉴于此，我们希望能够找到在不同物种囊胚期分化出ES/iPS。
有报道称通过在两个不同物种间聚合早期胚胎培育出中间嵌合体的可行性。现已获得三种嵌合体：小家鼠和卡氏小鼠；绵羊和山羊以及牛和印度牛（3-6）。而在这些嵌合体中，两个物种间在亲缘关系非常近，基因组差异性低于3%。因此，通过胚胎细胞融合技术是否能将进化关系远的两个物种作为亲本培育嵌合体还不得而知。我们首先从森鼠体内获取的胚胎干细胞，拥有48染色体核型态，且可表达一些多功能性标志物，包括碱性磷酸酶、Oct4, Nanog, 和Rex1（图一A）。随后又发现森鼠胚胎干细胞经体外培养能够形成拟胚体，最后分化成三种胚芽层（7）。进一步的研究证实将森鼠胚胎干细胞注入裸小鼠会形成畸胎瘤，经组织病理学检查也发现畸胎瘤组织中存在三种胚芽层组织（7）。
随后我们又通过显微注射法将森鼠胚胎干细胞引入鼠囊胚，其中有繁殖出的小鼠里约7%属
于嵌合体小鼠，它们的被毛颜色不一（图1B）。另外，将绿色荧光蛋白标记的森鼠胚胎干细胞注入受体小鼠体内，有可见绿色荧光（图1C）。所有出生的嵌合小鼠均健康活跃。此外，解剖嵌合小鼠发现，内部脏器均发出可见的绿色荧光，这些组织有脑部、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、脾脏、膀胱、肺脏、肝脏、胃、小肠以及睾丸（图1D）。通过对嵌合体小鼠进行竞争性PCR，发现森鼠的细胞分别在多种组织中。这种细胞类型在一些气管如脑部和肌肉中的分布高达30-40%。一些嵌合体小鼠精液中也有5%的森鼠细胞类型，也就是说森鼠胚胎干细胞可能控制繁殖细胞系。此外还发现携带有绿色荧光蛋白的细胞能分化成多种功能性细胞，如神经细胞、寡树突胶质细胞、星形胶质细胞、神经干细胞、心肌细胞、内皮细胞以及角质细胞（如图2所示）。
该研究结果具有以下意义：（1）森鼠胚胎干细胞能完全同鼠囊胚细胞群整合，尽管两物种间进化关系遥远，仍产生了嵌合体。（2）这些嵌合体小鼠个组织脏器中森鼠细胞类型均有高达40%的分布率。（3）该胚胎干细胞还能精确分化为多种细胞类型，并且还可与宿主组织融合。这些研究结果说明通过将ES引入亲缘关系较远的动物，能在体内分化成特定的细胞类型，具有一定的可行性。
运用遗传学原理进一步证实胚胎干细胞或宿主囊胚在理论上能增强或抑制胚胎干细胞分布在特定组织器官的比例。例如，将宿主囊胚人为地基因突变，会阻碍组织的定向发育（如Pdx1基因突变导致胰腺发育不良）。最近，Kobayashi等证实将鼠iPSC注入Pdx1基因缺失的小鼠囊胚中，会产生具有功能性的胰腺组织（9）。相反，如果ES细胞经人为改造携带有能抑制本身分化为特定细胞系的基因，ES细胞将不会在嵌合体组织中分布。例如，敲除控制ES细胞分化成神经组织的基因，将会抑制ES细胞进入脑部，这在一定程度上可以避开伦理学问题。
由于细胞生存率低和特异性分化能力弱，干细胞的总体效用和临床运用很大程度上受到限制
（1）。最近的研究显示，利用体外分化和去分化技术重组间充质干细胞，能提高其在体内治疗的效果。
最近的研究也表明，运用基因重组可在体外使得终末分化的哺乳动物细胞经去分化转变为诱导型多功能干细胞（2）。由此可见，这些重组细胞具有特异性再生治疗的潜能，但iPSC的所具备的治疗潜能受诸多因素的影响，如低效率、免疫原性、重组失误以及基因不稳定性导致癌症的发生等等（3）。
究竟在没有基因干预的条件下诱导细胞去分化，最终获得具有治疗潜能的重组干细胞能否成为可能，我们对此展开了系列调查。当研究成年鼠骨髓间充质干细胞的可塑性时发现这种细胞在体外出现去分化现象（4）。在体外经诱导和分化的5羟色胺敏感性神经元，在去掉神经元诱导介质后能装变为形态和表型上与间充质干细胞类似的细胞。这些去分化的MSC细胞在体外可经进一步的诱导型增殖，最终分化为5羟色胺敏感性神经元，这意味着这些成体干细胞的可塑性要比过去想象的要好。随后又有证据表明单克隆的MSCs能分化为亲缘关系远的细胞系（5,6）。所以干细胞的直接分化毫无疑问地成为MSC可塑性研究的主要手段，而去分化则是改变细胞命运以及再分化为其他细胞系的先决条件，如从神经元分化为内皮细胞，反之亦然（6）。在体外研究细胞的分化命运时发现一个有趣的现象：经理去分化的干细胞表现出较强的分化潜能，也就是说当干细胞进入再分化阶段时，倾向于分化为神经元干细胞，并且神经元的标志物表达水平也随之提高。以上说明去分化的MSC可能与原始MSC细胞类型具有差异性。
图1. 散点图表示用鼠全基因组微阵列方法检测的DeMSCs和MSCs中不同基因的差异性表达水平。红色表示DeMSCs上调基因（650/41012,1.5%）；绿色表示MSCs下调基因（1240/41012,3%）；黄色标志基因表达水平差异不显著。
最近，我们对去分化的MSC的特征展开研究，并且将其与未分化的MSC进行比较（7）。研究发现去分化的MSC保留其免疫表型特征和中胚层结构，进一步的基因表达水平分析发现有650（1.5%）个基因的表达水平上调，1240（3.0%）个基因表达水平下调，这远远是未分化的MSC细胞基因表达水平的2倍（如图一所示），也就是说去分化的MSC细胞是经过重组编程的。此外，还发现84个与细胞凋亡信号相关额基因中有13个基因的表达水平有很大差异，去分化的MSC细胞中bc1-2家族蛋白的表达水平也上调。去分化的MSC细胞的生存指数研究也表明在氧化应激的条件下，去分化的MSC细胞能分化为多种细胞类型。我们还发现在去分化的MSC细胞中的神经元标志物的表达水平要比未分化的MSC细胞中的表达水平高，这就是说去分化的MSC细胞保留着神经元细胞的某种特性，可能在分化为神经元细胞。这种去分化的MSC细胞具备以上特征能够持续传代3到4代，我们对此展开了去分化的MSC体内治疗的研究，比如以缺氧缺血性脑损伤为模型（HIBD，一种当前无法治疗的慢性神经性损伤疾病）（8）。研究结果显示移植3天后，均能在注射部位检测到绿色荧光蛋白标记的MSC和去分化MSC细胞，但第七天时只能检测到去分化MSC细胞的踪迹（如图2A,2B所示），这也再次证实了去分化MSC细胞拥有较强的神经元分化能力。更重要的是，用穿梭试验来评估小鼠的认知能力显示：经去分化MSC治疗的小鼠表现出的认知能力比MSC治疗的小鼠强。总之，MSC细胞具有可重组性，通过人为干预性操作课具有体内治疗潜能。
图2. 试验设计原理及HIBD病理模型的治疗效果。为促使神经元的分化，鼠骨髓源性的单克隆MSCs首先
经由DEME/F12/10%FBS/10-7M, ATRA以及10 ng/ml de bFGF组成的介质预处理。所有细胞用PBS洗涤后转移至神经元诱导介质(MNM, DEME/2% DMSO/200Um; BHA/25Mm, KCl/2mM,丙戊酸10uM, 司克林1uM,氢化可的松5ug/ml 胰岛素)中培养24-48h。建立HIBD病理模型5天后，将GFP-MSCs or GFP-DeMSCs注入小鼠右后侧脑室。细胞移植后7天在脑部并未检测到GFP表达的MSCs（A），而在DeMSCs处理的小鼠脑部检测到强烈的绿色荧光（B）。穿梭试验评估小鼠学习记忆能力发现经细胞移植1到2个月后，经去分化MSC治疗的小鼠表现出的认知能力比MSC治疗的小鼠强。
该研究为MSC介导的细胞治疗提供的一个新颖、具有临床实用价值的研究方法。与iPSC相比，去分化诱导的细胞重组可能是再生医学领域一种更简便、安全有效的治疗途径。有趣的是，诱导iPSC的基因在去分化MSC细胞中的变异性不大，说明两者之间存在不同的机理机制。特别是miR-34a基因的表达水平上调，与细胞存活和分化为神经元有关，这暗示在干细胞重组干预中还涉及到表观遗传学机制。进一步的研究将提高MSC细胞的体外重组效率，最大化去分化MSC的治疗效果，因此有望成为再生医学领域中的一种新型有效的治疗策略。
非人类灵长类动物：重要的再生医学动物模型
世界上有超过400多种非人类灵长类动物（NHPs），中国作为拥有为数不多的野生非人类灵长类动物栖息地国家之一，也是24种非人类灵长类动物的故乡。NHPs 与人类之间的基因关系比其他动物近。并且在生理解剖学方面与人类非常相似，特别是中枢神经系。因此，NHP可作为人类研究人类疾病的唯一理想的动物模型。过去二十年来，干细胞领域取得的长足进步已经离用工程细胞替换受损组织的目标更进一步。然而，基于多功能干细胞的治疗方法应用到临床之前还有许多科技问题急于解决（1）。而干细胞治疗的安全效果评估须通过NHPs动物试验，才能进入人类临床试验阶段，因此NHPs作为一种理想的模式动物。
当前，人工饲养NHP数量最多的当数美国和中国。仅中国就有总数超过二十万的猴子，起主要有恒河猴和猕猴组成，而中国的饲养条件已达到国际动物福利标准。如专长于NHP疾病模型的开发与合作研究的昆明生物医学国际，因其拥有世界一流的NHP饲养管理条件，已获得国际实验动物评估认证管理委员会（AAALAC）的认证。以下三个例子说明中国NHP研究概况。
基因组学研究进展
随着基因组测序技术的快速发展，NHP基因组测序工作已开始，如经过中国西南地区几个研究小组的合作研究，已将中国恒河猴和食蟹厚的全基因组进行测序（2）。该两种动物是生物医学领域常用的NHP动物模型，特别是在神经科学、药物开发领域、人类疾病有关的可用药物控制基因同源序列和人类错配等位基因的鉴定，除此之外还有新型药物的开发等。此外，人类与NHPs的相似之处还表现在细胞水平上。最近的研究证明恒河猴胚胎干细胞的microRNA特征与人类非常相似，相似度远远超过了小鼠，说明运用NHPs作为细胞治疗临床前动物模型具有可行性（3）。
母婴过早分离的研究
关于人类早期心理承受力模型的最新研究表明，恒河猴母婴过早分离能导致下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱和行为异常，这种有害效应是否能通过后天社会生活得到纠正还不得而知。在这项研究中，我们比较了经1.5年和3年正常社会生活的由母亲抚养和由同伴抚养的恒河猴的皮质醇水平（年龄分别是2岁和3.5岁）。结果表明由同伴抚养的猴的毛发皮质醇水平要比有母亲抚养的猴的毛发皮质醇水平低。而血浆皮质醇水平测试发现受强烈压力下的由同伴抚养的猴的皮质醇水平出现顶峰的时间后延。另外，由同伴抚养的猴经过3年的正常社会生活也会出现行为异常的现象。由同伴抚养的猴还出现运动迟缓和打堆现象，同时还出现一成不变的行为（重复性的动作，包括踱步、允吸、自挠、摇摆身体、跳跃以及吧唧嘴）（如
图1所示）。这些试验结果首次证明与啮齿类动物相比（4,5），由母亲抚养的恒河猴的毒性效应持续时间长，且经正常社会生活不能得到补救（6）。因此，由母亲抚养的恒河猴可作为人类早期不利成长环境的理想动物模型。
图1. 由同伴抚养和猴（n=13,11）与由母亲抚养的猴(n=22,20)头发皮质醇水平比较（ug/dL,mean with±SEM）。A图表示2岁，B图表示3.5岁。C图表示3.5岁试验猴持续性的一成不变的行为比较，D图表示3.5岁试验猴的坐姿行为比较。以上结果显示由母亲抚养的恒河猴的毒性效应持续时间长，且经正常社会生活不能得到补救。
转基因NHPs的研究
转基因技术的运用使得人们可以诱导NHPs发生与人类有关的疾病或症候群。该研究增进了我们对遗传疾病病因的认识，并且有望发展成为一门新型治疗策略。到目前为止，关于培育转基因猴的报道甚少（7-9）。猴转基因的效率低下是当前转基因治疗的绊脚石。最近，我们探索出一种培育转基因恒河猴的方法，该方法主要运用了编码增强型绿色荧光蛋白的猴免疫缺陷病毒（SIV）为基础的慢病毒载体，以及感染早期卵裂阶段胚胎的方法。重要的是，转染胚胎并不影响其发育。此外，在胚胎基因组激活之前或之中进行转染并不影响转基因表达的水平和稳定性。其中还从三重受孕的母体获得了一个转基因胎儿。另外，从四个单独受孕的母体获得了4个胎儿，其中有两个全身带有增强型绿色荧光蛋白标记（如图2所示）（10）。这些结果表明SIV载体培育转基因猴的可行性及其在非人类灵长类动物转基因技术中的有效性。当前我们正探索用于人类神经退行性疾病（帕金森和阿尔茨海默病）的转基因猴。
图2.转基因恒河猴。A图表示带有荧光标记的转基因猴（2岁）；B图表示共聚焦显微技术分析转基因猴冰冻切片GFP表达水平（绿色）：脑(a), 肝脏 (b), 气管 (c), 心脏 (d), 胃(e), 肾脏 (f) 。
运用动物模型子宫移植研究干细胞生物学
小鼠胚胎干细胞（ESCs）首次在1981得到分离（1,2），而人类多功能干细胞则是在1998年从囊胚中培养而来（3）。随后因其在疾病治疗和再生医学领域得到广泛研究和运用。2006年，诱导型多功能干细胞的分离有望作为个性化治疗的工具（4）。分离自内源性细胞群的ESCs可作为体外早期胚胎研究的有力工具，但其在体内的分化、分布以及多功能干细胞的迁移等方面还不得而知。通过干细胞移植建立动物模型可能是一个研究以上过程的有用步骤。
运用子宫干细胞移植技术在同源性或异源性细胞水平上研究多种组织迁移和分化功能，为建立动物模型探究体内移植干细胞的生物学功能奠定一定的基础。简单的说来，运用超声波技术（能显示腹膜腔的横断面）或剖腹技术将同源性或异源性细胞注射入经孕育45-55天（孕期为145天）的山羊胎儿的腹膜腔内（如图1所示）。与剖腹手术相比，运用超声波技术建立子宫干细胞移植模型有着较低的流产率（5）。这将是一种安全有效的方法。运用该技术已将包括人类造血干细胞、鼠胚胎干细胞以及鼠诱导型多功能干细胞在内的多种干细胞类型移植入山羊胚胎（5-7）。
图1 子宫移植法构建体内干细胞动物模型的实验步骤。
通过移植人脐带血细胞建立重组山羊模型时得到如下研究结果：将移植细胞作GFP标记后移植入受体山羊体内，通过GFP荧光技术、荧光活化细胞分选技术以及免疫组织化学法均能在不同器官检测到带GFP标记的细胞，这些器官有肾脏、肌肉、脾脏、心脏以及肺脏（如图2所示）。此外还发现所有组织中均检测到带GFP标记的细胞具有成簇分布的特征（如图2D所示）。经PCR技术检测人类特异性基因证实了人类细胞在受体山羊组织中确实存在（如图2 A所示）。经RT-PCR技术和IHC技术分析表明了不同造血干细胞和非造血干细胞器官中人类组织特异性RNA和蛋白质已得到表达，这些器官包括肺脏、肾脏、脾脏和肝脏（如图2B、2C所示）。而血液和肝脏组织中全基因组RNA表达水平的检测也证实了人类基因在受体山羊中表达。
虽然人类/山羊重组体的出现为活体组织干细胞生物学研究提供了理想的动物模型。但是 ，在这个条件下转基因干细胞的生物学功能研究受其具有异体基因背景的影响。为避免这种情况的出现，一种经同源性干细胞移植的转基因小鼠已经培育。因其具有体积小、饲养周期短以及遗传背景清楚的特征，小鼠可作为体内干细胞生物学研究的候选动物模型。通常将怀孕中期（怀孕14.5天小鼠的干细胞群经腹腔手术的方法注入胚胎体内。现已发展出一种新型子宫内移植方法和经改良的手术方法，运用该法已成功实现孕12.5天小鼠的干细胞移植，这是一门重要的技术攻关，提高了培育转基因小鼠的效率（8）。
图2. 重组干细胞山羊模型的分子水平分析（引自参考文献7）.
运用经人工或自然突变的干细胞注入健康胚胎可用同源性或异源性细胞移植法培育出特定的病理模型。通过移植人类脐带血细胞Lin-CD34+如胚胎山羊子宫内，在转化过程中携带BCR-ABL逆转录病毒，可构建慢性粒细胞白血病（CML）动物模型，能有效模拟CML早期病理状态（未发表），并有望作为CML病理机制和药物开发研究的理想工具。
如果将健康干细胞注入易感胎儿体内，能保护动物免受疾病感染，该疗效可使得IUSCT作为遗传病产前治疗的工具，或者保护胎儿免受组织损伤。例如以经化学试剂CCl4诱导肝脏损伤的小鼠为例，子宫移植的造血干细胞分化成为人类肝样细胞过程中，经检测证实其可表达人类肝脏特异性蛋白以及参与肝脏组织损伤的部分修复（9），这为人类肝细胞样细胞的再生研究提供了新的方法。同时也表明了子宫移植技术可用于肝脏疾病或损伤的治疗，具有良好的治疗前景。
总之，通过IUSCT建立的重组动物模型为研究免疫耐受和干细胞移植、归巢、分化、基因表达以及非病理条件下的可塑性研究提供了新的工具。同时也有助于多数人类遗传病产前诊治或细胞组织修复、异体器官移植的预防。相信在不久的将来，随着干细胞生物学的深入研究，IUSCT技术将成为基因缺陷和疾病的临床治疗的再生医学诊治方法。
骨间质干细胞在再生医学领域的治疗前景
间质干细胞是成体干细胞中的一种，过去十年以来在再生医学领域引起极大关注（表1）。我们已分离培养出介质选择性细胞亚群（Flk1+CD44+CD29+CD105+CD166+CD34
-CD31-Lin-），即Flk1+MSCs。这些细胞亚群均为多功能干细胞，具有一定增殖能力和免疫调节功能。为探索其在疾病治疗中的应用价值，我们首次在体内外开展安全试验。研究发现Flk1+MSCs注入小鼠体内后没有致畸瘤性，并且还可分泌DKK-1因子抑制恶性细胞增殖
（1）。我们分别从恒河猴和人骨髓分离并增殖Flk1+MSCs，随后将其移植入恒河猴和人类志愿者体内。而在细胞融合过程中没有发现受体出现异常现象。实验室检测血液、骨髓、肾脏以及肝脏功能，发现经细胞融合后并不引起各组织器官功能的改变（2）。Flk1+MSCs是首次经中国食品与药物监督管理局批准的干细胞产品。
表1. MSC的有关临床应用统计表
证实Flk1+MSCs细胞的安全性后，我们开展两个临床试验评估其疗效。第一个试验探索出一种将外周血干细胞与Flk1+MSCs细胞结合的新型策略，其能提高移植效率和避免出现一系列移植物抗宿主疾病。33位恶性白血病高危病人接受拥有正常T细胞功能的人类白细胞抗原（HLA）外周血干细胞的移植手术，1到2个月以内，所有的病人都完成了不同程度的细胞融合。血液学分析发现中性粒细胞在干细胞移植手术后11天达到超过0.5x109/L，血小板水平在14天后超过20x109/L。15位病人患I–IV级移植物抗宿主病（45.5%），仅有2位病人从III 级过度到IV级（6.1%），而从29位患者中发现有9位病人患有慢性移植物抗宿主病（31%）。同时观察至60个月还发现20位病人幸存下来（20%），6位病人复发了白血病（18.2%）。这样算来三年存活率仅为57.2%。
第二项研究是开放性的二期临床试验，其目的在于评估外周血干细胞移植过程中MSC融合结果（3–5x105 cells/kg）。接下来一年，我们将55位白血病患者随机分为治疗组（27人）和对照组（28人）。MSC细胞融合后并没有立即发现负面效应，中期比较两组间白细胞和血小板水平的恢复情况。然而，治疗组中患者的血小板回复水平（大于50x109cells/L）要比对照组患者血小板回复水平快得多（分别是第22天和28天，p=0.036）。基质细胞衍生因子（SDF-1）表达水平也比对照组到达顶峰的时间快得多（分别是第8天和第16天）。此外还检测了促血小板生成素（TPO）和白介素11的表达水平。以上数据说明MSCs细胞可能会通过分泌造血刺激因子促使血小板水平的回复，如SDF-1、TPO和IL-11，这些刺激因子可能招募CD34t HSC和提供良好的造血微环境。aGVHD的累积出现率也比第二阶段高得多，在治疗组和对照组分别是51.8%和38.9%，其中cGVHD阶段的出现率分别达51.4%和74.1%（p=0.261）。
同时，我们也探索了Flk1+MSCs免疫调节作用的可能机制，发现Flk1+MSCs可能和各种免疫细胞或分泌生物活性因子有关。Flk1+MSCs还可通过抑制NF-κB信号转导路径而发挥环孢菌素A的免疫抑制作用（3）。在Flk1+MSCs细胞存在时，常规树突状细胞的水平有所下降，而浆细胞样树突状细胞的水平反而有所上升，因此Flk1+MSCs细胞会倾向于激活Th2类免疫细胞（4）。有趣的是，Flk1+MSCs细胞能促使成熟的树突状细胞分化为一种由Jagged-2
介导的调节性树突状细胞群，并且还不会出现细胞凋亡现象，这也有力地证实Flk1+MSCs细胞在器官移植预防排斥反应和自身免疫性疾病中具有重要作用（5）。研究还发现免疫功能有缺陷的BXSB小鼠经Flk1+MSCs干细胞移植后，能显著下调Th2细胞水平，进一步抑制体液免疫的非正常活化维持体内动态水平（6）。我们还制定出关于研究Flk1+MSCs干细胞在体内外中的免疫调节作用的实验原理图（见图1）。
图1. 外周血干细胞（MSCs）移植效应总汇图。MSCs能通过Jagged-1-notch信号转导路径有效抑制T淋巴细胞增殖和促炎症因子的分泌，同时还能分泌一些诸如PGE2和IL-10之类的细胞因子来抑制树突状细胞的成熟。因此，MSCs干细胞在缓解aGVHD 和cGVHD过程中可能涉及到通过免疫调节性T细胞和树突状细胞维持Th1/Th2水平。另外一种可能的机制是MSCs干细胞提高SDF-1、TPO和IL-11的表达水平来回复血小板水平。MSC：间质干细胞；HSC：造血干细胞；DC:树突状细胞；imDC：非成熟DC；maDC：成熟DC；regDC：调节性DC；pDC：胞浆样树突状细胞；cDC：保守性DC；GVHD:移植物抗宿主疾病。
总之，该研究说明Flk1+MSCs干细胞可作为治疗血液相关疾病的安全有效的治疗方案。此外，我们还进一步开展更多的临床试验研究其在其他领域中的应用。
胰腺小岛细胞的再生
糖尿病是危害世界公共健康的疾病之一，每年新增患者约7亿人。而在中国估计至少有3%的人群患有糖尿病。当前治疗糖尿病的首选方案是注射胰岛素，但是往往得不到很好的治疗效果。此外，胰腺或胰岛移植手术仍然存在，免疫排斥等问题。最近发现的胰腺管道结扎手术能促进胰腺再生现象可能作为糖尿病的治疗方法。
图1. （A）X线断层摄影术扫描胰腺组织切片可看到管道扩张（红色箭头）
（B）人胰腺组织切片经免疫荧光染色法，Ki76染色（红色）、胰岛素（绿色）、DAPI（蓝色），图中粉红色区域为Ki76和胰岛素双重着色的细胞，表示β细胞得到增殖。
即便人类出生后的胰腺β细胞数量有限，但有报道称胰腺在一些诸如胰腺切除手术或孕期等环境下分泌的一些化学物质具有再生能力。因此我们开展了一系列试验证明胰腺管道结扎是否会促进人类β细胞的增殖。我们采集了60位经惠普尔术式切除掉胰十二指肠患者的胰腺组织进行检测。所有患者的胰十二指肠壶腹部有肿瘤发生而导致胰腺管阻塞和扩张（如图1A所示）。同时采集了10位只接受胰腺手术而胰腺管正常患者的组织作为阴性对照组。所有样品均切成5μm的切片，并用Ki67（一种细胞增殖指示剂）和DAPI作染色处理。结果证实了胰腺管阻塞扩张组织的β细胞再生现象（如图1B所示）。其中有19位胰腺管阻塞扩张患者的β细胞显著得到增殖。紧接着又在C57BL/6鼠体内开展了类似的试验，动物试验组分为胰腺管脾脏部分结扎组和假手术组，分别在手术后1、3、5、7、14、28天或2、4、8月采集自脾叶末端到结扎部组织。检测后发现同假手术组相比，手术组的β细胞再生或Ki67显色的β细胞数量明显增多（如图2所示）。但两试验组鼠的空腹血糖浓度在手术前后差异不明显。上述试验结果表明鼠胰腺管部分结扎手术在一定程度上能促进胰腺β细胞的再生。
图2.（A）定量分析鼠β细胞再生情况。该柱状图表示Ki67显色阳性的β细胞占总β的百分比
（B）胰腺管道扩张后两月的组织染色切片（200x）。图中可见到胰腺组织全部由非功能的脂肪组织所代替，但伴随着有可见完整的内分泌功能和活化增殖的β细胞。
为进一步验证诱导性胰腺β细胞与母β细胞两者所处的微环境是否相似，我们又对上述组织开展组织结构观察。发现胰腺的外分泌功能组织被非功能性的脂肪组织替代，经部分手术后2个月完全覆盖了脾叶部位，使得胰岛远离胞外基质。根据组织病理学观察将其命名为“秋
天的柿子树”（如图2B所示）。慢性糖尿病患者作胰腺管结扎手术后并不引起胰腺组织的损伤，即使外分泌功能的组织去除后也不影响胰岛的正常功能（1-5）。
最近所谓的“代谢手术”得到广泛的应用。对于一些代谢性疾病来说，代谢手术代表了治疗手段从药物治疗到手术性干预治疗的趋势。现已知有三种普遍的术式：胃肠Roux-en-Y分流术（RYGB）、腹腔镜可调节带胃减容术（LAGB）以及胆胰分流术（BPD），三种术式均可影响食物的摄入和营养吸收（6-8）。肥胖症手术起初仅应用于肥胖患者，但据报道称该手术不仅会引起体重骤减和营养吸收不良，而且还会引起一系列诸如提高糖脂代谢甚至缓解2型糖尿病和高血脂等机体生化代谢的变化（6-8）。尽管试验的结果与机理还存在矛盾，但有学者提出一些胃肠道手术会引起肠道稳态的变化，主要是通过葡萄糖依赖的促胰岛素多肽（GIP）、葡萄糖样多肽1（GLP-1）和葡萄糖依赖的促胰岛素多肽受体（GIP）生化代谢途径（9，10）。另外有人认为肠道巨噬细胞和T细胞在调节机体稳态起着重要作用。事实上有人认为2型糖尿病属于一种促炎症反应性疾病，而2型糖尿病患者的免疫系统组份存在功能性障碍，从而影响了一些特异性细胞因子和趋化因子的表达水平（11）。上述研究中，胰腺管结扎扩张手术能引起鼠和人类胰腺β细胞的增殖。虽然具体的机制还需进一步探讨，但胰腺组织中外分泌组织的炎症反应过程可能与β细胞增殖有关。
总之，我们证实了胰腺部分管道阻塞能促进β细胞增殖。该研究揭示了构建人工“胰”可能依赖于胰腺组织的微环境的变化，以及去除外分泌功能细胞能促进β细胞的再生。
表皮基底细胞：仅适用于表皮组织再生吗？
众所周知，皮肤由两层组织组成（表皮层和真皮层），也人体最大的组织。皮肤包含几种不同类型的干细胞，如表皮干细胞、成黑色素干细胞、间质干细胞和神经样干细胞（1）。有证据表明表皮干细胞至少存在于三个部位：毛囊隆突部、皮脂腺基底层和上皮细胞基底层（2）。所有这些干细胞都可替代死亡或受损的细胞。
未分化的表皮细胞位于人体皮肤表皮基底层，这与滤泡间表皮的新陈代谢和受损皮肤再表皮化过程有关（2,3）。而分化的表皮细胞甚至可以在皮肤的慢性创伤条件下去分化形成表皮干细胞样细胞（4）。并且有报道称这些细胞具有与表皮干细胞相似的表型和功能（5）。
与其他皮肤干细胞相比，位于表皮基底层的角质细胞很容易地获取和体外培养增殖（6,7）。这是因为其可塑性较强，成体干细胞可作为多种组织再生治疗的细胞来源。虽然一些皮肤干细胞经诱导可分化为其他干细胞类型，并可能应用于组织再生领域，但也存在难以分离且培养周期长而数量有限的问题。
表皮基底细胞（EBCs）虽然数量众多，富含未分化细胞，但一直被人们认为除了能重建皮肤表皮外没有应用价值。最近发表的报道却反驳了这一观点，认为EBCs在一定条件下可分化为其他类型的细胞（8）。
为了排除毛囊源性干细胞干扰的可能性，人们对人包皮表皮细胞展开研究，研究其EBCs的多功能性。分离的EBCs经EpiLife培养基培养，该培养基仅能使皮肤角化细胞生长，促进EBCs的增殖，最终使其有效传代五代。最终EBCs经诱导快速达到表皮分化阶段。通过调整培养基比例能让EBCs的多功能性得以表达。经过3周的诱导性培养，EBCs分化为大量的平滑肌样细胞以及少量脂肪和神经样细胞。
图1. 注射鼠表皮干细胞小鼠肌肉受损病理模型对比图。（A）mEBCs组小鼠受损组织由大量过渡组织所替代，而在只接受溶剂注射的小鼠受损部位没有出现类似的修复迹象。（B）受损部位纤维化区域比较图。（C）纤维化区域经三色染色法染色，mEBCs组肌肉受损部位由再生性肌外膜（a）、微血管（b）和新生肌纤维（c）覆盖，而注射溶剂组肌肉受损部位纤维化区域大，愈合不全（箭头所示），肌纤维较细。染色为黄色的肌纤维（e）代表受损部位纤维化区域（白色虚线，C）。Sham: 假手术; Vehicle: 肌肉拉伤手术+溶媒注射组; mEBCs: 肌肉拉伤手术+鼠EBCs注射（mEBCs, 1×106）组。
鉴于其他成体干细胞具有可塑性特征，我们随之探索了EBCs除了用于表皮重建以外是否还可应用于组织再生。参考文献建立免疫功能缺陷型小鼠左胫骨前侧骨骼肌损伤病理模型（9）。试验分组如下：假手术组、肌肉拉伤手术+溶媒注射组和肌肉拉伤手术+鼠EBCs注射（mEBCs, 1×106）组。溶剂或细胞液单剂量注射入肌肉拉伤部位。一周后，mEBCs组小鼠受损组织由大量过渡组织所替代，而在只接受溶剂注射的小鼠受损部位没有出现类似的修复迹象（如图1A）。然而，进一步的分析表明mEBCs试验组小鼠肌肉受损区域与邻近组织区域之间已经没有明显界限（未提供数据）。三色教员染色法观察病理切片发现每组有超过10只小鼠在mEBCs注射治疗一周后会再度出现受损的肌外膜组织，其中富含微脉管（如图1B和1C）。同溶剂注射试验组相比，mEBCs治疗组小鼠肌肉受损部位的纤维化区域明显变小，而在受损部位底部观察到大量的肌纤维。有趣的是，在mEBCs治疗组小鼠肌肉受损部位移植能观察到纤维化区域有少量肌纤维，这说明注射EBCs能有效促进肌肉的生成，有效提高骨骼肌损伤修复的速率和效果。而具体的机理机制还有待于进一步研究。同时还说明EBCs在受损骨骼肌修复和再生中有着重要作用，而这些功能又可能依赖于其自身的旁分泌功能。像间叶干细胞这样能促进组织修复和再生的细胞分泌作用可能成为人们感兴趣的方向之一（10） 图2总结了EBCs在组织修复和再生中可能的应用方向。EBCs可塑性和多效分泌功能的发现为其在医学中的研究领域开启了新的道路。但EBCs的功能与细胞表型之间是否存在关系还不得而知，如果去分化的表皮干细胞样细胞拥有像EBCs相似的旁分泌功能，那么将会为组织修复再生研究提供比其他成体干细胞多而方便的细胞来源。
图2. 表皮基底细胞在组织修复再生领域的应用简图。
人类围产期干细胞库在再生医学领域中的发展与前景
干细胞的应用在再生医学领域有着重要的意义。因为同白细胞抗原（HLA）匹配的成人器官移植并不能得到有效推广应用，而源自几种胚胎围产期组织（脐带血、胎盘以及脐带）则可以作为未来器官移植治疗威胁人类健康的疾病的有力武器（1,2）。而建立不同来源的干细胞库是一种用于保存具有临床应用价值的多功能组织的有效方法。自2000年以来，我们一直从事脐带血造血干细胞（CB-HSCs）的建库工作（3），到目前为止，CB-HSC样品的库存约有15000份。以前因儿科患者数量多而影响到CB-HSCs移植手术，但最近有报道称胎盘富集很多HSCs（4），在2010年建立并开放胎盘HSC库，这将大大推进围产期HSC治疗成人患者的步伐。
MSCs的应用
间质干细胞（MSCs）是一种富含于人体所有组织的多功能干细胞，尤其是在围产期组织中（5,6）。科学家纷纷就MSCs开展了一系列临床试验发现其具有广阔的临床应用价值。在2006年，我们构建了一个高标准的围产期MSCs库，至今已保存有超过10000份，为对MSCs开展临床前和临床试验提供了充足的源泉（2）。同时还建立了一套标准化的细胞库构建程序，分别对待保存干细胞进行细胞表型、纯度、生物学功能、基因稳定性、肿瘤发生学以及微生物污染等方面的调查。为确保分离到的MSCs的安全性，还在小鼠和灵长类动物模型上进行体外试验。在致肿瘤性方面，不同剂量的围产期MSCs经皮下移植入NOD-SCID鼠，移植后三个月未发现肿瘤形成。不同处理组的猴子按2x106or 1x107个细胞/千克体重的剂量经静脉注射围产期MSCs，每两周注射一次，持续六周。试验发现细胞移植并没有任何毒性效应
（7）。随后，我们又进行围产期MSCs治疗多发性硬化和2型糖尿病患者的试点（8,9）。试验证明同种异型的围产期MSCs是有效安全的。对于治疗一些疑难杂症的临床试验还在进一步的策划当中。
HSCs移植
源自HLA匹配的姊妹的脐带血造血干细胞（CB-HSC）移植手术在儿童病例中得到验证，这也证明了建立自体或家系围产期干细胞库的必要性和适用性（1）最近，有一例患再生性
障碍贫血症（VSAA）的4岁儿童患者，接受了自体CB-HSCs和脐带MSCs移植手术。患者表现出皮肤斑点出血、口腔溃疡以及发高烧等症状。住院治疗期间，患者血液细胞数减少并伴发严重的全血细胞数减少症。医院采用骨髓穿刺活组织检查、染色体分析、血清学试验以及溶血试验确诊患有VSAA。具体的治疗方案见图1.患者在接受干细胞手术治疗36天后，临床症状得到显著缓解，造血功能全面恢复（图1B）。据我们所知，这是首次成功运用自体围产期HSC和MSC干细胞共移植手术治疗VSAA的报道。
图1. 再生性障碍贫血症的治疗方案。（A）接受干细胞移植手术前7到8天，环磷酰胺（CTX）40mg/kg/d，连用两天，然后接受干细胞移植手术前2到6天，免疫球蛋白2.5 mg/kg/d，连用5天。手术当天，患者接受5.31 x 108的脐带血造血干细胞（CB-HSCs; 含1.058 x 106CD34+细胞）和2 x 107的脐带间质干细胞（UC-MSCs）移植。手术前后均输入一定剂量的血小板和红血球。手术后5天到20天连续注射粒细胞集落刺激因子（G-CSF, 150ug/d）.（B）手术后36天，患者造血功能全面恢复。
总之，这些数据表明围产期干细胞库的构建为干细胞移植治疗奠定了坚实基础。
移植猪眼角膜等同于异体移植
眼角膜捐赠数量有限而导致供不应求是一个世界性的问题，在中国尤为严重。中国每年仅约有四千名患者能接受眼角膜移植术，另外还有四百万人排队等候。因此过去十年以来，人们就一直致力于寻求能人类眼角膜的替代物。而应用生物技术和组织工程学合成眼角膜则是一种较好的途径（1,2）。
眼角膜基质占角膜的90%，并且与视觉透明度有关。所以重建眼角膜基质在角膜组织工程学领域变得非常艰难。在此之前有报道称运用合成的高分子聚合物或天然胶原蛋白构建角膜，想要达到高视觉透明度和强度非常困难。因此，科学家纷纷转向研究其他物种，看看是否可用于人类眼角膜的重建。近年来，科学家发现猪眼角膜在厚度、拓扑结构学以及光折射稳定性方面与人类眼角膜颇为相似（3）。
然而，猪器官组织移植入人类必须要克服异体排斥的问题以及防止猪的病原微生物感染人类的可能性。再者，角膜不含血管而具有的免疫原性较低，将新鲜的猪眼角膜移植入人体也不会引起像肝脏或肾脏这样富含血管的器官所引起的高度免疫排斥现象（4）。相反，出现免疫
排斥的现象一般发生在移植后的两到四周内。据报道称，移除掉角膜细胞可降低异体组织排斥和病原传播的风险。随后，有关专家一直在探索培育出无细胞的角膜基质的方法（5-7）。虽然去除基质细胞组分的高效方法已有报道，但按此类方法得到的基质是否可用于移植还不得而知。原因有如下几点：第一，在去除基质细胞的同时会去除一些胞外基质，尤其是一些包括粘多糖（光蛋白聚糖和角膜蛋白）在内的可溶性基质更容易受到破坏，因为这些粘多糖对于维持角膜细胞表型和固定角膜基质非常重要。第二，可能会破坏角膜胶原纤维的正常结构，影响角膜透光能力，造成角膜移植后角膜组织传导性和角膜透光度的恢复速度减慢。第三，操作过程中都会使用较多的化学试剂，如洗涤剂或酶制剂的残留可能破坏机体正常组织
（8）。此外，因此过程步骤繁多耗时，存在许多不可控制的因素。
因此，为保护眼角膜基质天然结构，诸多学者认为尽量避免较多的实验操作，所以我们也认为没有必要去除角膜基质细胞。而失活角膜基质细胞则可能更为有效地培育出符合角膜组织工程学的叫角膜基质。原位失活的角膜基质细胞引起的免疫反应性较弱，而且这些死亡的细胞在移植后的一段时间内即可自动消退而在机体组织融合期间减弱免疫排斥反应。最近的一项研究表明，用脱水的猪眼角膜移植入恒河猴角膜后引起较低的免疫排斥现象（9），这也证明了猪眼角膜移植到人体时，角膜基质中残留的死亡细胞可能不会到来太大影响。
在这样的背景下，我们探索出一种快速简单的方法处理猪眼角膜。首先用细胞刮刀去除新鲜猪眼角膜上皮组织和内皮组织，然后放入液氮冻存1小时再解冻10分钟，重复三次使得角膜基质细胞失活，随后放入冷冻干燥机脱水8小时。最后将猪眼角膜暴露在放射性剂量为25kGy的钴60中杀菌备用。
图1.
首先在试验兔上做眼角膜基质免疫原性试验，经皮下移植处理好的猪眼角膜，发现未处理过角膜基质细胞的实验组在四周内均出现免疫排斥现象，而在角膜基质细胞失活处理的试验组均未出现免疫排斥现象（持续观察8个月）。随后进行大规模试验进行验证，将处理过的猪眼角膜在Hank’s平衡盐缓冲液中水化10分钟，使其成为直径5mm，厚度200um的薄片组织。经手术移植入试验兔，含活细胞的新鲜猪眼角膜作为对照。研究发现猪眼角膜直接移植的试验兔在2-12周出现免疫排斥现象，而处理过的眼角膜移植试验兔并未出现免疫排斥。
细胞失活的猪眼角膜还能保持较高的视觉透光度，而未经处理的眼角膜基质则出现视觉模糊和新生血管。组织切片检查失活角膜基质细胞试验组组织，可见到正常上皮细胞核基质细胞，两者组织界限不明显，而对照组组织切片可见到上皮细胞过度增生，基质部有多量细胞侵润，基质厚度明显增厚（图1）。
图2.
课题组进行了第一例人体移植，将猪眼角膜一直到人的眼中。发现5天后移植部出现再上皮化组织。术后3个月上皮组织下有神经丛发育，术后15个月体内共聚焦显微技术可观察到角膜基质细胞生成（图2）。因此，猪眼角膜移植在技术上已经成熟，将会加快进程，让这项技术走出实验室，成为产品，让更多的角膜病人重见光明。
组织工程学：中国再生医学研究的
再生医学在中国：必要性与研究成果
中国拥有超过13亿人口，迫切需要开展组织修复与再生医疗技术研究，服务于广大民众卫生保健的需求。据国家卫生部报道，在城镇地区因机体损伤、意外事故或者其它因素导致的人数占住院治疗人数的9%，该比例仅次于呼吸道疾病（12%）和消化道疾病（10%）。包括遗传性疾病、代谢性疾病和慢性疾病等原因导致的创伤，据估计每年大约有超过1亿的病人需接受组织修复和再生性治疗。
再生医学在中国甚至全球都是一个历史悠久的医疗话题，拥有深刻的现代意义。过去20几年来，科学家在遗传学、发展生物学、干细胞生物学以及组织工程学等领域取得了重要研究成果，逐步提高了我们对再生医学的认知，并将有关研究成果用于临床治疗。在中国，这些学科的融合促使组织修复与再生医学成为医学研究与治疗中最活跃的领域之一。有关基础性研究成果正逐步应用于临床并改变着医疗方式。
在中国，有三大领域发展得尤为迅速：干细胞生物学、组织构造与再生以及创伤性治疗的组织工程医疗产品的研究。如近年来通过利用诱导性多功能干细胞（iPSCs）产生的复制性四倍体胚胎互补性iPS小鼠。同时，成体干细胞的分离与培养技术的发展使得因外伤或糖尿病引起的血管损伤后皮肤汗腺的再生。组织工程学领域也取得一些进展，尤其是在自定义矩阵以及机体相关调控因子功能的认识等领域，使得骨组织、软骨组织、神经组织、血管以及肌腱能够重建。且相关研究成果已进入临床试验阶段，试验结果令人欣慰。创伤的愈合阶段要达到机体不同组织的同步再生是一个关键性研究领域，科学家正在探索防止疤痕形成的方法，包括利用皮肤干细胞不需经过iPSC阶段而直接分化成不同组织类型的技术方法。
在中国开展的再生医学研究紧跟全球医学研究趋势，并且逐步将基础性研究理论转化为临床应用。国家政府也非常重视再生医学的研究。由中国科学院和中国组织工程学中长期发展战略研究规划的“2050蓝图”中，将再生医学列入重点发展方向。另外，中国国家食品与药品监督管理局已在组织转移性治疗技术管理章程中将干细胞研究列为三级医疗技术。此外，在2005年和2010年召开的香山科学会议中，均对再生医学研究中的研究成果与需注意的问题展开讨论，为国家政府继续支持和资助再生医学研究奠定了坚实基础。
在接下来的十年间，中国将开展以下再生医学领域的研究：运用诱导性干细胞技术开展不同组织类型的协同修复与再生研究；运用组织工程学开展大型组织的重建以及组织工程学医疗产品的大规模应用。以上研究成果均为医疗服务的提高灌注了希望，将开创一个更健康和谐的社会。
付小兵，博士，中国工程院院士。中国人民解放军总医院基础医学院组织工程学重点实验室室主任。
第一部分 干细胞与再生
多功能干细胞的发展及其价值
干细胞治疗非常有潜力取代其他对细胞有损伤的治疗方法。虽然免疫排斥一直有待于解决，但通过运用体细胞核转移技术建立源自病人自体细胞的同源胚胎干细胞系是一中具有可行性的方案。这种体细胞核转移技术生成的胚胎干细胞，且使其分化为所需特定细胞类型，用于疾病治疗，称之为治疗性克隆。现已成功培育出小鼠核转移胚胎干细胞，且没有发现这种核转移胚胎干细胞与常规胚胎干细胞存在任何显著的差异。但是，体细胞核转移技术还有待于进一步成熟。因此，科学家正试图改良重构胚的培养条件，发现连续性培养法（细胞核转移阶段用M16培养介质，而在后两个细胞生长阶段用KSOM培养介质）可明显提高囊胚的生长速度。同时，也尝试通过使用小分子添加剂提高克隆效率，如使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂CBHA，可显著提高SCNT重构胚技术中的囊胚生长速度（表1）。另外，同常用的组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A相比，CBHA还可提高囊胚的质量。
卵母细胞来源问题一直阻碍着人类治疗性克隆研究进程。我们正在探索重组受精胚胎的可行性。研究发现有丝分裂期间捕获到的小鼠2细胞期胚胎，经电转导融合后能有助于细胞核重组，从捐赠者胚叶细胞到体细胞均有效。研究表明，运用2细胞期电转导融合小鼠胚胎的技术，培育出源健康足月的母乳的克隆幼仔以及多功能胚胎干细胞，而胚胎或体细胞均源自捐赠者（3）。这种研究方法表明植入前胚胎可能成为人类治疗性克隆的重要资源。
要将治疗性克隆技术从小鼠推广到人类，我们已经在这方面做了一系列研究。根据卵细胞形态学评估标准，我们已将分裂期Ⅱ的卵母细胞分成四个阶段。从中发现胚胎能从A和B阶段的卵母细胞发育到囊胚阶段。但出于C和D阶段的胚胎却不能发育到囊胚阶段，大多数胚胎细胞均停滞在2-4细胞期（4）。而在国内，人们常把绝大多数的卵母细胞均分类到C和D阶段，者也许是造成治疗性克隆失败的原因。我国已将人类卵母细胞培育到囊胚阶段，并且还运用人类包皮细胞器从这些胚胎细胞中派生出一些人类单性生殖胚胎干细胞。胚胎干细胞具有正常的形态，能正常表达各种特定干细胞表面标记物，并且还能分化成三种胚芽层的派生物。这些技术的发展均能推动我国治疗性克隆的研究和临床应用（5）。
2006年，我国科学家通过转录因子的表达成功从小鼠体细胞分化出鼠胚胎干细胞样诱导多功能干细胞，这是一个开创性的研究成果（6）。但诱导胚胎干细胞所具备的多功能性是否与其胚胎干细胞所具有的功能一致，起初还不得而知。此外，通过四倍体互补分析技术培育出的动物还未经证实，且经严格审查证明这些细胞并非完全具有多功能潜能。现已经改良培育技术，能在一个月内诱导培育出iPSC，同时还能从鼠胚胎细胞和成纤维细胞派生一系列iPSC细胞系。这表明源自体细胞的iPSC拥有像胚胎干细胞类似的全能性（7）。为找到一种能有
效快速地评价iPSC细胞的多功能性，我们从不同多功能水平进行了比较。我们鉴别了一个叫Dlk1-Dio3区域，它位于鼠基因组的保守性压印区，在全能性鼠干细胞被激活而在部分多功能干细胞中被抑制，可作为干细胞多功能性的标志（8）。
安全问题一直在iPSC临床应用中受广泛关注，我们通过四倍体互补分析技术观察成年iPSC的小鼠来评估iPSC是否有潜在的致瘤性。我们再iPSC F0代小鼠中鉴定出23.1%的致肿瘤的细胞，但在ESC诱导的小鼠中未发（表2），证明这些iPSC具有肿瘤倾向。用定量PCR的方法验证4个iPSC诱导因子（c-Myc, Klf4, Oct4 和Sox2）的内源性和转基因表达水平。研究发现在iPSC诱导的小鼠中，c-Myc活性因子的表达水平在肿瘤组织中明显高于肺肿瘤组织（P
再生医学领域种间嵌合体的应用
多功能胚胎干细胞或诱导型多功能干细胞近年来一直受到医学领域的广泛关注，这很大程度上是由于其具有潜力分化成各种特定的细胞，用于细胞治疗（1，2）。但干细胞的体外分化过程中同样存在以下主要问题：（1）因为体外培育不能模拟体内高度复杂的环境，而导致只能产生有限的细胞类型；（2）体外培育分化出的细胞类型可能与与体内组份不同。（3）在体外培育出高度复杂的组织器官似乎看起来不大可能。
其中有一种方法可能解决以上问题，比如说在囊胚期出于分化阶段时将其进行替换。但是，由于受伦理道德和可操作性的限制，不能将人类胚胎干细胞或诱导型多功能干细胞替换进入人类囊胚中。鉴于此，我们希望能够找到在不同物种囊胚期分化出ES/iPS。
有报道称通过在两个不同物种间聚合早期胚胎培育出中间嵌合体的可行性。现已获得三种嵌合体：小家鼠和卡氏小鼠；绵羊和山羊以及牛和印度牛（3-6）。而在这些嵌合体中，两个物种间在亲缘关系非常近，基因组差异性低于3%。因此，通过胚胎细胞融合技术是否能将进化关系远的两个物种作为亲本培育嵌合体还不得而知。我们首先从森鼠体内获取的胚胎干细胞，拥有48染色体核型态，且可表达一些多功能性标志物，包括碱性磷酸酶、Oct4, Nanog, 和Rex1（图一A）。随后又发现森鼠胚胎干细胞经体外培养能够形成拟胚体，最后分化成三种胚芽层（7）。进一步的研究证实将森鼠胚胎干细胞注入裸小鼠会形成畸胎瘤，经组织病理学检查也发现畸胎瘤组织中存在三种胚芽层组织（7）。
随后我们又通过显微注射法将森鼠胚胎干细胞引入鼠囊胚，其中有繁殖出的小鼠里约7%属
于嵌合体小鼠，它们的被毛颜色不一（图1B）。另外，将绿色荧光蛋白标记的森鼠胚胎干细胞注入受体小鼠体内，有可见绿色荧光（图1C）。所有出生的嵌合小鼠均健康活跃。此外，解剖嵌合小鼠发现，内部脏器均发出可见的绿色荧光，这些组织有脑部、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、脾脏、膀胱、肺脏、肝脏、胃、小肠以及睾丸（图1D）。通过对嵌合体小鼠进行竞争性PCR，发现森鼠的细胞分别在多种组织中。这种细胞类型在一些气管如脑部和肌肉中的分布高达30-40%。一些嵌合体小鼠精液中也有5%的森鼠细胞类型，也就是说森鼠胚胎干细胞可能控制繁殖细胞系。此外还发现携带有绿色荧光蛋白的细胞能分化成多种功能性细胞，如神经细胞、寡树突胶质细胞、星形胶质细胞、神经干细胞、心肌细胞、内皮细胞以及角质细胞（如图2所示）。
该研究结果具有以下意义：（1）森鼠胚胎干细胞能完全同鼠囊胚细胞群整合，尽管两物种间进化关系遥远，仍产生了嵌合体。（2）这些嵌合体小鼠个组织脏器中森鼠细胞类型均有高达40%的分布率。（3）该胚胎干细胞还能精确分化为多种细胞类型，并且还可与宿主组织融合。这些研究结果说明通过将ES引入亲缘关系较远的动物，能在体内分化成特定的细胞类型，具有一定的可行性。
运用遗传学原理进一步证实胚胎干细胞或宿主囊胚在理论上能增强或抑制胚胎干细胞分布在特定组织器官的比例。例如，将宿主囊胚人为地基因突变，会阻碍组织的定向发育（如Pdx1基因突变导致胰腺发育不良）。最近，Kobayashi等证实将鼠iPSC注入Pdx1基因缺失的小鼠囊胚中，会产生具有功能性的胰腺组织（9）。相反，如果ES细胞经人为改造携带有能抑制本身分化为特定细胞系的基因，ES细胞将不会在嵌合体组织中分布。例如，敲除控制ES细胞分化成神经组织的基因，将会抑制ES细胞进入脑部，这在一定程度上可以避开伦理学问题。
由于细胞生存率低和特异性分化能力弱，干细胞的总体效用和临床运用很大程度上受到限制
（1）。最近的研究显示，利用体外分化和去分化技术重组间充质干细胞，能提高其在体内治疗的效果。
最近的研究也表明，运用基因重组可在体外使得终末分化的哺乳动物细胞经去分化转变为诱导型多功能干细胞（2）。由此可见，这些重组细胞具有特异性再生治疗的潜能，但iPSC的所具备的治疗潜能受诸多因素的影响，如低效率、免疫原性、重组失误以及基因不稳定性导致癌症的发生等等（3）。
究竟在没有基因干预的条件下诱导细胞去分化，最终获得具有治疗潜能的重组干细胞能否成为可能，我们对此展开了系列调查。当研究成年鼠骨髓间充质干细胞的可塑性时发现这种细胞在体外出现去分化现象（4）。在体外经诱导和分化的5羟色胺敏感性神经元，在去掉神经元诱导介质后能装变为形态和表型上与间充质干细胞类似的细胞。这些去分化的MSC细胞在体外可经进一步的诱导型增殖，最终分化为5羟色胺敏感性神经元，这意味着这些成体干细胞的可塑性要比过去想象的要好。随后又有证据表明单克隆的MSCs能分化为亲缘关系远的细胞系（5,6）。所以干细胞的直接分化毫无疑问地成为MSC可塑性研究的主要手段，而去分化则是改变细胞命运以及再分化为其他细胞系的先决条件，如从神经元分化为内皮细胞，反之亦然（6）。在体外研究细胞的分化命运时发现一个有趣的现象：经理去分化的干细胞表现出较强的分化潜能，也就是说当干细胞进入再分化阶段时，倾向于分化为神经元干细胞，并且神经元的标志物表达水平也随之提高。以上说明去分化的MSC可能与原始MSC细胞类型具有差异性。
图1. 散点图表示用鼠全基因组微阵列方法检测的DeMSCs和MSCs中不同基因的差异性表达水平。红色表示DeMSCs上调基因（650/41012,1.5%）；绿色表示MSCs下调基因（1240/41012,3%）；黄色标志基因表达水平差异不显著。
最近，我们对去分化的MSC的特征展开研究，并且将其与未分化的MSC进行比较（7）。研究发现去分化的MSC保留其免疫表型特征和中胚层结构，进一步的基因表达水平分析发现有650（1.5%）个基因的表达水平上调，1240（3.0%）个基因表达水平下调，这远远是未分化的MSC细胞基因表达水平的2倍（如图一所示），也就是说去分化的MSC细胞是经过重组编程的。此外，还发现84个与细胞凋亡信号相关额基因中有13个基因的表达水平有很大差异，去分化的MSC细胞中bc1-2家族蛋白的表达水平也上调。去分化的MSC细胞的生存指数研究也表明在氧化应激的条件下，去分化的MSC细胞能分化为多种细胞类型。我们还发现在去分化的MSC细胞中的神经元标志物的表达水平要比未分化的MSC细胞中的表达水平高，这就是说去分化的MSC细胞保留着神经元细胞的某种特性，可能在分化为神经元细胞。这种去分化的MSC细胞具备以上特征能够持续传代3到4代，我们对此展开了去分化的MSC体内治疗的研究，比如以缺氧缺血性脑损伤为模型（HIBD，一种当前无法治疗的慢性神经性损伤疾病）（8）。研究结果显示移植3天后，均能在注射部位检测到绿色荧光蛋白标记的MSC和去分化MSC细胞，但第七天时只能检测到去分化MSC细胞的踪迹（如图2A,2B所示），这也再次证实了去分化MSC细胞拥有较强的神经元分化能力。更重要的是，用穿梭试验来评估小鼠的认知能力显示：经去分化MSC治疗的小鼠表现出的认知能力比MSC治疗的小鼠强。总之，MSC细胞具有可重组性，通过人为干预性操作课具有体内治疗潜能。
图2. 试验设计原理及HIBD病理模型的治疗效果。为促使神经元的分化，鼠骨髓源性的单克隆MSCs首先
经由DEME/F12/10%FBS/10-7M, ATRA以及10 ng/ml de bFGF组成的介质预处理。所有细胞用PBS洗涤后转移至神经元诱导介质(MNM, DEME/2% DMSO/200Um; BHA/25Mm, KCl/2mM,丙戊酸10uM, 司克林1uM,氢化可的松5ug/ml 胰岛素)中培养24-48h。建立HIBD病理模型5天后，将GFP-MSCs or GFP-DeMSCs注入小鼠右后侧脑室。细胞移植后7天在脑部并未检测到GFP表达的MSCs（A），而在DeMSCs处理的小鼠脑部检测到强烈的绿色荧光（B）。穿梭试验评估小鼠学习记忆能力发现经细胞移植1到2个月后，经去分化MSC治疗的小鼠表现出的认知能力比MSC治疗的小鼠强。
该研究为MSC介导的细胞治疗提供的一个新颖、具有临床实用价值的研究方法。与iPSC相比，去分化诱导的细胞重组可能是再生医学领域一种更简便、安全有效的治疗途径。有趣的是，诱导iPSC的基因在去分化MSC细胞中的变异性不大，说明两者之间存在不同的机理机制。特别是miR-34a基因的表达水平上调，与细胞存活和分化为神经元有关，这暗示在干细胞重组干预中还涉及到表观遗传学机制。进一步的研究将提高MSC细胞的体外重组效率，最大化去分化MSC的治疗效果，因此有望成为再生医学领域中的一种新型有效的治疗策略。
非人类灵长类动物：重要的再生医学动物模型
世界上有超过400多种非人类灵长类动物（NHPs），中国作为拥有为数不多的野生非人类灵长类动物栖息地国家之一，也是24种非人类灵长类动物的故乡。NHPs 与人类之间的基因关系比其他动物近。并且在生理解剖学方面与人类非常相似，特别是中枢神经系。因此，NHP可作为人类研究人类疾病的唯一理想的动物模型。过去二十年来，干细胞领域取得的长足进步已经离用工程细胞替换受损组织的目标更进一步。然而，基于多功能干细胞的治疗方法应用到临床之前还有许多科技问题急于解决（1）。而干细胞治疗的安全效果评估须通过NHPs动物试验，才能进入人类临床试验阶段，因此NHPs作为一种理想的模式动物。
当前，人工饲养NHP数量最多的当数美国和中国。仅中国就有总数超过二十万的猴子，起主要有恒河猴和猕猴组成，而中国的饲养条件已达到国际动物福利标准。如专长于NHP疾病模型的开发与合作研究的昆明生物医学国际，因其拥有世界一流的NHP饲养管理条件，已获得国际实验动物评估认证管理委员会（AAALAC）的认证。以下三个例子说明中国NHP研究概况。
基因组学研究进展
随着基因组测序技术的快速发展，NHP基因组测序工作已开始，如经过中国西南地区几个研究小组的合作研究，已将中国恒河猴和食蟹厚的全基因组进行测序（2）。该两种动物是生物医学领域常用的NHP动物模型，特别是在神经科学、药物开发领域、人类疾病有关的可用药物控制基因同源序列和人类错配等位基因的鉴定，除此之外还有新型药物的开发等。此外，人类与NHPs的相似之处还表现在细胞水平上。最近的研究证明恒河猴胚胎干细胞的microRNA特征与人类非常相似，相似度远远超过了小鼠，说明运用NHPs作为细胞治疗临床前动物模型具有可行性（3）。
母婴过早分离的研究
关于人类早期心理承受力模型的最新研究表明，恒河猴母婴过早分离能导致下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱和行为异常，这种有害效应是否能通过后天社会生活得到纠正还不得而知。在这项研究中，我们比较了经1.5年和3年正常社会生活的由母亲抚养和由同伴抚养的恒河猴的皮质醇水平（年龄分别是2岁和3.5岁）。结果表明由同伴抚养的猴的毛发皮质醇水平要比有母亲抚养的猴的毛发皮质醇水平低。而血浆皮质醇水平测试发现受强烈压力下的由同伴抚养的猴的皮质醇水平出现顶峰的时间后延。另外，由同伴抚养的猴经过3年的正常社会生活也会出现行为异常的现象。由同伴抚养的猴还出现运动迟缓和打堆现象，同时还出现一成不变的行为（重复性的动作，包括踱步、允吸、自挠、摇摆身体、跳跃以及吧唧嘴）（如
图1所示）。这些试验结果首次证明与啮齿类动物相比（4,5），由母亲抚养的恒河猴的毒性效应持续时间长，且经正常社会生活不能得到补救（6）。因此，由母亲抚养的恒河猴可作为人类早期不利成长环境的理想动物模型。
图1. 由同伴抚养和猴（n=13,11）与由母亲抚养的猴(n=22,20)头发皮质醇水平比较（ug/dL,mean with±SEM）。A图表示2岁，B图表示3.5岁。C图表示3.5岁试验猴持续性的一成不变的行为比较，D图表示3.5岁试验猴的坐姿行为比较。以上结果显示由母亲抚养的恒河猴的毒性效应持续时间长，且经正常社会生活不能得到补救。
转基因NHPs的研究
转基因技术的运用使得人们可以诱导NHPs发生与人类有关的疾病或症候群。该研究增进了我们对遗传疾病病因的认识，并且有望发展成为一门新型治疗策略。到目前为止，关于培育转基因猴的报道甚少（7-9）。猴转基因的效率低下是当前转基因治疗的绊脚石。最近，我们探索出一种培育转基因恒河猴的方法，该方法主要运用了编码增强型绿色荧光蛋白的猴免疫缺陷病毒（SIV）为基础的慢病毒载体，以及感染早期卵裂阶段胚胎的方法。重要的是，转染胚胎并不影响其发育。此外，在胚胎基因组激活之前或之中进行转染并不影响转基因表达的水平和稳定性。其中还从三重受孕的母体获得了一个转基因胎儿。另外，从四个单独受孕的母体获得了4个胎儿，其中有两个全身带有增强型绿色荧光蛋白标记（如图2所示）（10）。这些结果表明SIV载体培育转基因猴的可行性及其在非人类灵长类动物转基因技术中的有效性。当前我们正探索用于人类神经退行性疾病（帕金森和阿尔茨海默病）的转基因猴。
图2.转基因恒河猴。A图表示带有荧光标记的转基因猴（2岁）；B图表示共聚焦显微技术分析转基因猴冰冻切片GFP表达水平（绿色）：脑(a), 肝脏 (b), 气管 (c), 心脏 (d), 胃(e), 肾脏 (f) 。
运用动物模型子宫移植研究干细胞生物学
小鼠胚胎干细胞（ESCs）首次在1981得到分离（1,2），而人类多功能干细胞则是在1998年从囊胚中培养而来（3）。随后因其在疾病治疗和再生医学领域得到广泛研究和运用。2006年，诱导型多功能干细胞的分离有望作为个性化治疗的工具（4）。分离自内源性细胞群的ESCs可作为体外早期胚胎研究的有力工具，但其在体内的分化、分布以及多功能干细胞的迁移等方面还不得而知。通过干细胞移植建立动物模型可能是一个研究以上过程的有用步骤。
运用子宫干细胞移植技术在同源性或异源性细胞水平上研究多种组织迁移和分化功能，为建立动物模型探究体内移植干细胞的生物学功能奠定一定的基础。简单的说来，运用超声波技术（能显示腹膜腔的横断面）或剖腹技术将同源性或异源性细胞注射入经孕育45-55天（孕期为145天）的山羊胎儿的腹膜腔内（如图1所示）。与剖腹手术相比，运用超声波技术建立子宫干细胞移植模型有着较低的流产率（5）。这将是一种安全有效的方法。运用该技术已将包括人类造血干细胞、鼠胚胎干细胞以及鼠诱导型多功能干细胞在内的多种干细胞类型移植入山羊胚胎（5-7）。
图1 子宫移植法构建体内干细胞动物模型的实验步骤。
通过移植人脐带血细胞建立重组山羊模型时得到如下研究结果：将移植细胞作GFP标记后移植入受体山羊体内，通过GFP荧光技术、荧光活化细胞分选技术以及免疫组织化学法均能在不同器官检测到带GFP标记的细胞，这些器官有肾脏、肌肉、脾脏、心脏以及肺脏（如图2所示）。此外还发现所有组织中均检测到带GFP标记的细胞具有成簇分布的特征（如图2D所示）。经PCR技术检测人类特异性基因证实了人类细胞在受体山羊组织中确实存在（如图2 A所示）。经RT-PCR技术和IHC技术分析表明了不同造血干细胞和非造血干细胞器官中人类组织特异性RNA和蛋白质已得到表达，这些器官包括肺脏、肾脏、脾脏和肝脏（如图2B、2C所示）。而血液和肝脏组织中全基因组RNA表达水平的检测也证实了人类基因在受体山羊中表达。
虽然人类/山羊重组体的出现为活体组织干细胞生物学研究提供了理想的动物模型。但是 ，在这个条件下转基因干细胞的生物学功能研究受其具有异体基因背景的影响。为避免这种情况的出现，一种经同源性干细胞移植的转基因小鼠已经培育。因其具有体积小、饲养周期短以及遗传背景清楚的特征，小鼠可作为体内干细胞生物学研究的候选动物模型。通常将怀孕中期（怀孕14.5天小鼠的干细胞群经腹腔手术的方法注入胚胎体内。现已发展出一种新型子宫内移植方法和经改良的手术方法，运用该法已成功实现孕12.5天小鼠的干细胞移植，这是一门重要的技术攻关，提高了培育转基因小鼠的效率（8）。
图2. 重组干细胞山羊模型的分子水平分析（引自参考文献7）.
运用经人工或自然突变的干细胞注入健康胚胎可用同源性或异源性细胞移植法培育出特定的病理模型。通过移植人类脐带血细胞Lin-CD34+如胚胎山羊子宫内，在转化过程中携带BCR-ABL逆转录病毒，可构建慢性粒细胞白血病（CML）动物模型，能有效模拟CML早期病理状态（未发表），并有望作为CML病理机制和药物开发研究的理想工具。
如果将健康干细胞注入易感胎儿体内，能保护动物免受疾病感染，该疗效可使得IUSCT作为遗传病产前治疗的工具，或者保护胎儿免受组织损伤。例如以经化学试剂CCl4诱导肝脏损伤的小鼠为例，子宫移植的造血干细胞分化成为人类肝样细胞过程中，经检测证实其可表达人类肝脏特异性蛋白以及参与肝脏组织损伤的部分修复（9），这为人类肝细胞样细胞的再生研究提供了新的方法。同时也表明了子宫移植技术可用于肝脏疾病或损伤的治疗，具有良好的治疗前景。
总之，通过IUSCT建立的重组动物模型为研究免疫耐受和干细胞移植、归巢、分化、基因表达以及非病理条件下的可塑性研究提供了新的工具。同时也有助于多数人类遗传病产前诊治或细胞组织修复、异体器官移植的预防。相信在不久的将来，随着干细胞生物学的深入研究，IUSCT技术将成为基因缺陷和疾病的临床治疗的再生医学诊治方法。
骨间质干细胞在再生医学领域的治疗前景
间质干细胞是成体干细胞中的一种，过去十年以来在再生医学领域引起极大关注（表1）。我们已分离培养出介质选择性细胞亚群（Flk1+CD44+CD29+CD105+CD166+CD34
-CD31-Lin-），即Flk1+MSCs。这些细胞亚群均为多功能干细胞，具有一定增殖能力和免疫调节功能。为探索其在疾病治疗中的应用价值，我们首次在体内外开展安全试验。研究发现Flk1+MSCs注入小鼠体内后没有致畸瘤性，并且还可分泌DKK-1因子抑制恶性细胞增殖
（1）。我们分别从恒河猴和人骨髓分离并增殖Flk1+MSCs，随后将其移植入恒河猴和人类志愿者体内。而在细胞融合过程中没有发现受体出现异常现象。实验室检测血液、骨髓、肾脏以及肝脏功能，发现经细胞融合后并不引起各组织器官功能的改变（2）。Flk1+MSCs是首次经中国食品与药物监督管理局批准的干细胞产品。
表1. MSC的有关临床应用统计表
证实Flk1+MSCs细胞的安全性后，我们开展两个临床试验评估其疗效。第一个试验探索出一种将外周血干细胞与Flk1+MSCs细胞结合的新型策略，其能提高移植效率和避免出现一系列移植物抗宿主疾病。33位恶性白血病高危病人接受拥有正常T细胞功能的人类白细胞抗原（HLA）外周血干细胞的移植手术，1到2个月以内，所有的病人都完成了不同程度的细胞融合。血液学分析发现中性粒细胞在干细胞移植手术后11天达到超过0.5x109/L，血小板水平在14天后超过20x109/L。15位病人患I–IV级移植物抗宿主病（45.5%），仅有2位病人从III 级过度到IV级（6.1%），而从29位患者中发现有9位病人患有慢性移植物抗宿主病（31%）。同时观察至60个月还发现20位病人幸存下来（20%），6位病人复发了白血病（18.2%）。这样算来三年存活率仅为57.2%。
第二项研究是开放性的二期临床试验，其目的在于评估外周血干细胞移植过程中MSC融合结果（3–5x105 cells/kg）。接下来一年，我们将55位白血病患者随机分为治疗组（27人）和对照组（28人）。MSC细胞融合后并没有立即发现负面效应，中期比较两组间白细胞和血小板水平的恢复情况。然而，治疗组中患者的血小板回复水平（大于50x109cells/L）要比对照组患者血小板回复水平快得多（分别是第22天和28天，p=0.036）。基质细胞衍生因子（SDF-1）表达水平也比对照组到达顶峰的时间快得多（分别是第8天和第16天）。此外还检测了促血小板生成素（TPO）和白介素11的表达水平。以上数据说明MSCs细胞可能会通过分泌造血刺激因子促使血小板水平的回复，如SDF-1、TPO和IL-11，这些刺激因子可能招募CD34t HSC和提供良好的造血微环境。aGVHD的累积出现率也比第二阶段高得多，在治疗组和对照组分别是51.8%和38.9%，其中cGVHD阶段的出现率分别达51.4%和74.1%（p=0.261）。
同时，我们也探索了Flk1+MSCs免疫调节作用的可能机制，发现Flk1+MSCs可能和各种免疫细胞或分泌生物活性因子有关。Flk1+MSCs还可通过抑制NF-κB信号转导路径而发挥环孢菌素A的免疫抑制作用（3）。在Flk1+MSCs细胞存在时，常规树突状细胞的水平有所下降，而浆细胞样树突状细胞的水平反而有所上升，因此Flk1+MSCs细胞会倾向于激活Th2类免疫细胞（4）。有趣的是，Flk1+MSCs细胞能促使成熟的树突状细胞分化为一种由Jagged-2
介导的调节性树突状细胞群，并且还不会出现细胞凋亡现象，这也有力地证实Flk1+MSCs细胞在器官移植预防排斥反应和自身免疫性疾病中具有重要作用（5）。研究还发现免疫功能有缺陷的BXSB小鼠经Flk1+MSCs干细胞移植后，能显著下调Th2细胞水平，进一步抑制体液免疫的非正常活化维持体内动态水平（6）。我们还制定出关于研究Flk1+MSCs干细胞在体内外中的免疫调节作用的实验原理图（见图1）。
图1. 外周血干细胞（MSCs）移植效应总汇图。MSCs能通过Jagged-1-notch信号转导路径有效抑制T淋巴细胞增殖和促炎症因子的分泌，同时还能分泌一些诸如PGE2和IL-10之类的细胞因子来抑制树突状细胞的成熟。因此，MSCs干细胞在缓解aGVHD 和cGVHD过程中可能涉及到通过免疫调节性T细胞和树突状细胞维持Th1/Th2水平。另外一种可能的机制是MSCs干细胞提高SDF-1、TPO和IL-11的表达水平来回复血小板水平。MSC：间质干细胞；HSC：造血干细胞；DC:树突状细胞；imDC：非成熟DC；maDC：成熟DC；regDC：调节性DC；pDC：胞浆样树突状细胞；cDC：保守性DC；GVHD:移植物抗宿主疾病。
总之，该研究说明Flk1+MSCs干细胞可作为治疗血液相关疾病的安全有效的治疗方案。此外，我们还进一步开展更多的临床试验研究其在其他领域中的应用。
胰腺小岛细胞的再生
糖尿病是危害世界公共健康的疾病之一，每年新增患者约7亿人。而在中国估计至少有3%的人群患有糖尿病。当前治疗糖尿病的首选方案是注射胰岛素，但是往往得不到很好的治疗效果。此外，胰腺或胰岛移植手术仍然存在，免疫排斥等问题。最近发现的胰腺管道结扎手术能促进胰腺再生现象可能作为糖尿病的治疗方法。
图1. （A）X线断层摄影术扫描胰腺组织切片可看到管道扩张（红色箭头）
（B）人胰腺组织切片经免疫荧光染色法，Ki76染色（红色）、胰岛素（绿色）、DAPI（蓝色），图中粉红色区域为Ki76和胰岛素双重着色的细胞，表示β细胞得到增殖。
即便人类出生后的胰腺β细胞数量有限，但有报道称胰腺在一些诸如胰腺切除手术或孕期等环境下分泌的一些化学物质具有再生能力。因此我们开展了一系列试验证明胰腺管道结扎是否会促进人类β细胞的增殖。我们采集了60位经惠普尔术式切除掉胰十二指肠患者的胰腺组织进行检测。所有患者的胰十二指肠壶腹部有肿瘤发生而导致胰腺管阻塞和扩张（如图1A所示）。同时采集了10位只接受胰腺手术而胰腺管正常患者的组织作为阴性对照组。所有样品均切成5μm的切片，并用Ki67（一种细胞增殖指示剂）和DAPI作染色处理。结果证实了胰腺管阻塞扩张组织的β细胞再生现象（如图1B所示）。其中有19位胰腺管阻塞扩张患者的β细胞显著得到增殖。紧接着又在C57BL/6鼠体内开展了类似的试验，动物试验组分为胰腺管脾脏部分结扎组和假手术组，分别在手术后1、3、5、7、14、28天或2、4、8月采集自脾叶末端到结扎部组织。检测后发现同假手术组相比，手术组的β细胞再生或Ki67显色的β细胞数量明显增多（如图2所示）。但两试验组鼠的空腹血糖浓度在手术前后差异不明显。上述试验结果表明鼠胰腺管部分结扎手术在一定程度上能促进胰腺β细胞的再生。
图2.（A）定量分析鼠β细胞再生情况。该柱状图表示Ki67显色阳性的β细胞占总β的百分比
（B）胰腺管道扩张后两月的组织染色切片（200x）。图中可见到胰腺组织全部由非功能的脂肪组织所代替，但伴随着有可见完整的内分泌功能和活化增殖的β细胞。
为进一步验证诱导性胰腺β细胞与母β细胞两者所处的微环境是否相似，我们又对上述组织开展组织结构观察。发现胰腺的外分泌功能组织被非功能性的脂肪组织替代，经部分手术后2个月完全覆盖了脾叶部位，使得胰岛远离胞外基质。根据组织病理学观察将其命名为“秋
天的柿子树”（如图2B所示）。慢性糖尿病患者作胰腺管结扎手术后并不引起胰腺组织的损伤，即使外分泌功能的组织去除后也不影响胰岛的正常功能（1-5）。
最近所谓的“代谢手术”得到广泛的应用。对于一些代谢性疾病来说，代谢手术代表了治疗手段从药物治疗到手术性干预治疗的趋势。现已知有三种普遍的术式：胃肠Roux-en-Y分流术（RYGB）、腹腔镜可调节带胃减容术（LAGB）以及胆胰分流术（BPD），三种术式均可影响食物的摄入和营养吸收（6-8）。肥胖症手术起初仅应用于肥胖患者，但据报道称该手术不仅会引起体重骤减和营养吸收不良，而且还会引起一系列诸如提高糖脂代谢甚至缓解2型糖尿病和高血脂等机体生化代谢的变化（6-8）。尽管试验的结果与机理还存在矛盾，但有学者提出一些胃肠道手术会引起肠道稳态的变化，主要是通过葡萄糖依赖的促胰岛素多肽（GIP）、葡萄糖样多肽1（GLP-1）和葡萄糖依赖的促胰岛素多肽受体（GIP）生化代谢途径（9，10）。另外有人认为肠道巨噬细胞和T细胞在调节机体稳态起着重要作用。事实上有人认为2型糖尿病属于一种促炎症反应性疾病，而2型糖尿病患者的免疫系统组份存在功能性障碍，从而影响了一些特异性细胞因子和趋化因子的表达水平（11）。上述研究中，胰腺管结扎扩张手术能引起鼠和人类胰腺β细胞的增殖。虽然具体的机制还需进一步探讨，但胰腺组织中外分泌组织的炎症反应过程可能与β细胞增殖有关。
总之，我们证实了胰腺部分管道阻塞能促进β细胞增殖。该研究揭示了构建人工“胰”可能依赖于胰腺组织的微环境的变化，以及去除外分泌功能细胞能促进β细胞的再生。
表皮基底细胞：仅适用于表皮组织再生吗？
众所周知，皮肤由两层组织组成（表皮层和真皮层），也人体最大的组织。皮肤包含几种不同类型的干细胞，如表皮干细胞、成黑色素干细胞、间质干细胞和神经样干细胞（1）。有证据表明表皮干细胞至少存在于三个部位：毛囊隆突部、皮脂腺基底层和上皮细胞基底层（2）。所有这些干细胞都可替代死亡或受损的细胞。
未分化的表皮细胞位于人体皮肤表皮基底层，这与滤泡间表皮的新陈代谢和受损皮肤再表皮化过程有关（2,3）。而分化的表皮细胞甚至可以在皮肤的慢性创伤条件下去分化形成表皮干细胞样细胞（4）。并且有报道称这些细胞具有与表皮干细胞相似的表型和功能（5）。
与其他皮肤干细胞相比，位于表皮基底层的角质细胞很容易地获取和体外培养增殖（6,7）。这是因为其可塑性较强，成体干细胞可作为多种组织再生治疗的细胞来源。虽然一些皮肤干细胞经诱导可分化为其他干细胞类型，并可能应用于组织再生领域，但也存在难以分离且培养周期长而数量有限的问题。
表皮基底细胞（EBCs）虽然数量众多，富含未分化细胞，但一直被人们认为除了能重建皮肤表皮外没有应用价值。最近发表的报道却反驳了这一观点，认为EBCs在一定条件下可分化为其他类型的细胞（8）。
为了排除毛囊源性干细胞干扰的可能性，人们对人包皮表皮细胞展开研究，研究其EBCs的多功能性。分离的EBCs经EpiLife培养基培养，该培养基仅能使皮肤角化细胞生长，促进EBCs的增殖，最终使其有效传代五代。最终EBCs经诱导快速达到表皮分化阶段。通过调整培养基比例能让EBCs的多功能性得以表达。经过3周的诱导性培养，EBCs分化为大量的平滑肌样细胞以及少量脂肪和神经样细胞。
图1. 注射鼠表皮干细胞小鼠肌肉受损病理模型对比图。（A）mEBCs组小鼠受损组织由大量过渡组织所替代，而在只接受溶剂注射的小鼠受损部位没有出现类似的修复迹象。（B）受损部位纤维化区域比较图。（C）纤维化区域经三色染色法染色，mEBCs组肌肉受损部位由再生性肌外膜（a）、微血管（b）和新生肌纤维（c）覆盖，而注射溶剂组肌肉受损部位纤维化区域大，愈合不全（箭头所示），肌纤维较细。染色为黄色的肌纤维（e）代表受损部位纤维化区域（白色虚线，C）。Sham: 假手术; Vehicle: 肌肉拉伤手术+溶媒注射组; mEBCs: 肌肉拉伤手术+鼠EBCs注射（mEBCs, 1×106）组。
鉴于其他成体干细胞具有可塑性特征，我们随之探索了EBCs除了用于表皮重建以外是否还可应用于组织再生。参考文献建立免疫功能缺陷型小鼠左胫骨前侧骨骼肌损伤病理模型（9）。试验分组如下：假手术组、肌肉拉伤手术+溶媒注射组和肌肉拉伤手术+鼠EBCs注射（mEBCs, 1×106）组。溶剂或细胞液单剂量注射入肌肉拉伤部位。一周后，mEBCs组小鼠受损组织由大量过渡组织所替代，而在只接受溶剂注射的小鼠受损部位没有出现类似的修复迹象（如图1A）。然而，进一步的分析表明mEBCs试验组小鼠肌肉受损区域与邻近组织区域之间已经没有明显界限（未提供数据）。三色教员染色法观察病理切片发现每组有超过10只小鼠在mEBCs注射治疗一周后会再度出现受损的肌外膜组织，其中富含微脉管（如图1B和1C）。同溶剂注射试验组相比，mEBCs治疗组小鼠肌肉受损部位的纤维化区域明显变小，而在受损部位底部观察到大量的肌纤维。有趣的是，在mEBCs治疗组小鼠肌肉受损部位移植能观察到纤维化区域有少量肌纤维，这说明注射EBCs能有效促进肌肉的生成，有效提高骨骼肌损伤修复的速率和效果。而具体的机理机制还有待于进一步研究。同时还说明EBCs在受损骨骼肌修复和再生中有着重要作用，而这些功能又可能依赖于其自身的旁分泌功能。像间叶干细胞这样能促进组织修复和再生的细胞分泌作用可能成为人们感兴趣的方向之一（10） 图2总结了EBCs在组织修复和再生中可能的应用方向。EBCs可塑性和多效分泌功能的发现为其在医学中的研究领域开启了新的道路。但EBCs的功能与细胞表型之间是否存在关系还不得而知，如果去分化的表皮干细胞样细胞拥有像EBCs相似的旁分泌功能，那么将会为组织修复再生研究提供比其他成体干细胞多而方便的细胞来源。
图2. 表皮基底细胞在组织修复再生领域的应用简图。
人类围产期干细胞库在再生医学领域中的发展与前景
干细胞的应用在再生医学领域有着重要的意义。因为同白细胞抗原（HLA）匹配的成人器官移植并不能得到有效推广应用，而源自几种胚胎围产期组织（脐带血、胎盘以及脐带）则可以作为未来器官移植治疗威胁人类健康的疾病的有力武器（1,2）。而建立不同来源的干细胞库是一种用于保存具有临床应用价值的多功能组织的有效方法。自2000年以来，我们一直从事脐带血造血干细胞（CB-HSCs）的建库工作（3），到目前为止，CB-HSC样品的库存约有15000份。以前因儿科患者数量多而影响到CB-HSCs移植手术，但最近有报道称胎盘富集很多HSCs（4），在2010年建立并开放胎盘HSC库，这将大大推进围产期HSC治疗成人患者的步伐。
MSCs的应用
间质干细胞（MSCs）是一种富含于人体所有组织的多功能干细胞，尤其是在围产期组织中（5,6）。科学家纷纷就MSCs开展了一系列临床试验发现其具有广阔的临床应用价值。在2006年，我们构建了一个高标准的围产期MSCs库，至今已保存有超过10000份，为对MSCs开展临床前和临床试验提供了充足的源泉（2）。同时还建立了一套标准化的细胞库构建程序，分别对待保存干细胞进行细胞表型、纯度、生物学功能、基因稳定性、肿瘤发生学以及微生物污染等方面的调查。为确保分离到的MSCs的安全性，还在小鼠和灵长类动物模型上进行体外试验。在致肿瘤性方面，不同剂量的围产期MSCs经皮下移植入NOD-SCID鼠，移植后三个月未发现肿瘤形成。不同处理组的猴子按2x106or 1x107个细胞/千克体重的剂量经静脉注射围产期MSCs，每两周注射一次，持续六周。试验发现细胞移植并没有任何毒性效应
（7）。随后，我们又进行围产期MSCs治疗多发性硬化和2型糖尿病患者的试点（8,9）。试验证明同种异型的围产期MSCs是有效安全的。对于治疗一些疑难杂症的临床试验还在进一步的策划当中。
HSCs移植
源自HLA匹配的姊妹的脐带血造血干细胞（CB-HSC）移植手术在儿童病例中得到验证，这也证明了建立自体或家系围产期干细胞库的必要性和适用性（1）最近，有一例患再生性
障碍贫血症（VSAA）的4岁儿童患者，接受了自体CB-HSCs和脐带MSCs移植手术。患者表现出皮肤斑点出血、口腔溃疡以及发高烧等症状。住院治疗期间，患者血液细胞数减少并伴发严重的全血细胞数减少症。医院采用骨髓穿刺活组织检查、染色体分析、血清学试验以及溶血试验确诊患有VSAA。具体的治疗方案见图1.患者在接受干细胞手术治疗36天后，临床症状得到显著缓解，造血功能全面恢复（图1B）。据我们所知，这是首次成功运用自体围产期HSC和MSC干细胞共移植手术治疗VSAA的报道。
图1. 再生性障碍贫血症的治疗方案。（A）接受干细胞移植手术前7到8天，环磷酰胺（CTX）40mg/kg/d，连用两天，然后接受干细胞移植手术前2到6天，免疫球蛋白2.5 mg/kg/d，连用5天。手术当天，患者接受5.31 x 108的脐带血造血干细胞（CB-HSCs; 含1.058 x 106CD34+细胞）和2 x 107的脐带间质干细胞（UC-MSCs）移植。手术前后均输入一定剂量的血小板和红血球。手术后5天到20天连续注射粒细胞集落刺激因子（G-CSF, 150ug/d）.（B）手术后36天，患者造血功能全面恢复。
总之，这些数据表明围产期干细胞库的构建为干细胞移植治疗奠定了坚实基础。
移植猪眼角膜等同于异体移植
眼角膜捐赠数量有限而导致供不应求是一个世界性的问题，在中国尤为严重。中国每年仅约有四千名患者能接受眼角膜移植术，另外还有四百万人排队等候。因此过去十年以来，人们就一直致力于寻求能人类眼角膜的替代物。而应用生物技术和组织工程学合成眼角膜则是一种较好的途径（1,2）。
眼角膜基质占角膜的90%，并且与视觉透明度有关。所以重建眼角膜基质在角膜组织工程学领域变得非常艰难。在此之前有报道称运用合成的高分子聚合物或天然胶原蛋白构建角膜，想要达到高视觉透明度和强度非常困难。因此，科学家纷纷转向研究其他物种，看看是否可用于人类眼角膜的重建。近年来，科学家发现猪眼角膜在厚度、拓扑结构学以及光折射稳定性方面与人类眼角膜颇为相似（3）。
然而，猪器官组织移植入人类必须要克服异体排斥的问题以及防止猪的病原微生物感染人类的可能性。再者，角膜不含血管而具有的免疫原性较低，将新鲜的猪眼角膜移植入人体也不会引起像肝脏或肾脏这样富含血管的器官所引起的高度免疫排斥现象（4）。相反，出现免疫
排斥的现象一般发生在移植后的两到四周内。据报道称，移除掉角膜细胞可降低异体组织排斥和病原传播的风险。随后，有关专家一直在探索培育出无细胞的角膜基质的方法（5-7）。虽然去除基质细胞组分的高效方法已有报道，但按此类方法得到的基质是否可用于移植还不得而知。原因有如下几点：第一，在去除基质细胞的同时会去除一些胞外基质，尤其是一些包括粘多糖（光蛋白聚糖和角膜蛋白）在内的可溶性基质更容易受到破坏，因为这些粘多糖对于维持角膜细胞表型和固定角膜基质非常重要。第二，可能会破坏角膜胶原纤维的正常结构，影响角膜透光能力，造成角膜移植后角膜组织传导性和角膜透光度的恢复速度减慢。第三，操作过程中都会使用较多的化学试剂，如洗涤剂或酶制剂的残留可能破坏机体正常组织
（8）。此外，因此过程步骤繁多耗时，存在许多不可控制的因素。
因此，为保护眼角膜基质天然结构，诸多学者认为尽量避免较多的实验操作，所以我们也认为没有必要去除角膜基质细胞。而失活角膜基质细胞则可能更为有效地培育出符合角膜组织工程学的叫角膜基质。原位失活的角膜基质细胞引起的免疫反应性较弱，而且这些死亡的细胞在移植后的一段时间内即可自动消退而在机体组织融合期间减弱免疫排斥反应。最近的一项研究表明，用脱水的猪眼角膜移植入恒河猴角膜后引起较低的免疫排斥现象（9），这也证明了猪眼角膜移植到人体时，角膜基质中残留的死亡细胞可能不会到来太大影响。
在这样的背景下，我们探索出一种快速简单的方法处理猪眼角膜。首先用细胞刮刀去除新鲜猪眼角膜上皮组织和内皮组织，然后放入液氮冻存1小时再解冻10分钟，重复三次使得角膜基质细胞失活，随后放入冷冻干燥机脱水8小时。最后将猪眼角膜暴露在放射性剂量为25kGy的钴60中杀菌备用。
图1.
首先在试验兔上做眼角膜基质免疫原性试验，经皮下移植处理好的猪眼角膜，发现未处理过角膜基质细胞的实验组在四周内均出现免疫排斥现象，而在角膜基质细胞失活处理的试验组均未出现免疫排斥现象（持续观察8个月）。随后进行大规模试验进行验证，将处理过的猪眼角膜在Hank’s平衡盐缓冲液中水化10分钟，使其成为直径5mm，厚度200um的薄片组织。经手术移植入试验兔，含活细胞的新鲜猪眼角膜作为对照。研究发现猪眼角膜直接移植的试验兔在2-12周出现免疫排斥现象，而处理过的眼角膜移植试验兔并未出现免疫排斥。
细胞失活的猪眼角膜还能保持较高的视觉透光度，而未经处理的眼角膜基质则出现视觉模糊和新生血管。组织切片检查失活角膜基质细胞试验组组织，可见到正常上皮细胞核基质细胞，两者组织界限不明显，而对照组组织切片可见到上皮细胞过度增生，基质部有多量细胞侵润，基质厚度明显增厚（图1）。
图2.
课题组进行了第一例人体移植，将猪眼角膜一直到人的眼中。发现5天后移植部出现再上皮化组织。术后3个月上皮组织下有神经丛发育，术后15个月体内共聚焦显微技术可观察到角膜基质细胞生成（图2）。因此，猪眼角膜移植在技术上已经成熟，将会加快进程，让这项技术走出实验室，成为产品，让更多的角膜病人重见光明。
组织工程学：中国再生医学研究的