蛋白质表达的性质
关键词：大肠杆菌，细胞，试剂，标准物质，北京标准物质网
1. 所需要的蛋白表达量 如果只是需要少量蛋白，比如筛选一系列点突变体的酶活性，酶学检测可以在大肠杆菌粗提物中进行，采用多数通用表达质粒即可，没有必要花很大精力去优化方案来提高表达量。如果实验蛋白需要量大，就有必要尝试不同宿主载体系统和纯化方法，从中找出大批量表达蛋白的可行方案。外源蛋白水平与生理状态下的内源蛋白相仿，有助于蛋白功能或蛋白相互作用研究。
2. 表达蛋白的可溶性 在抗体制备时不一定要求蛋白可溶，而研究蛋白功能时可溶性蛋白是关键。利用大肠杆菌表达的融合蛋白常常形成包涵体，相对容易进行纯化，不易被降解。若需要的是可溶性蛋白，可以采用降低复性温度，降低表达水平，改变携带蛋白和尝试不同宿主菌株等方法提高蛋白溶解性。
3. 表达蛋白的稳定性 在大肠杆菌中表达的外源蛋白尤其是真核蛋白常常稳定性不足。将融合蛋白以包涵体形式表达，或者采用缺失已知蛋白酶的大肠杆菌菌株作为宿主，可减少不稳定蛋白质的降解。由于不同菌株内蛋白酶的水平不同，对于某一特定融合蛋白来说，尝试不同菌株有助于提高蛋白稳定性。
4. 蛋白质分子量 在哺乳动物细胞中，不加标签的外源蛋白和内源蛋白由于分子量相同在免疫印迹上难以区分，表达融合蛋白有助于两者的区分。一般来说小于5kD 或者大于100kD 的蛋白表达比较困难。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解，在这种情况下可以采取融合蛋白表达，在每个单体蛋白之间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，可以加入GST 、Trx 、MBP 等较大的标签蛋白可能促进蛋白正确折叠：如果蛋白大于60kD 则建议用6×His、HA 等较小的标签。对于结构研究清楚的大蛋白可以根据实验目的表达截短蛋白
(truncated protemin) ，如果是为抗体制备，一定要保证截取抗原性较强的部分。
5. 是否需要活性蛋白 如果蛋白表达的目的仅仅是获得一些制备抗体的材料，就没有必要获得活性蛋白。如果目的蛋白表达是用于功能研究，那么保持或者恢复蛋白的活性是非常重要的，纯化难易相对不重要。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如细胞膜表面受体或细胞外的激素和酶，则更需要利用真核细胞表达。当表达蛋白是用于结构研究，最好是以可溶性蛋白的形式。在不同大肠杆菌菌株尝试表达蛋白，减少体内蛋白异常折叠，尽可能减少体外变性从而保持正常蛋白构象。
蛋白质表达是一个复杂的调控过程，由于插入的目的基因不同，载体构建元件不同，组装的空间位置不同，采用表达系统不同，最终蛋白表达水平和阳性克隆筛选率都会有很大差异。另外，由于表达元件存在种属和组织特异性，所构建的表达载体不一定在所有细胞株中都高效表达。细胞生长状态的差异，转染方法的不同，培养时间的长短，筛选药物浓度的高低，对表达量都有很大影响。因此，需要综合评价一个表达载体和表达系统，排除一些不确定因素，优化实验条件。
蛋白质表达的性质
关键词：大肠杆菌，细胞，试剂，标准物质，北京标准物质网
1. 所需要的蛋白表达量 如果只是需要少量蛋白，比如筛选一系列点突变体的酶活性，酶学检测可以在大肠杆菌粗提物中进行，采用多数通用表达质粒即可，没有必要花很大精力去优化方案来提高表达量。如果实验蛋白需要量大，就有必要尝试不同宿主载体系统和纯化方法，从中找出大批量表达蛋白的可行方案。外源蛋白水平与生理状态下的内源蛋白相仿，有助于蛋白功能或蛋白相互作用研究。
2. 表达蛋白的可溶性 在抗体制备时不一定要求蛋白可溶，而研究蛋白功能时可溶性蛋白是关键。利用大肠杆菌表达的融合蛋白常常形成包涵体，相对容易进行纯化，不易被降解。若需要的是可溶性蛋白，可以采用降低复性温度，降低表达水平，改变携带蛋白和尝试不同宿主菌株等方法提高蛋白溶解性。
3. 表达蛋白的稳定性 在大肠杆菌中表达的外源蛋白尤其是真核蛋白常常稳定性不足。将融合蛋白以包涵体形式表达，或者采用缺失已知蛋白酶的大肠杆菌菌株作为宿主，可减少不稳定蛋白质的降解。由于不同菌株内蛋白酶的水平不同，对于某一特定融合蛋白来说，尝试不同菌株有助于提高蛋白稳定性。
4. 蛋白质分子量 在哺乳动物细胞中，不加标签的外源蛋白和内源蛋白由于分子量相同在免疫印迹上难以区分，表达融合蛋白有助于两者的区分。一般来说小于5kD 或者大于100kD 的蛋白表达比较困难。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解，在这种情况下可以采取融合蛋白表达，在每个单体蛋白之间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，可以加入GST 、Trx 、MBP 等较大的标签蛋白可能促进蛋白正确折叠：如果蛋白大于60kD 则建议用6×His、HA 等较小的标签。对于结构研究清楚的大蛋白可以根据实验目的表达截短蛋白
(truncated protemin) ，如果是为抗体制备，一定要保证截取抗原性较强的部分。
5. 是否需要活性蛋白 如果蛋白表达的目的仅仅是获得一些制备抗体的材料，就没有必要获得活性蛋白。如果目的蛋白表达是用于功能研究，那么保持或者恢复蛋白的活性是非常重要的，纯化难易相对不重要。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如细胞膜表面受体或细胞外的激素和酶，则更需要利用真核细胞表达。当表达蛋白是用于结构研究，最好是以可溶性蛋白的形式。在不同大肠杆菌菌株尝试表达蛋白，减少体内蛋白异常折叠，尽可能减少体外变性从而保持正常蛋白构象。
蛋白质表达是一个复杂的调控过程，由于插入的目的基因不同，载体构建元件不同，组装的空间位置不同，采用表达系统不同，最终蛋白表达水平和阳性克隆筛选率都会有很大差异。另外，由于表达元件存在种属和组织特异性，所构建的表达载体不一定在所有细胞株中都高效表达。细胞生长状态的差异，转染方法的不同，培养时间的长短，筛选药物浓度的高低，对表达量都有很大影响。因此，需要综合评价一个表达载体和表达系统，排除一些不确定因素，优化实验条件。