单抗纯化手
册
一.前言
1975年Kohler 和Milstein 发明了单抗技术,他们因此在1984年获得诺贝尔奖。但直到1987年单抗技术的价值才被认识到,应用到诊断试剂当中。现在单抗主要应用于疾病的预防,诊断和治疗,生物物质的纯化及蛋白结构功能的研究。治疗性单抗的市场在新药开发中有逐年增长的趋势,1997年单抗的销售额是50亿美金, 每年都有40%到50%的增长,1999年时销售额翻倍,预计到2003年会是1997年的十倍可达500亿美金,由此可见单抗技术是生物技术领域燃起的一颗新星。从1997年至今已批准了8种治疗性单抗药物,现在在美国市场上比较著名的单抗药物如Rituxan (IDEC/Genentech/Roche),是嵌合CD-20单抗,被FDA 批准的第一个治疗癌症的单抗药物,治疗non-hodgkins lymphoma, 1997年上市,现今以进入56个国家,销售额30亿美金;Herceptin(Genentech), 1998上市,人源化HER-2,治疗乳腺癌;Orthoclone OKT3 (OrthoBiotech) 1986,鼠源性单抗,用于器官移植后抗排异;再有如Simulect (Novartis), Synagis (Medimmune) R, eoPro(J&J, Centocor, Lilly), Zenapax (PDL, Roche) Remicade(Centocor) 等等。现在大约有100种单抗在临床实验,这占整个生物制药总数的一半,其中四分之一的单抗在临床三期或等候批准。单抗发展的趋势从100%的鼠源性单抗到嵌合抗体到人源化单抗最终到完全人源单抗,2000年年中人类基因序列初稿完成,接下来就是对蛋白和基因结构的研究,这对单抗的研究带来机遇和挑战。
Wood Mackenzie预测治疗性单抗的市场将于2004年达到64亿美金,每年增长30%。
二.单抗的定义和性质
单抗是B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生的,可以识别和结合特异的抗原。单抗作为一类蛋白即有共性又有个性,所有单抗的结构是类似的,均由重链和轻链组成,单抗的分子量如IgG 大约均在150000Da (重链50 Kda,轻链25 Kda); 但不同单抗的等电点从4.0到9.5不等,糖基化程度,疏水程度及电荷密度等生化性质上各不相同。
-2-
单抗作为治疗癌症的候选药物主要机制分两类,一类是直接诱导癌细胞凋亡或抑制癌细胞生长或代谢;另一类通过补体效应或ADCC 来间接杀死癌细胞。
为什么在单抗技术在发明二十年之后仍然没有被应用到人类基因的治疗上,主要原因是因为鼠源抗体被人类免疫系统识别为外源蛋白,会产生人抗鼠抗体,这不仅使鼠抗失去效果,而且会造成人体免疫系统混乱。解决这个问题的方法是用基因工程的手段构建嵌合抗体或人源化抗体。当抗体被用于治疗制剂时最好有长的半衰期,低免疫原性,对抗原有高亲和力,这些特性均可用基因工程的方法获得。现在基因工程抗体表达的类型分为嵌和抗体,移植抗体,抗体分子片段的表达,抗体融合蛋白及人源性抗体片段。嵌和抗体是将小鼠单抗可变区与人恒定区基因连接形成的嵌合基因表达的嵌合抗体分子;移植抗体是将小鼠抗体的互补决定区序列移植到人抗体的可变区框架中形成的;抗体的分子片段有Fab 段,Fv 段及双价抗体分子片段;抗体融合蛋白是导向抗体与毒素或细胞因子联合所形成的;人源性抗体片段是Fab 或ScFv 与噬菌体外壳蛋白融合而制备的。
三.安玛西亚公司单抗纯化用产品
Sepharose protein A, Sepharose protein G, MabSelectProtein A Sepharose和rProtein A Sepharose介质
A 蛋白来源于金黄色葡萄球菌的一个株系,包含了5个与IgG 的Fc 段结合的区域。A 蛋白作为亲和配体被固定于琼脂糖上,而它的这五个结合区域则空闲出来以便捕捉IgG 。1个固定了的A 蛋白分子至少可以结合2分子的IgG 。目前天然的和重组的A 蛋白对于IgG 的Fc 段有着相似的特异性,但是重组的A 蛋白经改造后含有一个C 末端半胱氨酸,使得其以单一位点固定于琼脂糖上,增加了结合能力。A 蛋白对IgG 的结合强度依赖于免疫球蛋白的物种来源,而其动态结合能力则决定于结合强度及其他因素(例如上样时的流速) 。尽管IgG 是人体主要的免疫球蛋白,另一些类型的免疫球蛋白也可以于A 蛋白结合如IgA 、IgM 。
亲和基质中配体脱落是一个问题,尤其是洗脱条件恶劣时。A 蛋白与琼脂糖介质的多位点结合保证其难以被洗下脱离柱子,因而在广泛的洗脱条件下可以维持极低的配体脱落水平。
rProtein A Sepharose纯化单抗实例:Sepharose Protein G
G 蛋白是一种源自链球菌G 族的细胞表面蛋白,除此之外,它还是一种三型Fc 受体。其通过类似于Α蛋白的非免疫机制与抗体的Fc 段结合。像A 蛋白一样,G 蛋白与IgG 的Fc 区域特异性结合,不同的是,相对于几种多克隆IgG 及人IgG 来说,G 蛋白显然是更加强有力的结合者。Sepharose Protein G由于可以广泛的结合真核生物许多类型的IgG 而成为了捕捉抗体的极佳选择。其对于抗体IgG 的亲和力超过A 蛋白,同时又将结合清蛋白的水平减小到最低,使得产物在量及纯净水平上都有优势。
配体从亲和基质中脱落从来都是一个问题,尤其是在洗脱条件较为恶劣的时候。在这方面,G 蛋白也是有优势的,它与琼脂糖介质有许多结合位点,如此紧密的结合力把脱落水平减小到了最低。事实上在相当广泛的洗脱条件下,该介质只有极低水平的配体脱落。Protein G Sepharose纯化单抗实例:
Column:HiTrap Protein G HP, 1 ml and HiTrap Desalting
Sample:
Eluted mouse monoclonal IgG from HiTrap Protein G HPBinding buffer:20 mM sodium phosphate, pH 7.0Elution buffer:0.1 M glycine, pH 2.7
Flow rate:2 ml/min
Detection:
UV: 0-2.0 AUFS, 5 mm cell, 280nmpH: measured on 0.5 ml fractions
**鉴于洗脱条件可能十分恶劣,建议将洗脱的单抗片段
收集于中和缓冲液中 (每毫升片段60-200µl 1M Tris-HCl,pH=9.0) 或用Sephadex G-25进行缓冲液交换,以保证得到片段的pH 值最终近乎中性。
-3-
注意
1. 大多数免疫球蛋白在pH 值高于2.7 (或者更低) 时很难 被洗脱下来。因此洗脱条件往往比较恶劣,如果由此导 致抗体失去活性,则应考虑使用A 蛋白琼脂糖。它的好 处是洗脱条件更加温和。
2. 大多数物种及亚类的IgG 在生理pH 及离子强度下与G 蛋白结合。
3. 如果目的蛋白与配体间作用较弱,则应该避免多余的洗 涤步骤,以免过分减少产量。
4. 用脱盐柱对纯化的IgG 片段进行去盐处理或者将其转移 至适宜的缓冲液 (见20页) 。
5. G蛋白琼脂糖介质的再利用:依样品的天然属性而定, 只可在前后样品相同的情况下实现,否则会产生交叉 污染。
6. 若样品体积较大,则可以将几个HiTrap Protein G HP柱 连续地接合起来或者在一个大柱子中装填以松散的介 质。
保存
20%乙醇洗涤柱子和介质 (五个柱体积洗装填的介质) ,于4-8˚C保存。
MabSelect
MabSelect TM 是一种新的BioProcess TM 亲和介质,用于填充床层析中可以从大量的样品中分离出单克隆抗体。特点
1. 其设计保证一天内可以完成超过10000升高表达发酵样 品的抗体分离。
2. 在工艺许可条件下有高体积流速,线性流速达 500 cm/hr。
3. 通过定向结合配体及优化了的基质加强了与免疫球蛋白 的结合能力。
4. *在BPG TM 、FineLINE TM 、INdEX TM 、Chromaflow TM 这 些柱子中填充,其分离能力与所填体积成正比,易于线 性工艺放大。
5. 该介质可以耐受严酷有效的CIP 操作。
理化性质
组成:高度交连的琼脂糖;
包装大小:40-130µm (d 50v H85 µm); 配体:重组A 蛋白 (E. coli); 偶联化学成分:环氧基;
动态结合能力:约为30mg 人IgG/ml介质;化学稳定性:于所有水溶缓冲液中稳定; 通常所用缓冲液为:100mM H3PO 4 (pH 1.6),
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10 mM HCl (pH 2),10 mM NaOH (pH 12), 0.1 M 20%柠檬酸钠/HCl (pH 3),6M GuHCl,20%乙醇,2%苯甲醇; 推荐pH 值:工作范围3-10
CIP操作范围2-12; 推荐流动相速:500 cm/h; 热稳定的温度区间:4-40 ˚C;
推荐长时间保存条件:4-8 ˚C,20%乙醇;
实验条件
适宜的缓冲液 (举例)
缓冲液A:0.05M硼酸,4.0M NaCl,pH=9.0缓冲液B: 0.05M磷酸钠,0.05M柠檬酸钠,0.3M NaCl, pH=3.0实验步骤:
1. 以10个柱体积的缓冲液A 平衡柱子。2. 上样 (少量抗体) 。
3. 以5个柱体积的缓冲液A 洗柱
4. *以10个柱体积的线性梯度洗柱直至洗液为100%的缓 冲液B
5. 收集片段于滴定稀释溶剂中 (如1.0 M Tris-HCl,pH = 8.0,稀释溶剂的体积等于程序片段体积的5%)
6. 以5到10个柱体积的100%的缓冲液B 对柱子实现再生7. 用缓冲液A 对柱子再平衡
* 沉淀或变性的物质:以2个柱体积的6M 胍或者10 mM NaOH2 or 0.1 M H3PO 4清洗后,立即以5个柱体积滤过 灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~ 8) 洗柱,逆转流动方向* 疏水杂质的洗涤:以2个柱体积的非结合物质离子去垢 剂洗柱 (如conc. 0.1%),立即以至少5个柱体积的滤过 灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~ 8) 洗柱,逆转流动方向。或 者以3至4个柱体积的70%乙醇或30%异丙醇洗柱。立 即用至少5个柱体积的滤过灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~ 8) 洗柱,逆转流向。
注意:当使用高浓度有机溶剂时,应采用递增梯度避免气泡的产生。
CIP 方法因实验样品不同应有所改良。而日常进行CIP 的频率亦取决于样品的性质。不过推荐每5个循环后进行一次CIP 处理。依照污染物的性质采用不同的CIP 程序。如果污染严重,则需要进一步优化CIP 手册。
消毒
消毒把微生物对床的污染减小到最低。
用2% hibitane digluconate及20%乙醇组成的溶液平衡柱子,静置6个小时,然后用至少5个柱体积的灭菌结合缓
冲液洗涤。或者用含0.1M 乙酸及20%乙醇的溶液平衡柱,工作中也经常碰到。BlueSepharose 介质是去除白蛋白的静置1小时,然后用至少5个柱体积的灭菌结合缓冲液洗涤。或者用70%乙醇平衡柱,静置12个小时,然后用至少5个柱体积的灭菌结合缓冲液洗涤。
注意
当使用70%乙醇时,需要有特定的规则 (防爆区域及设备) 四.单抗纯化策略及注意事项
常规策略:①总的来讲作为一类蛋白,单抗的分子量IgG :150-160 kDa,IgM :900 kDa,等电点pI 在4到9之间,大部分超过pI6,比其它血清蛋白更偏碱:②IgG 的疏水性更强,在硫酸氨浓度30-50%时会沉淀。在水溶液中的溶解性更好,在近等电点和底盐时溶解度会减弱,在室温下相对比较稳定,除在相对偏酸的溶液中不稳定外一般缓冲液下均较稳定。③所以在单抗纯化时既要了解他们的共性又要了解个性,整个纯化策略与其他蛋白纯化一样可分为三步,粗提用来分离浓缩和稳定样品,中度纯化去除大部分杂质,精细纯化达到最高纯度。④在选择一个纯化策略时应考虑几个因素,如抗体的来源,单抗本身的理化性质,最终产品的生产规模及纯度要求,目的蛋白的分析鉴定方法,药品管理部门对产品的要求。在抗体来源中单抗本身的性质,样品的培养和处理方法,潜在污染及发酵液蛋白浓度均会影响纯化策略的设计。⑤如果是大量单抗的生产,体外单抗培养技术是首选。越来越多的单抗用哺乳动物细胞来培养,例如用CHO 表达的单抗表达水平在1-2 g/L。在样品的制备和粗提中常用的是离心和超滤,安玛西亚公司的扩张床技术因把离心超滤及粗纯有效的结合,现被越来越多的应用。⑥大部分单抗在中性偏碱和低电导的缓冲液中是稳定可溶的,但是有一些抗体在温度低于37˚C时溶解度会降低,易结晶;强碱性单抗在多价阴离子缓冲液中易形成稳定的的离子复合物导致抗体之间的聚合;单抗同时经常与核酸形成复合物,这种结合在0.3M-10M NaCl存在时是可逆的,所以在单抗纯化中粗纯时选择缓冲液是非常重要的。⑦粗样品的预处理可选用脱盐交换缓冲液,浓缩把样品部分纯化转入所需环境,起始纯化一般选用离子交换或亲和层析,产品纯度可达50-98%,最终纯化可选凝胶过滤或疏水层析。
单抗纯化中杂质的去除杂蛋白:不论是腹水或细胞培养单抗白蛋白,转铁蛋白及宿主免疫球蛋白是三种主要的杂质,白蛋白的量比较大,转铁蛋白和许多单抗有相似的带电性质,宿主免疫球蛋白或牛免疫球蛋白的性质和要分离的目的单抗有很多相似的性质,另外脂蛋白可能比较容易阻塞柱子,这在实际一种方法。二聚体和寡聚体在蛋白浓度较高时容易形成,这些聚合物将降低样品的生物活性,一般来讲凝胶过滤Superdex 200能有效去除这些杂质。牛免疫球蛋白的污染问题在单抗纯化中十分显著,一般来说用疏水层析和离子交换可能会除去此类杂质。白蛋白和转铁蛋白也可用离子交换和疏水的方法去除,有一些单抗比它们的疏水性更强,疏水介质可以使目的蛋白结合而使杂质流穿。核酸和内毒素:核酸在高盐条件下可与蛋白解离,这时疏水层析是一个很好的选择;阳离子交换介质可以让核酸和内毒素流穿;阴离子交换介质在合适的pH 下可以让内毒素吸附,使样品穿透。
脱落的亲和配体的去除
凝胶过滤层析,在合适的pH 条件下,可用于除去A 蛋白-IgG 聚合物,该聚合物会率先从柱上洗脱下来。阳离子交换层析,是去除A 蛋白残基的有效工具,尤其是特定的单抗具有阳离子交换结合性质的时候。该操作在抗体与A 蛋白解聚的pH 条件下进行,由于A 蛋白难以与阳离子交换介质结合,故将畅通无阻地通过,或者在梯度早期洗脱。阴离子交换层析可以用于减少泄漏的A 蛋白造成的污染。这种方法最适用于处理那些与阴离子交换介质有极少吸附的抗体。由于A 蛋白具有很强的结合阴离子交换介质的能力,A 蛋白-IgG 复合物表现出很强的留在阴离子交换介质上的倾向。而未与A 蛋白形成复合物的IgG 就正好相反。这些复合物通常不会形成独立的峰,而是时常显现出拖尾肩样。为了确定阴离子交换层析去除A 蛋白复合物的能力,以20mM Tris-HCl,pH=8.5平衡柱,上样后以线性梯度洗脱,最后洗脱液的浓度达到0.25M NaCl (20mM Tris-HCl, pH=8.5),收集抗体峰的片断,筛选A 蛋白。
检测方法:对分离后峰纯度的检测可用电泳的方法,如SDSPAGE, Native PAGE, IEF等, 也可用凝胶层析的方法,对功能的检测可用免疫电泳,表面核磁共振,动力学测试,ELISA 等。
五.单抗纯化应用举例
细胞培养单抗:
18112893 Rapid optimisation and development ofantomated two-step purification procedure for monoclonalIgG antibodies; AKTAFPLC
用AKTAFPLC 两步自动纯化鼠源IgG ,纯化方法包括捕获和精细纯化两步,细胞培养上清用0.45um 的膜过滤后用Hitrap rProtein A直接吸附目的蛋白,这步除去大量的杂
-5-
质,低分子量的物质并对样品进行浓缩,在AKTAFPLC 上对吸附和洗脱条件进行自动摸索,结合缓冲液的摸索主要是对结合时缓冲液盐浓度的选择,最佳的盐浓度是指结合时没有流穿和洗脱峰最大的盐浓度,最佳的洗脱条件是指逐步降低pH 时能达到最佳分辨率的最高pH ;第二步用HiLoad 16/60 Superdex 200进行精细纯化,去除微量杂质。
图a (对盐浓度的筛选)
图b (Superdex 200精细纯化)
检测用小鼠单抗:Two step purification of a mouse monoclonal IgG1 fordiagnosticuse 这是一个能达到诊断试剂要求的纯化单抗的例子,目的蛋白是抗IgE 的单抗IgG1,经杂交瘤细胞培养获得,样品经0.05M 的硫酸氨沉淀和过滤后可以用疏水层析对目的蛋白进行捕获 (图例如下) ,单抗可以牢固的和介质结合,大部分的牛血清蛋白流穿,在这步中需对缓冲液的硫酸氨的浓度进行优化得到最好的选择性。粗纯一步优化后纯度可达95%,所以再用一步凝胶过滤精细纯化纯度可达99%。
-6-
不含Fc 区的单抗片段:
Three step purification of a recombinant Fab fragment这个例子成功应用了三步纯化策略来纯化一个Fab 的片段,用离子交换捕获,疏水层析进行中度纯化,再用离子交换精细纯化。这三步策略证明可以成功放大,详细内容可见安玛西亚公司的应用资料:18-1111-23。
目的蛋白是重组的Fab 片段,特异的与HIVgp-120结合,是用 E.coli BM179 MCT61表达的。样品经Dnase 处理后用Streamline SP直接捕获,省去了离心和其他预处理。中度纯化选择疏水层析是因为该技术与离子交换互补,从streamline 下来的样品已在高盐中,步与步之间的样品处理很简单。疏水层析的结果较难预测,可用HICselection Kit 来筛选最佳填料,最终选定Phenyl Sepharose FF (highSub) (图例如下) 。精细纯化一般首选凝胶过滤,但在这个实验中因目的蛋白和杂质的分子量相差较
少,杂质难去
除,所以用Source15 S 进行精细纯化,因为其颗粒小而均一,选择合适的梯度可获得较理想的效果。
大规模纯化治疗用单抗药物:18113948 Intensification of a large scale commercial monoclonalantibody purificationprocess
商用治疗性单抗从早期产量需求的毫克级到现今纯化规模的公斤级,对单抗纯化技术的挑战和要求越来越高,荷兰的Centocor BV公司在这一领域有成功的经验。他们在纯化中用扩张床技术取代离心和超滤;用Q 和SP sepharose high performance等高载量和高分辨率的填料增加上样载量;发酵液和纯化过程整和在一起,提高纯化效率。这样一次纯化可得8-16公斤纯化产品。 (摘自Downstream 30, 22-23)
长效治疗性Fab 片段的制备 (参照18-1150-47, P27)
作为治疗慢性病的治疗性单抗药物,药物的规模性供应,长效性和低成本是很重要的。Celltech 公司在这方面有一套自己的策略。他们用大肠杆菌这种低成本易放大的系统表达人源Fab 片段,用简单的非亲和层析技术纯化,纯化后用PEG 进行修饰以延长药物寿命。细胞周质的Fab 片段经粗提后用离子交换和疏水层析进行纯化,以达到预期的纯度。经PEG 偶连的Fab 片段经离子交换做最终纯化。
RPAS 纯化模式:一种新的纯化重组E-tagged ScFv抗体的方法 (18-1113-78)
用噬菌体展示技术表达可溶性有功能的重组抗体片段是研究治疗性单抗的一种新技术,单链的Fab 用pCANTAB 5E载体在大肠杆菌中表达,表达的ScFv 有一个13个氨基酸的标记,可用Anti-E Tag亲和层析柱纯化,在中性的缓冲液中结合,降低pH ,目的片段可被洗脱下来。整个纯化过程只用10-15分钟,经纯化后目的蛋白经检测有免疫活性,纯度达95%。在用Hitrap Anti-E Tag柱纯化时流速,样品体积,样品浓度均对实验结果有影响,具体结果见图。
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详情请与安玛西亚有限公司各办事处联系:
香港:(852)2811 7575北京:(010)8838 5742上海:(021)6445 5290广州:(020)8732 0255 (021)5080 0260成都:(028)8779 4184
单抗纯化手
册
一.前言
1975年Kohler 和Milstein 发明了单抗技术,他们因此在1984年获得诺贝尔奖。但直到1987年单抗技术的价值才被认识到,应用到诊断试剂当中。现在单抗主要应用于疾病的预防,诊断和治疗,生物物质的纯化及蛋白结构功能的研究。治疗性单抗的市场在新药开发中有逐年增长的趋势,1997年单抗的销售额是50亿美金, 每年都有40%到50%的增长,1999年时销售额翻倍,预计到2003年会是1997年的十倍可达500亿美金,由此可见单抗技术是生物技术领域燃起的一颗新星。从1997年至今已批准了8种治疗性单抗药物,现在在美国市场上比较著名的单抗药物如Rituxan (IDEC/Genentech/Roche),是嵌合CD-20单抗,被FDA 批准的第一个治疗癌症的单抗药物,治疗non-hodgkins lymphoma, 1997年上市,现今以进入56个国家,销售额30亿美金;Herceptin(Genentech), 1998上市,人源化HER-2,治疗乳腺癌;Orthoclone OKT3 (OrthoBiotech) 1986,鼠源性单抗,用于器官移植后抗排异;再有如Simulect (Novartis), Synagis (Medimmune) R, eoPro(J&J, Centocor, Lilly), Zenapax (PDL, Roche) Remicade(Centocor) 等等。现在大约有100种单抗在临床实验,这占整个生物制药总数的一半,其中四分之一的单抗在临床三期或等候批准。单抗发展的趋势从100%的鼠源性单抗到嵌合抗体到人源化单抗最终到完全人源单抗,2000年年中人类基因序列初稿完成,接下来就是对蛋白和基因结构的研究,这对单抗的研究带来机遇和挑战。
Wood Mackenzie预测治疗性单抗的市场将于2004年达到64亿美金,每年增长30%。
二.单抗的定义和性质
单抗是B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生的,可以识别和结合特异的抗原。单抗作为一类蛋白即有共性又有个性,所有单抗的结构是类似的,均由重链和轻链组成,单抗的分子量如IgG 大约均在150000Da (重链50 Kda,轻链25 Kda); 但不同单抗的等电点从4.0到9.5不等,糖基化程度,疏水程度及电荷密度等生化性质上各不相同。
-2-
单抗作为治疗癌症的候选药物主要机制分两类,一类是直接诱导癌细胞凋亡或抑制癌细胞生长或代谢;另一类通过补体效应或ADCC 来间接杀死癌细胞。
为什么在单抗技术在发明二十年之后仍然没有被应用到人类基因的治疗上,主要原因是因为鼠源抗体被人类免疫系统识别为外源蛋白,会产生人抗鼠抗体,这不仅使鼠抗失去效果,而且会造成人体免疫系统混乱。解决这个问题的方法是用基因工程的手段构建嵌合抗体或人源化抗体。当抗体被用于治疗制剂时最好有长的半衰期,低免疫原性,对抗原有高亲和力,这些特性均可用基因工程的方法获得。现在基因工程抗体表达的类型分为嵌和抗体,移植抗体,抗体分子片段的表达,抗体融合蛋白及人源性抗体片段。嵌和抗体是将小鼠单抗可变区与人恒定区基因连接形成的嵌合基因表达的嵌合抗体分子;移植抗体是将小鼠抗体的互补决定区序列移植到人抗体的可变区框架中形成的;抗体的分子片段有Fab 段,Fv 段及双价抗体分子片段;抗体融合蛋白是导向抗体与毒素或细胞因子联合所形成的;人源性抗体片段是Fab 或ScFv 与噬菌体外壳蛋白融合而制备的。
三.安玛西亚公司单抗纯化用产品
Sepharose protein A, Sepharose protein G, MabSelectProtein A Sepharose和rProtein A Sepharose介质
A 蛋白来源于金黄色葡萄球菌的一个株系,包含了5个与IgG 的Fc 段结合的区域。A 蛋白作为亲和配体被固定于琼脂糖上,而它的这五个结合区域则空闲出来以便捕捉IgG 。1个固定了的A 蛋白分子至少可以结合2分子的IgG 。目前天然的和重组的A 蛋白对于IgG 的Fc 段有着相似的特异性,但是重组的A 蛋白经改造后含有一个C 末端半胱氨酸,使得其以单一位点固定于琼脂糖上,增加了结合能力。A 蛋白对IgG 的结合强度依赖于免疫球蛋白的物种来源,而其动态结合能力则决定于结合强度及其他因素(例如上样时的流速) 。尽管IgG 是人体主要的免疫球蛋白,另一些类型的免疫球蛋白也可以于A 蛋白结合如IgA 、IgM 。
亲和基质中配体脱落是一个问题,尤其是洗脱条件恶劣时。A 蛋白与琼脂糖介质的多位点结合保证其难以被洗下脱离柱子,因而在广泛的洗脱条件下可以维持极低的配体脱落水平。
rProtein A Sepharose纯化单抗实例:Sepharose Protein G
G 蛋白是一种源自链球菌G 族的细胞表面蛋白,除此之外,它还是一种三型Fc 受体。其通过类似于Α蛋白的非免疫机制与抗体的Fc 段结合。像A 蛋白一样,G 蛋白与IgG 的Fc 区域特异性结合,不同的是,相对于几种多克隆IgG 及人IgG 来说,G 蛋白显然是更加强有力的结合者。Sepharose Protein G由于可以广泛的结合真核生物许多类型的IgG 而成为了捕捉抗体的极佳选择。其对于抗体IgG 的亲和力超过A 蛋白,同时又将结合清蛋白的水平减小到最低,使得产物在量及纯净水平上都有优势。
配体从亲和基质中脱落从来都是一个问题,尤其是在洗脱条件较为恶劣的时候。在这方面,G 蛋白也是有优势的,它与琼脂糖介质有许多结合位点,如此紧密的结合力把脱落水平减小到了最低。事实上在相当广泛的洗脱条件下,该介质只有极低水平的配体脱落。Protein G Sepharose纯化单抗实例:
Column:HiTrap Protein G HP, 1 ml and HiTrap Desalting
Sample:
Eluted mouse monoclonal IgG from HiTrap Protein G HPBinding buffer:20 mM sodium phosphate, pH 7.0Elution buffer:0.1 M glycine, pH 2.7
Flow rate:2 ml/min
Detection:
UV: 0-2.0 AUFS, 5 mm cell, 280nmpH: measured on 0.5 ml fractions
**鉴于洗脱条件可能十分恶劣,建议将洗脱的单抗片段
收集于中和缓冲液中 (每毫升片段60-200µl 1M Tris-HCl,pH=9.0) 或用Sephadex G-25进行缓冲液交换,以保证得到片段的pH 值最终近乎中性。
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注意
1. 大多数免疫球蛋白在pH 值高于2.7 (或者更低) 时很难 被洗脱下来。因此洗脱条件往往比较恶劣,如果由此导 致抗体失去活性,则应考虑使用A 蛋白琼脂糖。它的好 处是洗脱条件更加温和。
2. 大多数物种及亚类的IgG 在生理pH 及离子强度下与G 蛋白结合。
3. 如果目的蛋白与配体间作用较弱,则应该避免多余的洗 涤步骤,以免过分减少产量。
4. 用脱盐柱对纯化的IgG 片段进行去盐处理或者将其转移 至适宜的缓冲液 (见20页) 。
5. G蛋白琼脂糖介质的再利用:依样品的天然属性而定, 只可在前后样品相同的情况下实现,否则会产生交叉 污染。
6. 若样品体积较大,则可以将几个HiTrap Protein G HP柱 连续地接合起来或者在一个大柱子中装填以松散的介 质。
保存
20%乙醇洗涤柱子和介质 (五个柱体积洗装填的介质) ,于4-8˚C保存。
MabSelect
MabSelect TM 是一种新的BioProcess TM 亲和介质,用于填充床层析中可以从大量的样品中分离出单克隆抗体。特点
1. 其设计保证一天内可以完成超过10000升高表达发酵样 品的抗体分离。
2. 在工艺许可条件下有高体积流速,线性流速达 500 cm/hr。
3. 通过定向结合配体及优化了的基质加强了与免疫球蛋白 的结合能力。
4. *在BPG TM 、FineLINE TM 、INdEX TM 、Chromaflow TM 这 些柱子中填充,其分离能力与所填体积成正比,易于线 性工艺放大。
5. 该介质可以耐受严酷有效的CIP 操作。
理化性质
组成:高度交连的琼脂糖;
包装大小:40-130µm (d 50v H85 µm); 配体:重组A 蛋白 (E. coli); 偶联化学成分:环氧基;
动态结合能力:约为30mg 人IgG/ml介质;化学稳定性:于所有水溶缓冲液中稳定; 通常所用缓冲液为:100mM H3PO 4 (pH 1.6),
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10 mM HCl (pH 2),10 mM NaOH (pH 12), 0.1 M 20%柠檬酸钠/HCl (pH 3),6M GuHCl,20%乙醇,2%苯甲醇; 推荐pH 值:工作范围3-10
CIP操作范围2-12; 推荐流动相速:500 cm/h; 热稳定的温度区间:4-40 ˚C;
推荐长时间保存条件:4-8 ˚C,20%乙醇;
实验条件
适宜的缓冲液 (举例)
缓冲液A:0.05M硼酸,4.0M NaCl,pH=9.0缓冲液B: 0.05M磷酸钠,0.05M柠檬酸钠,0.3M NaCl, pH=3.0实验步骤:
1. 以10个柱体积的缓冲液A 平衡柱子。2. 上样 (少量抗体) 。
3. 以5个柱体积的缓冲液A 洗柱
4. *以10个柱体积的线性梯度洗柱直至洗液为100%的缓 冲液B
5. 收集片段于滴定稀释溶剂中 (如1.0 M Tris-HCl,pH = 8.0,稀释溶剂的体积等于程序片段体积的5%)
6. 以5到10个柱体积的100%的缓冲液B 对柱子实现再生7. 用缓冲液A 对柱子再平衡
* 沉淀或变性的物质:以2个柱体积的6M 胍或者10 mM NaOH2 or 0.1 M H3PO 4清洗后,立即以5个柱体积滤过 灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~ 8) 洗柱,逆转流动方向* 疏水杂质的洗涤:以2个柱体积的非结合物质离子去垢 剂洗柱 (如conc. 0.1%),立即以至少5个柱体积的滤过 灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~ 8) 洗柱,逆转流动方向。或 者以3至4个柱体积的70%乙醇或30%异丙醇洗柱。立 即用至少5个柱体积的滤过灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~ 8) 洗柱,逆转流向。
注意:当使用高浓度有机溶剂时,应采用递增梯度避免气泡的产生。
CIP 方法因实验样品不同应有所改良。而日常进行CIP 的频率亦取决于样品的性质。不过推荐每5个循环后进行一次CIP 处理。依照污染物的性质采用不同的CIP 程序。如果污染严重,则需要进一步优化CIP 手册。
消毒
消毒把微生物对床的污染减小到最低。
用2% hibitane digluconate及20%乙醇组成的溶液平衡柱子,静置6个小时,然后用至少5个柱体积的灭菌结合缓
冲液洗涤。或者用含0.1M 乙酸及20%乙醇的溶液平衡柱,工作中也经常碰到。BlueSepharose 介质是去除白蛋白的静置1小时,然后用至少5个柱体积的灭菌结合缓冲液洗涤。或者用70%乙醇平衡柱,静置12个小时,然后用至少5个柱体积的灭菌结合缓冲液洗涤。
注意
当使用70%乙醇时,需要有特定的规则 (防爆区域及设备) 四.单抗纯化策略及注意事项
常规策略:①总的来讲作为一类蛋白,单抗的分子量IgG :150-160 kDa,IgM :900 kDa,等电点pI 在4到9之间,大部分超过pI6,比其它血清蛋白更偏碱:②IgG 的疏水性更强,在硫酸氨浓度30-50%时会沉淀。在水溶液中的溶解性更好,在近等电点和底盐时溶解度会减弱,在室温下相对比较稳定,除在相对偏酸的溶液中不稳定外一般缓冲液下均较稳定。③所以在单抗纯化时既要了解他们的共性又要了解个性,整个纯化策略与其他蛋白纯化一样可分为三步,粗提用来分离浓缩和稳定样品,中度纯化去除大部分杂质,精细纯化达到最高纯度。④在选择一个纯化策略时应考虑几个因素,如抗体的来源,单抗本身的理化性质,最终产品的生产规模及纯度要求,目的蛋白的分析鉴定方法,药品管理部门对产品的要求。在抗体来源中单抗本身的性质,样品的培养和处理方法,潜在污染及发酵液蛋白浓度均会影响纯化策略的设计。⑤如果是大量单抗的生产,体外单抗培养技术是首选。越来越多的单抗用哺乳动物细胞来培养,例如用CHO 表达的单抗表达水平在1-2 g/L。在样品的制备和粗提中常用的是离心和超滤,安玛西亚公司的扩张床技术因把离心超滤及粗纯有效的结合,现被越来越多的应用。⑥大部分单抗在中性偏碱和低电导的缓冲液中是稳定可溶的,但是有一些抗体在温度低于37˚C时溶解度会降低,易结晶;强碱性单抗在多价阴离子缓冲液中易形成稳定的的离子复合物导致抗体之间的聚合;单抗同时经常与核酸形成复合物,这种结合在0.3M-10M NaCl存在时是可逆的,所以在单抗纯化中粗纯时选择缓冲液是非常重要的。⑦粗样品的预处理可选用脱盐交换缓冲液,浓缩把样品部分纯化转入所需环境,起始纯化一般选用离子交换或亲和层析,产品纯度可达50-98%,最终纯化可选凝胶过滤或疏水层析。
单抗纯化中杂质的去除杂蛋白:不论是腹水或细胞培养单抗白蛋白,转铁蛋白及宿主免疫球蛋白是三种主要的杂质,白蛋白的量比较大,转铁蛋白和许多单抗有相似的带电性质,宿主免疫球蛋白或牛免疫球蛋白的性质和要分离的目的单抗有很多相似的性质,另外脂蛋白可能比较容易阻塞柱子,这在实际一种方法。二聚体和寡聚体在蛋白浓度较高时容易形成,这些聚合物将降低样品的生物活性,一般来讲凝胶过滤Superdex 200能有效去除这些杂质。牛免疫球蛋白的污染问题在单抗纯化中十分显著,一般来说用疏水层析和离子交换可能会除去此类杂质。白蛋白和转铁蛋白也可用离子交换和疏水的方法去除,有一些单抗比它们的疏水性更强,疏水介质可以使目的蛋白结合而使杂质流穿。核酸和内毒素:核酸在高盐条件下可与蛋白解离,这时疏水层析是一个很好的选择;阳离子交换介质可以让核酸和内毒素流穿;阴离子交换介质在合适的pH 下可以让内毒素吸附,使样品穿透。
脱落的亲和配体的去除
凝胶过滤层析,在合适的pH 条件下,可用于除去A 蛋白-IgG 聚合物,该聚合物会率先从柱上洗脱下来。阳离子交换层析,是去除A 蛋白残基的有效工具,尤其是特定的单抗具有阳离子交换结合性质的时候。该操作在抗体与A 蛋白解聚的pH 条件下进行,由于A 蛋白难以与阳离子交换介质结合,故将畅通无阻地通过,或者在梯度早期洗脱。阴离子交换层析可以用于减少泄漏的A 蛋白造成的污染。这种方法最适用于处理那些与阴离子交换介质有极少吸附的抗体。由于A 蛋白具有很强的结合阴离子交换介质的能力,A 蛋白-IgG 复合物表现出很强的留在阴离子交换介质上的倾向。而未与A 蛋白形成复合物的IgG 就正好相反。这些复合物通常不会形成独立的峰,而是时常显现出拖尾肩样。为了确定阴离子交换层析去除A 蛋白复合物的能力,以20mM Tris-HCl,pH=8.5平衡柱,上样后以线性梯度洗脱,最后洗脱液的浓度达到0.25M NaCl (20mM Tris-HCl, pH=8.5),收集抗体峰的片断,筛选A 蛋白。
检测方法:对分离后峰纯度的检测可用电泳的方法,如SDSPAGE, Native PAGE, IEF等, 也可用凝胶层析的方法,对功能的检测可用免疫电泳,表面核磁共振,动力学测试,ELISA 等。
五.单抗纯化应用举例
细胞培养单抗:
18112893 Rapid optimisation and development ofantomated two-step purification procedure for monoclonalIgG antibodies; AKTAFPLC
用AKTAFPLC 两步自动纯化鼠源IgG ,纯化方法包括捕获和精细纯化两步,细胞培养上清用0.45um 的膜过滤后用Hitrap rProtein A直接吸附目的蛋白,这步除去大量的杂
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质,低分子量的物质并对样品进行浓缩,在AKTAFPLC 上对吸附和洗脱条件进行自动摸索,结合缓冲液的摸索主要是对结合时缓冲液盐浓度的选择,最佳的盐浓度是指结合时没有流穿和洗脱峰最大的盐浓度,最佳的洗脱条件是指逐步降低pH 时能达到最佳分辨率的最高pH ;第二步用HiLoad 16/60 Superdex 200进行精细纯化,去除微量杂质。
图a (对盐浓度的筛选)
图b (Superdex 200精细纯化)
检测用小鼠单抗:Two step purification of a mouse monoclonal IgG1 fordiagnosticuse 这是一个能达到诊断试剂要求的纯化单抗的例子,目的蛋白是抗IgE 的单抗IgG1,经杂交瘤细胞培养获得,样品经0.05M 的硫酸氨沉淀和过滤后可以用疏水层析对目的蛋白进行捕获 (图例如下) ,单抗可以牢固的和介质结合,大部分的牛血清蛋白流穿,在这步中需对缓冲液的硫酸氨的浓度进行优化得到最好的选择性。粗纯一步优化后纯度可达95%,所以再用一步凝胶过滤精细纯化纯度可达99%。
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不含Fc 区的单抗片段:
Three step purification of a recombinant Fab fragment这个例子成功应用了三步纯化策略来纯化一个Fab 的片段,用离子交换捕获,疏水层析进行中度纯化,再用离子交换精细纯化。这三步策略证明可以成功放大,详细内容可见安玛西亚公司的应用资料:18-1111-23。
目的蛋白是重组的Fab 片段,特异的与HIVgp-120结合,是用 E.coli BM179 MCT61表达的。样品经Dnase 处理后用Streamline SP直接捕获,省去了离心和其他预处理。中度纯化选择疏水层析是因为该技术与离子交换互补,从streamline 下来的样品已在高盐中,步与步之间的样品处理很简单。疏水层析的结果较难预测,可用HICselection Kit 来筛选最佳填料,最终选定Phenyl Sepharose FF (highSub) (图例如下) 。精细纯化一般首选凝胶过滤,但在这个实验中因目的蛋白和杂质的分子量相差较
少,杂质难去
除,所以用Source15 S 进行精细纯化,因为其颗粒小而均一,选择合适的梯度可获得较理想的效果。
大规模纯化治疗用单抗药物:18113948 Intensification of a large scale commercial monoclonalantibody purificationprocess
商用治疗性单抗从早期产量需求的毫克级到现今纯化规模的公斤级,对单抗纯化技术的挑战和要求越来越高,荷兰的Centocor BV公司在这一领域有成功的经验。他们在纯化中用扩张床技术取代离心和超滤;用Q 和SP sepharose high performance等高载量和高分辨率的填料增加上样载量;发酵液和纯化过程整和在一起,提高纯化效率。这样一次纯化可得8-16公斤纯化产品。 (摘自Downstream 30, 22-23)
长效治疗性Fab 片段的制备 (参照18-1150-47, P27)
作为治疗慢性病的治疗性单抗药物,药物的规模性供应,长效性和低成本是很重要的。Celltech 公司在这方面有一套自己的策略。他们用大肠杆菌这种低成本易放大的系统表达人源Fab 片段,用简单的非亲和层析技术纯化,纯化后用PEG 进行修饰以延长药物寿命。细胞周质的Fab 片段经粗提后用离子交换和疏水层析进行纯化,以达到预期的纯度。经PEG 偶连的Fab 片段经离子交换做最终纯化。
RPAS 纯化模式:一种新的纯化重组E-tagged ScFv抗体的方法 (18-1113-78)
用噬菌体展示技术表达可溶性有功能的重组抗体片段是研究治疗性单抗的一种新技术,单链的Fab 用pCANTAB 5E载体在大肠杆菌中表达,表达的ScFv 有一个13个氨基酸的标记,可用Anti-E Tag亲和层析柱纯化,在中性的缓冲液中结合,降低pH ,目的片段可被洗脱下来。整个纯化过程只用10-15分钟,经纯化后目的蛋白经检测有免疫活性,纯度达95%。在用Hitrap Anti-E Tag柱纯化时流速,样品体积,样品浓度均对实验结果有影响,具体结果见图。
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