增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp ）
在莱茵衣藻中表达的研究
（生命科学学院，生物工程系生物技术专业 吴锦霞）
（学号：2000302055）
内容提要：通过构建增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp ）衣藻表达载体，利用“珠磨法”将e-gfp 导入细胞壁缺陷型莱茵衣藻（CC-849）中，经Zeocin 抗性筛选出转e-gfp 基因衣藻；在光照下培养转基因藻，经PCR 和RT-PCR 对转基因藻进行分子检测，结果表明e-gfp 已经稳定整合到莱茵衣藻基因组中，并具有转录活性；随后的转基因藻相对荧光强度分析表明转e-gfp 衣藻的相对荧光强度明显高于野生型衣藻。
关 键 词：衣藻；e-gfp 基因；
教师点评：该文通过对外源基因（e-gfp ）在衣藻中的表达研究，构建了一个可用于外
源基因在莱茵衣藻中表达的体系。设计思路清晰，并得到了较好的实验结果。通过本文的研究，掌握了分子生物学的基本实验技术，是一篇具有较高水平的本科毕业论文。（点评教师：胡章立）
引言
莱茵衣藻是单细胞真核绿藻，有两条鞭毛能游动，能进行光合作用。因其具有生长周期短，生长迅速，光合效率高而被称为“光合酵母”，而且它是少数三套基因组都能进行遗传转化的植物。长期以来人们都在探索在衣藻里表达感兴趣的基因，随着基因枪技术的出现，在衣藻叶绿体里表达外源基因的技术已经日趋成熟；但是，外源基因在衣藻核基因组中较难获得稳定有效的表达。许多外源基因导入衣藻基因组后，会出现“基因沉默”问题，或是在基因水平或是在蛋白水平受到阻遏。而对于导入基因不表达现象可能的解释有以下几点：1、甲基化修饰；2、密码子偏爱；3、缺少内含子或其他非编码区；4、采用了异源的启动子和终止子；5、异常基因降解；6、伴随分离；7、外界因素影响等，有鉴于此，所以我们需要构建一个能使外源基因在衣藻中高效稳定表达的载体。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP ）基因是一个新的标记基因，来源于多管
水母属的Aequorea victoria，编码238个氨基酸残基，分子量为2688Da 。经蓝光或紫外激发而发射绿色荧光。其吸收波长为460nm ，发射波长为509nm 。GFP 的生色基团是由位于65－67位的Ser 、Tyr 和Gly 被修饰后共价连接而形成的。而增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp ）是在GFP 的基础上，第64位氨基Phe 被替换成Leu ，第65位氨基Ser 被替换位Thr ，在保留gfp 基因原有特点的基础上，其荧光强度为gfp 的4～35倍，因此，我们选用e-gfp 基因作为报告基因。
与其它常用的报告基因或报告分子相比， GFP具有许多优点：① GFP 的荧光易于检
测。用手提式长波长紫外灯、荧光解剖镜或荧光显微镜都可检测到足量表达的GFP 。②用GFP 可进行活体检测，尤其对透明体可进行反复观测。③GFP 的构象非常稳定，不易发生光漂白（photo bleaching），这有利于荧光激活的细胞筛选。④GFP 是合适的蛋白标签。由于GFP 的分于量小（只有54KD ），可以将GFP 基因和目标基因构建在一起表达融合蛋白。无论GFP 在目标蛋白的N －端，还是C －端，它都不会影响目标蛋白的构象。因此借助荧光显微镜等手段可活体追踪目标蛋白。⑤GFP 在光照下是稳定的，各种光照都不会引起其变性，即使与别得蛋白质融合后，也能利用荧光显微镜很方便地检测到它。
用e-gfp 作为报告基因在原核生物和酵母中进行表达已得到广泛的使用，并取得良好的
效果，但将e-gfp 基因作为报告基因在衣藻中表达还比较鲜见，所以，本实验希望通过将e-gfp 基因整合到衣藻细胞中进行表达，而衣藻细胞经蓝光激发下呈现红色荧光，对e-gfp 基因发射的绿色荧光不产生干扰，从而有利于日后作为检测载体表达效率的报告基因。
1、实验材料和仪器
1.1菌株和质粒
克隆载体p105（含1、5－二磷酸核酮糖羧化酶小亚基编码基因（RBCS2）的启动子和
终止子）、衣藻转化载体p124（带有ble 基因，使宿主细胞具有腐草霉素和Zeocin 抗性）、
大肠杆菌菌株（E.coli ）XL1由本实验室保存；
E-gfp 质粒（携带有e-gfp 基因）由中科院上海生化所惠赠。
1.2衣藻材料
莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii cc-849）由香港城市大学植物分子生物学与环境
生物技术实验室提供，属细胞壁缺陷株。
1.3主要试剂
限制性内切酶、klenow 片断、去磷酸化酶、T4连接酶；质粒提取试剂盒、PCR 片断回
收试剂盒（PCR Fragment Recovery Kit Ver.2.0）、DNA 快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation
Kit ）、DNA 片断纯化试剂盒（DNA Fragment Purification Kit）、RT-PCR 反应试剂盒；DNA
Marker （λDNA/EcoRⅠ＋Hind Ⅲ）、DL 2000、ExTaq Mix（dNTP 、Taq 酶、缓冲液）等均购
自TaKaRa 生物（大连）有限公司）。
PCR 引物由上海生工生物工程公司合成；
DNA 快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation Kit）购自Roche 公司
Trizol 试剂购自Invitrogen 公司；
其他：氯化钙、氨苄青霉素、饱和酚、氯仿、氧化铝等为国产，有关化学试剂，均为
分析纯或分子生物学级（Molecular biology grade）。 1.4主要仪器设备
仪器 型号 制造商
2K15G Refrigerated Centifuge 离 大型离心机
SIGMA aborzentrifuge GmbH 1-13 Laboratory Centrifuge 心 小型离心机
机
电子天平－E 梅特勒－托利多仪器（上海）有
限公司
PowerPac 300 电泳仪 Bio －Rad Laboratories，Inc.
PH 计－S PH计 梅特勒－托利多仪器（上海）有
限公司
高压消毒锅－300V A 新骏实业股份有限公司
光照培养箱 LRH －250－G 型 广东医疗器械厂
WTB Binder Labor－Technik GnbH
KB15 细菌培养箱 WTB Binder Labor－Technik
GnbH
PCR Sprint Thermo Hybaid in UK PCR 扩增仪
PTC-200 Pecfier Thermal Cycler MJ Research
Ultrospec 2000 Pharmacoa Biotech 紫外分光光度计
HITACHI 荧光分光光度计 F －4500FL Spectrophotometer
2、 主要试剂的配制或成分
2.1衣藻培养基：
培养基名称
——
4×Beijerinck salts
――
2×PO4 for HSM ―― ―― ――
冰醋酸 ～1ml ―― ――
浓盐酸 ―― ～1.5ml ――
2.2细菌培养基（LB 培养基）：
药品
细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tyrptone ） 用量 10g
5g 细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract）
去离子水 950ml
在离子水中溶解后，用5mol/LNaOH滴定，至PH=7.0，然后高温高压蒸气灭菌备用。
2.3电泳胶的浓度及其配制：
配制100ml 1％TAE 琼脂糖电泳胶：在100ml TAE缓冲液中，加入1g 琼脂糖，加热至
沸腾，待冷却到40℃左右时加入1ul EB荧光液。
2.4上样缓冲液：0.25％溴酚蓝和40％（w/v）蔗糖水溶液混合成，存于4℃。
3、 实验方法
3.1 SDS碱裂解法制备质粒DNA ：小量制备
（1）挑转化后的单菌落，接种到2ml 含有适当抗生素的丰富培养基（LB ），37℃，200-300rpm
摇床上培养过夜。
（2）取1.5ml 菌液至EP 管(1.5ml离心管），4℃、13000r/min、30sec 离心收集沉淀。
（3）弃上清，尽可能吸干培养液，加入预冷的碱裂解液Ⅰ100ul ，剧烈振荡。
（4）加入200ul 新配制的碱裂解液Ⅱ，颠倒4－5次，以混合内容物，切勿振荡！冰浴10min 。
（5）加入150ul 冰预冷的碱裂解液Ⅲ，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分
散均匀，然后冰浴3－5min 。
（6）4℃、15000r/min、离心5min ，将上清转移到另一离心管中。
（7）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提， 4℃，15000r/min，离心2min ，将
上清转移到另一离心管中。
（8）加入两倍体积无水乙醇沉淀DNA ，－20℃冰箱沉淀1h 以上；
（9）4℃、15000r/min、离心5min 弃上清，用冰预冷的70％乙醇1ml 洗涤DNA 沉淀，弃
上清，倒置于滤纸上，使乙醇完全挥发，直至试管内没有看见的液体存在。
（10）溶于20ul 无菌水或含有去DNA 酶的RNA 酶的TE 溶液。
（11）通过电泳鉴定该质粒是否为目的质粒以及判断质粒的纯度。
3.2限制性内切酶酶切反应 （遵照所购试剂说明书）
(1) 据实验需要取一定量的DNA ，加入适量的限制性内切酶及相应的反应缓冲液、无菌去
离子水，使反应体系中的甘油浓度
(2) 置于适宜反应温度水浴1～3h 。
(3) 取3～5ul 反应液于琼脂糖凝胶电泳检查。
(4) 试验中需要进行双酶切反应，如两个限制性内切酶在同一温度、同一缓冲系统中的活
性均有75％～100％时，可同时进行，反应模式同上。如反应温度或缓冲系统不同时，
则按照先低温后高温、先低盐后高盐的顺序进行，或第一酶酶切后，用酚仿抽提及乙醇
沉淀回收DNA 后再进行第二酶酶切反应。
3.3胶回收
用试剂盒从Agarose 胶中回收DNA ，试剂盒购自TaKaRa ，方法参照PCR Fragment
Recovery Kit Ver.2.0说明书
3.4连接 用快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation Kit）
载体DNA 和插入片断按1：3的摩尔比加入，所加入DNA 的最大量不要超过200ng 。
（1）10ulDNA(载体与插入基因) 溶于1×conc. DNA稀释缓冲液
（2）再加入10ulT4 DNA 连接缓冲液(2×conc.)(vial 1)
（3）充分混匀
（4）Add 1 ul T4 DNA ligase(vial 3)
（5）充分混匀
（6）16℃，过夜
3.5一步法制备感受态细胞并进行转化
（1） 吸取1ml OD600约0.5～0.6的细菌到1.5ml 离心管中，4000r/min离心5分钟，彻底
去除上清。
（2） 加入0.1ml 冰水预冷的SSCS Solution轻轻悬浮菌体，可立即转化或冻存于－70℃待
用。
（3） 加入10ul 用于转化的DNA ，混匀DNA 盒细胞并在冰上放置10分钟。
（4） 在42℃放置90s ，然后再在冰上放置5min 。
（5） 加0.8mlLB 培养基到离心管中，37℃水浴中200r/min振荡培养1h 。
（6） 将细胞涂布于有相应抗性的LB Agar平板上。
对于大量制备，可相应增加SSCS Solution。重悬后的细胞应分装成50～100ul ，然
后储存于－70℃。
3.6 e-gfp基因衣藻表达载体的构建
3.6.1克隆载体p105G 的构建
E-gfp 质粒（携带有e-gfp 基因）由中科院上海生化所惠赠，为了得到实验所需量的质粒，
现将E-gfp 质粒转入到感受态菌株XL1 blue中，挑取单克隆进行摇瓶培养，大量扩增e-gfp
基因，并通过SDS 碱裂解法提取E-gfp 质粒，凝胶电泳检测并定量。
通过NotI 进行酶切E-gfp 质粒后，加Klenow 片断补平，并用酚氯仿抽提， 乙醇沉淀
过夜。离心收集沉淀并用去离子无菌水溶解，再用SmaI 酶切，经电泳分离得到e-gfp 基因
（大约740bp ），并用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收。
用PmacI 酶切p105质粒，经电泳分离得到线状的p105质粒，并用试剂盒从琼脂糖凝
胶中回收质粒。
插入片段（e-gfp 基因）和载体（p105）按3：1的摩尔比连接过夜，然后转化大肠杆
菌E.coli XL1中，通过酶切分析和PCR 筛选出转化子，得到重组质粒p105G 。
3.6.2表达载体p105G124的构建
筛选得到的阳性重组子p105G 经大量扩增培养后，用SDS 碱裂解法提取质粒，并用
EcoRI 酶切p105G ，经电泳分离并回收e-gfp 基因的表达框架（约1.7kb ）。
插入片段（e-gfp 基因的表达框架）和载体（p124）按3：1的摩尔比连接过夜，然后
转化大肠杆菌E.coli XL1中，通过酶切分析和PCR 筛选出转化子，得到重组质粒p105G124。
3.7衣藻的转化
通过“珠磨法”将外源基因转化到衣藻中，即将含有e-gfp 基因的表达载体p105G124
转入到衣藻细胞中，并在含Zeocin 抗性平板（20ug/ml）上进行筛选。
（1）CC-849在连续光照下，在TAP 培养液中培养至对数期，细胞数约为1－2×106 cells/ml。
（2）5000rpm, 室温离心5min ，收集CC-849。
（3）弃上清，用灭过菌的TAP 培养液重悬沉淀，调整细胞浓度至2×108cells/mL
（4）吸取300ul 悬浮液到5ml 的试管里（里面有灭过菌的石英砂）。
（5）目的DNA p105G124用NotI 酶切成线状，取1μg 加入（4）中的试管中，同时建立一
个不加目的DNA 的对照组（CK ）。（注：目的DNA 可以用CsCl 2梯度离心法或试剂盒
提取）。
（6）把 CC-849/石英砂/外源DNA 混合物在振荡器上以最高速度振荡15秒。
（7）把混合物转移到25mL 的带螺旋帽的离心管中，加入10mL 灭菌TAP 培养液，在100rpm
摇床过夜培养（18℃），让细胞恢复。
（8）3000rpm ，室温5min ，收集细胞。
（9）弃上清，用0.5mL TAP缓冲液小心重悬，加入3.5mL0.5％TAP 培养基，混匀后倒在
TAP 平板上（含20μg /ml、Zeocin ）
（10）静置待凝固，倒置平板，放在22℃光照培养箱里培养3 周，待平板上长出绿色的单
克隆。
3.8衣藻DNA 的提取
（1）取20m1处于对数生长后期的衣藻培养液．4℃，5000r ／min ，离心5min ，收集细胞。
（2）弃上清，残留少量液体，用1ml 衣藻培养液重悬，取500ul 到1.5mlEP 管，4℃，5000r
／min ，离心1min 。
（3）弃上清，用350ulNET(0.1mo1/LNaCl，50mmol ／L EDTA，20mmol ／L Tris—HCl ，pH
8.0) 重悬衣藻细胞沉淀，加入50ul ProteinaseK(10mg／ml) 、50ul 20％SDS ，混匀，55
℃水浴2h 。
（4）冰上冷却后，加入200ul 5mol／L KAc，冰上静置30min ，4℃．12000r ／min 离心5min 。
（5）取上清，加入等体积的酚／氯仿／异戊醇(25：24：1) 抽提两次，再用等体积的氯仿抽
提1次。抽提时4℃，13000r ／min ，离心5min 。
（6）取上层水相，加入2倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后置于-70℃放置15min 。
（7）4℃，12000r ／min 离心10min ，弃上清，加入500ul70％乙醇洗涤沉淀，4℃，
13000r ／min ，离心5min 。
（8）干燥后，溶于30u1 TE（含RNase ）缓冲液中。
（9）取2～5ul 电泳分析。
3.9衣藻RNA 的提取
取20ml 对数生长期的转基因衣藻，4℃，5000r/min，5min 收集细胞。提取RNA 方法:
使用购自Invitrogen 公司 TRIzol试剂，按试剂说明书所述方法提取。
3.10 PCR鉴定
根据e-gfp 基因序列，利用计算机辅助系统设计一对PCR 引物，由上海生工合成并聚
丙烯凝胶电泳纯化。
e-gfp 基因引物序列为：PrG1：5’CAAGTTCAGCGTGTCCG3’
PrG2: 5’CCAGCAGGACCATGTGA3’
此引物可从e-gfp 基因中扩增出590bp 片段。
3.10.1重组载体的PCR 鉴定
PCR 反应条件：94℃变性3min ；
94℃，1min ；
54℃，30sec ；
30 Cycles
72℃，30sec ；
72℃延伸10min 。3.10.2转基因衣藻的PCR 鉴定
PCR 反应条件：95℃变性5min ；
95℃，1min ；
55℃，50s ； 30 Cycles
72℃，1min ；
72℃延伸10min 。
3.10.3转基因衣藻的RT －PCR 鉴定
RBCS2启动子是来源于衣藻的光诱导型启动子，在光照条件下培养衣藻就可表达目的
基因。所以光照条件下培养转基因衣藻，提取衣藻总RNA ，使用Oligo dT-Adaptor Primer,
反转录合成的cDNA 链为模板，PrG1、PrG2为引物进行扩增，得到e-gfp 基因的部分片段
（约590bp ）。方法参照RNA PCR Kit（AMV ）Ver.2.1
RT-PCR 条件： 30℃，10min ；
50℃，30sec ；
99℃，5min ； 1 Cycle
5℃， 5min。
PCR 条件：94℃变性5min ；
94℃，2min ；
52℃，1min ；
30 Cycles
72℃，2min ；
72℃延伸3.11转基因衣藻总蛋白的提取及荧光强度测定
3.11.1转基因衣藻总蛋白的提取
分别取40ml 未转基因的对照衣藻和各个转基因衣藻，4℃，5000r/min，离心5min ，
收集细胞。分别置于冰冷的研钵中，再各加4ml 冰冷的CBS 提取液
（1.59gNa 2CO 3,2.93gNaHCO 3，加入蒸馏水溶解至1000ml ）和少许氧化铝，研磨成浆状，
4℃、10000r/min、离心5分钟，取上清3ml 。
3.11.2总蛋白含量的测定
利用紫外分光光度计在280nm 处测定供试溶液中蛋白质的总含量。
3.11.3 GFP绿色荧光强度的测量
利用荧光分光光度计在460nm 激发光下激发，测定各组织蛋白提取液在509nm 处的
发射光强度。测得所得数据后依据下面的公式换算出各种植株每克蛋白中的EGFP 的相对
荧光强度：
相对荧光强度=发射光强度÷(1.5×总蛋白量)
然后再算出各转基因材料中的EGFP 的相对含量值作为衡量该组织中e-gfp 基因表达
水平的相对标准：
相对含量值=供试材料的相对荧光强度值-对照材料的相对荧光强度值
（该方法参照：利用荧光分光光度计定量分析GFP 基因的表达水平 笱吉庆 李敏 张锐
郭三堆 生物技术通报）
4、结果与讨论
4.1e-gfp 基因分离
e-gfp 基因的载体构建，如下图所示：
smaI
实验所需的e-gfp 基因是从E-gfp 质粒（见图1）中酶切得到的，通过用NotI （Klenow
补平）和SmaI 酶切，得到的e-gfp 基因大约是740bp （见图2）。
图1 图2
4.2表达载体p105G 构建与分析
利用限制性内切酶酶切，回收目的片段e-gfp 基因(约740bp) ，并连接到载体p105中，e-gfp 基因插入到p105载体的1，5－二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco ）小亚基编码基因的启动子和终止子之间形成重组质粒p105G （见图3）。由于e-gfp 基因与p105载体是平端与平端的连接，存在正向插入和反向插入问题，所以利用e-gfp 基因23bp 处具有NcoI 位点，p105载体上的终止子（大约231bp ）处具有KpnI 位点，采用NcoI 和KpnI 双酶切p105G ，则正向插入得到的片断是954bp ，反向插入得到的片断是254bp ，通过电泳筛选出正向连接的重组子。
图3
用引物PrG1、PrG2对构建好的载体进行PCR 鉴定，能扩增出e-gfp 基因的部分片段（约590bp ），与e-gfp 的扩增结果一致（见图5）。
4.3转化载体p105G124的构建与分析
利用限制性内切酶酶切，回收e-gfp 基因的表达框架（约1.7kp ），并连接到载体p124中，形成重组质粒p105G124。用EcoRI 可以从p105G124上切下e-gfp 基因的表达框架（约
1.7kp ），与用EcoRI 酶切p105G 的结果一致（见图4）。同样的，用引物PrG1、PrG2对p105G124进行PCR 鉴定，能扩增出e-gfp 基因的部分片段（约590bp ），与e-gfp 的扩增结果一致（见图5）。
图4 图5
衣藻e-gfp 克隆载体（p105G124）结构，如下图所示：
4.4通过“珠磨法”获取转e-gfp 基因衣藻
将构建得到的载体p105G124通过“珠磨法”转入到衣藻cc-849中，光照培养约3 周，经Zeocin 抗性筛选得到约8个单克隆。
为了提高外源基因的转化率，将酶切后的p105G124通过DNA Fragment Purification Kit进行纯化，与未纯化的转化组比较结果如下：
外源基因 转基因藻单克隆数 转化率
纯化的p125G124
未纯化的p105G124 6个 2个 6转化体/ug质粒DNA 2转化体/ug质粒DNA
实验表明，通过用DNA Fragment Purification Kit对外源基因纯化可以提高外源基因在衣藻细胞的转化效率，因为使用试剂盒可以将酶切反应时的酶、DNA 引物、dNTP 等去除，以降低外源物质对转化率的影响。
4.5转基因衣藻的DNA-PCR 分析
提取转e-gfp 基因衣藻DNA （见图6），用引物PrG1、PrG2进行PCR 检测，能扩增出e-gfp 基因的部分片段（约590bp ），与e-gfp 基因的扩增结果一致（见图7），表明e-gfp 基因已经整合到莱茵衣藻核基因组中，其中有三株转基因藻（5，6，7泳道）的扩增效率较差，可能是e-gfp 基因在衣藻基因组中整合的拷贝数比较低。
图6 图7
4.6转基因衣藻的RT-PCR 分析
提取转e-gfp 基因衣藻的总RNA （见图8），对反转录得到的cDAN 链用引物PrG1、PrG2进行扩增，能扩增出e-gfp 基因的部分片段（约590bp ），与e-gfp 的扩增结果一致（见图9），表明整合进衣藻DNA 组的e-gfp 基因在转录水平得到表达，从第一次RT-PCR 的结果可以看出e-gfp 基因在衣藻转录水平的表达效率并不高。由于第一次RT-PCR 结果的浓度很低（见图9中2），所以取2ul RT-PCR结果进行第二次PCR （见图9中3－5）。
图8 图9
4.7转基因衣藻的荧光分析
e-gfp 经蓝光激发而发射绿色荧光，其吸收波长为460nm ，发射波长为509nm ，所以可以通过荧光分光光度计测量其蛋白提取液在460/509时的荧光强度来分析。本实验共测试了7种转基因衣藻和1种野生型莱茵衣藻（cc-849），用CBS 提取这些衣藻的总蛋白，分别用紫外分光光度计和荧光分光光度计测转基因衣藻总蛋白含量值和EGFP 的荧光强度值，共得原始数据16个，按照方法中所述的计算方法算出每个样品的EGFP 含量的相对标准值。结果如下：
cc-849
总蛋白量
(OD280)
发射光强度
（460/509）
相对荧光
强度
相对含量值 0 从统计表可以看出，除7号藻外所得到的转化株的荧光强度都明显高于野生型莱茵衣
藻，其中以1号（16.433）和4号（13.221）最高，7号藻荧光强度接近与野生型衣藻，可能是没有EGFP 表达或表达量极低；相对荧光强度显示了不同转e-gfp 基因藻EGFP 表达的水平，表达高低依次是1>4>3>2>6>5>7。通过该方法可以粗略的观察e-gfp 基因在衣藻中蛋白水平的表达高低。
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2001年第五期
（指导老师 胡章立博士 教授）
增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp ）
在莱茵衣藻中表达的研究
（生命科学学院，生物工程系生物技术专业 吴锦霞）
（学号：2000302055）
内容提要：通过构建增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp ）衣藻表达载体，利用“珠磨法”将e-gfp 导入细胞壁缺陷型莱茵衣藻（CC-849）中，经Zeocin 抗性筛选出转e-gfp 基因衣藻；在光照下培养转基因藻，经PCR 和RT-PCR 对转基因藻进行分子检测，结果表明e-gfp 已经稳定整合到莱茵衣藻基因组中，并具有转录活性；随后的转基因藻相对荧光强度分析表明转e-gfp 衣藻的相对荧光强度明显高于野生型衣藻。
关 键 词：衣藻；e-gfp 基因；
教师点评：该文通过对外源基因（e-gfp ）在衣藻中的表达研究，构建了一个可用于外
源基因在莱茵衣藻中表达的体系。设计思路清晰，并得到了较好的实验结果。通过本文的研究，掌握了分子生物学的基本实验技术，是一篇具有较高水平的本科毕业论文。（点评教师：胡章立）
引言
莱茵衣藻是单细胞真核绿藻，有两条鞭毛能游动，能进行光合作用。因其具有生长周期短，生长迅速，光合效率高而被称为“光合酵母”，而且它是少数三套基因组都能进行遗传转化的植物。长期以来人们都在探索在衣藻里表达感兴趣的基因，随着基因枪技术的出现，在衣藻叶绿体里表达外源基因的技术已经日趋成熟；但是，外源基因在衣藻核基因组中较难获得稳定有效的表达。许多外源基因导入衣藻基因组后，会出现“基因沉默”问题，或是在基因水平或是在蛋白水平受到阻遏。而对于导入基因不表达现象可能的解释有以下几点：1、甲基化修饰；2、密码子偏爱；3、缺少内含子或其他非编码区；4、采用了异源的启动子和终止子；5、异常基因降解；6、伴随分离；7、外界因素影响等，有鉴于此，所以我们需要构建一个能使外源基因在衣藻中高效稳定表达的载体。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP ）基因是一个新的标记基因，来源于多管
水母属的Aequorea victoria，编码238个氨基酸残基，分子量为2688Da 。经蓝光或紫外激发而发射绿色荧光。其吸收波长为460nm ，发射波长为509nm 。GFP 的生色基团是由位于65－67位的Ser 、Tyr 和Gly 被修饰后共价连接而形成的。而增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp ）是在GFP 的基础上，第64位氨基Phe 被替换成Leu ，第65位氨基Ser 被替换位Thr ，在保留gfp 基因原有特点的基础上，其荧光强度为gfp 的4～35倍，因此，我们选用e-gfp 基因作为报告基因。
与其它常用的报告基因或报告分子相比， GFP具有许多优点：① GFP 的荧光易于检
测。用手提式长波长紫外灯、荧光解剖镜或荧光显微镜都可检测到足量表达的GFP 。②用GFP 可进行活体检测，尤其对透明体可进行反复观测。③GFP 的构象非常稳定，不易发生光漂白（photo bleaching），这有利于荧光激活的细胞筛选。④GFP 是合适的蛋白标签。由于GFP 的分于量小（只有54KD ），可以将GFP 基因和目标基因构建在一起表达融合蛋白。无论GFP 在目标蛋白的N －端，还是C －端，它都不会影响目标蛋白的构象。因此借助荧光显微镜等手段可活体追踪目标蛋白。⑤GFP 在光照下是稳定的，各种光照都不会引起其变性，即使与别得蛋白质融合后，也能利用荧光显微镜很方便地检测到它。
用e-gfp 作为报告基因在原核生物和酵母中进行表达已得到广泛的使用，并取得良好的
效果，但将e-gfp 基因作为报告基因在衣藻中表达还比较鲜见，所以，本实验希望通过将e-gfp 基因整合到衣藻细胞中进行表达，而衣藻细胞经蓝光激发下呈现红色荧光，对e-gfp 基因发射的绿色荧光不产生干扰，从而有利于日后作为检测载体表达效率的报告基因。
1、实验材料和仪器
1.1菌株和质粒
克隆载体p105（含1、5－二磷酸核酮糖羧化酶小亚基编码基因（RBCS2）的启动子和
终止子）、衣藻转化载体p124（带有ble 基因，使宿主细胞具有腐草霉素和Zeocin 抗性）、
大肠杆菌菌株（E.coli ）XL1由本实验室保存；
E-gfp 质粒（携带有e-gfp 基因）由中科院上海生化所惠赠。
1.2衣藻材料
莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii cc-849）由香港城市大学植物分子生物学与环境
生物技术实验室提供，属细胞壁缺陷株。
1.3主要试剂
限制性内切酶、klenow 片断、去磷酸化酶、T4连接酶；质粒提取试剂盒、PCR 片断回
收试剂盒（PCR Fragment Recovery Kit Ver.2.0）、DNA 快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation
Kit ）、DNA 片断纯化试剂盒（DNA Fragment Purification Kit）、RT-PCR 反应试剂盒；DNA
Marker （λDNA/EcoRⅠ＋Hind Ⅲ）、DL 2000、ExTaq Mix（dNTP 、Taq 酶、缓冲液）等均购
自TaKaRa 生物（大连）有限公司）。
PCR 引物由上海生工生物工程公司合成；
DNA 快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation Kit）购自Roche 公司
Trizol 试剂购自Invitrogen 公司；
其他：氯化钙、氨苄青霉素、饱和酚、氯仿、氧化铝等为国产，有关化学试剂，均为
分析纯或分子生物学级（Molecular biology grade）。 1.4主要仪器设备
仪器 型号 制造商
2K15G Refrigerated Centifuge 离 大型离心机
SIGMA aborzentrifuge GmbH 1-13 Laboratory Centrifuge 心 小型离心机
机
电子天平－E 梅特勒－托利多仪器（上海）有
限公司
PowerPac 300 电泳仪 Bio －Rad Laboratories，Inc.
PH 计－S PH计 梅特勒－托利多仪器（上海）有
限公司
高压消毒锅－300V A 新骏实业股份有限公司
光照培养箱 LRH －250－G 型 广东医疗器械厂
WTB Binder Labor－Technik GnbH
KB15 细菌培养箱 WTB Binder Labor－Technik
GnbH
PCR Sprint Thermo Hybaid in UK PCR 扩增仪
PTC-200 Pecfier Thermal Cycler MJ Research
Ultrospec 2000 Pharmacoa Biotech 紫外分光光度计
HITACHI 荧光分光光度计 F －4500FL Spectrophotometer
2、 主要试剂的配制或成分
2.1衣藻培养基：
培养基名称
——
4×Beijerinck salts
――
2×PO4 for HSM ―― ―― ――
冰醋酸 ～1ml ―― ――
浓盐酸 ―― ～1.5ml ――
2.2细菌培养基（LB 培养基）：
药品
细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tyrptone ） 用量 10g
5g 细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract）
去离子水 950ml
在离子水中溶解后，用5mol/LNaOH滴定，至PH=7.0，然后高温高压蒸气灭菌备用。
2.3电泳胶的浓度及其配制：
配制100ml 1％TAE 琼脂糖电泳胶：在100ml TAE缓冲液中，加入1g 琼脂糖，加热至
沸腾，待冷却到40℃左右时加入1ul EB荧光液。
2.4上样缓冲液：0.25％溴酚蓝和40％（w/v）蔗糖水溶液混合成，存于4℃。
3、 实验方法
3.1 SDS碱裂解法制备质粒DNA ：小量制备
（1）挑转化后的单菌落，接种到2ml 含有适当抗生素的丰富培养基（LB ），37℃，200-300rpm
摇床上培养过夜。
（2）取1.5ml 菌液至EP 管(1.5ml离心管），4℃、13000r/min、30sec 离心收集沉淀。
（3）弃上清，尽可能吸干培养液，加入预冷的碱裂解液Ⅰ100ul ，剧烈振荡。
（4）加入200ul 新配制的碱裂解液Ⅱ，颠倒4－5次，以混合内容物，切勿振荡！冰浴10min 。
（5）加入150ul 冰预冷的碱裂解液Ⅲ，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分
散均匀，然后冰浴3－5min 。
（6）4℃、15000r/min、离心5min ，将上清转移到另一离心管中。
（7）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提， 4℃，15000r/min，离心2min ，将
上清转移到另一离心管中。
（8）加入两倍体积无水乙醇沉淀DNA ，－20℃冰箱沉淀1h 以上；
（9）4℃、15000r/min、离心5min 弃上清，用冰预冷的70％乙醇1ml 洗涤DNA 沉淀，弃
上清，倒置于滤纸上，使乙醇完全挥发，直至试管内没有看见的液体存在。
（10）溶于20ul 无菌水或含有去DNA 酶的RNA 酶的TE 溶液。
（11）通过电泳鉴定该质粒是否为目的质粒以及判断质粒的纯度。
3.2限制性内切酶酶切反应 （遵照所购试剂说明书）
(1) 据实验需要取一定量的DNA ，加入适量的限制性内切酶及相应的反应缓冲液、无菌去
离子水，使反应体系中的甘油浓度
(2) 置于适宜反应温度水浴1～3h 。
(3) 取3～5ul 反应液于琼脂糖凝胶电泳检查。
(4) 试验中需要进行双酶切反应，如两个限制性内切酶在同一温度、同一缓冲系统中的活
性均有75％～100％时，可同时进行，反应模式同上。如反应温度或缓冲系统不同时，
则按照先低温后高温、先低盐后高盐的顺序进行，或第一酶酶切后，用酚仿抽提及乙醇
沉淀回收DNA 后再进行第二酶酶切反应。
3.3胶回收
用试剂盒从Agarose 胶中回收DNA ，试剂盒购自TaKaRa ，方法参照PCR Fragment
Recovery Kit Ver.2.0说明书
3.4连接 用快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation Kit）
载体DNA 和插入片断按1：3的摩尔比加入，所加入DNA 的最大量不要超过200ng 。
（1）10ulDNA(载体与插入基因) 溶于1×conc. DNA稀释缓冲液
（2）再加入10ulT4 DNA 连接缓冲液(2×conc.)(vial 1)
（3）充分混匀
（4）Add 1 ul T4 DNA ligase(vial 3)
（5）充分混匀
（6）16℃，过夜
3.5一步法制备感受态细胞并进行转化
（1） 吸取1ml OD600约0.5～0.6的细菌到1.5ml 离心管中，4000r/min离心5分钟，彻底
去除上清。
（2） 加入0.1ml 冰水预冷的SSCS Solution轻轻悬浮菌体，可立即转化或冻存于－70℃待
用。
（3） 加入10ul 用于转化的DNA ，混匀DNA 盒细胞并在冰上放置10分钟。
（4） 在42℃放置90s ，然后再在冰上放置5min 。
（5） 加0.8mlLB 培养基到离心管中，37℃水浴中200r/min振荡培养1h 。
（6） 将细胞涂布于有相应抗性的LB Agar平板上。
对于大量制备，可相应增加SSCS Solution。重悬后的细胞应分装成50～100ul ，然
后储存于－70℃。
3.6 e-gfp基因衣藻表达载体的构建
3.6.1克隆载体p105G 的构建
E-gfp 质粒（携带有e-gfp 基因）由中科院上海生化所惠赠，为了得到实验所需量的质粒，
现将E-gfp 质粒转入到感受态菌株XL1 blue中，挑取单克隆进行摇瓶培养，大量扩增e-gfp
基因，并通过SDS 碱裂解法提取E-gfp 质粒，凝胶电泳检测并定量。
通过NotI 进行酶切E-gfp 质粒后，加Klenow 片断补平，并用酚氯仿抽提， 乙醇沉淀
过夜。离心收集沉淀并用去离子无菌水溶解，再用SmaI 酶切，经电泳分离得到e-gfp 基因
（大约740bp ），并用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收。
用PmacI 酶切p105质粒，经电泳分离得到线状的p105质粒，并用试剂盒从琼脂糖凝
胶中回收质粒。
插入片段（e-gfp 基因）和载体（p105）按3：1的摩尔比连接过夜，然后转化大肠杆
菌E.coli XL1中，通过酶切分析和PCR 筛选出转化子，得到重组质粒p105G 。
3.6.2表达载体p105G124的构建
筛选得到的阳性重组子p105G 经大量扩增培养后，用SDS 碱裂解法提取质粒，并用
EcoRI 酶切p105G ，经电泳分离并回收e-gfp 基因的表达框架（约1.7kb ）。
插入片段（e-gfp 基因的表达框架）和载体（p124）按3：1的摩尔比连接过夜，然后
转化大肠杆菌E.coli XL1中，通过酶切分析和PCR 筛选出转化子，得到重组质粒p105G124。
3.7衣藻的转化
通过“珠磨法”将外源基因转化到衣藻中，即将含有e-gfp 基因的表达载体p105G124
转入到衣藻细胞中，并在含Zeocin 抗性平板（20ug/ml）上进行筛选。
（1）CC-849在连续光照下，在TAP 培养液中培养至对数期，细胞数约为1－2×106 cells/ml。
（2）5000rpm, 室温离心5min ，收集CC-849。
（3）弃上清，用灭过菌的TAP 培养液重悬沉淀，调整细胞浓度至2×108cells/mL
（4）吸取300ul 悬浮液到5ml 的试管里（里面有灭过菌的石英砂）。
（5）目的DNA p105G124用NotI 酶切成线状，取1μg 加入（4）中的试管中，同时建立一
个不加目的DNA 的对照组（CK ）。（注：目的DNA 可以用CsCl 2梯度离心法或试剂盒
提取）。
（6）把 CC-849/石英砂/外源DNA 混合物在振荡器上以最高速度振荡15秒。
（7）把混合物转移到25mL 的带螺旋帽的离心管中，加入10mL 灭菌TAP 培养液，在100rpm
摇床过夜培养（18℃），让细胞恢复。
（8）3000rpm ，室温5min ，收集细胞。
（9）弃上清，用0.5mL TAP缓冲液小心重悬，加入3.5mL0.5％TAP 培养基，混匀后倒在
TAP 平板上（含20μg /ml、Zeocin ）
（10）静置待凝固，倒置平板，放在22℃光照培养箱里培养3 周，待平板上长出绿色的单
克隆。
3.8衣藻DNA 的提取
（1）取20m1处于对数生长后期的衣藻培养液．4℃，5000r ／min ，离心5min ，收集细胞。
（2）弃上清，残留少量液体，用1ml 衣藻培养液重悬，取500ul 到1.5mlEP 管，4℃，5000r
／min ，离心1min 。
（3）弃上清，用350ulNET(0.1mo1/LNaCl，50mmol ／L EDTA，20mmol ／L Tris—HCl ，pH
8.0) 重悬衣藻细胞沉淀，加入50ul ProteinaseK(10mg／ml) 、50ul 20％SDS ，混匀，55
℃水浴2h 。
（4）冰上冷却后，加入200ul 5mol／L KAc，冰上静置30min ，4℃．12000r ／min 离心5min 。
（5）取上清，加入等体积的酚／氯仿／异戊醇(25：24：1) 抽提两次，再用等体积的氯仿抽
提1次。抽提时4℃，13000r ／min ，离心5min 。
（6）取上层水相，加入2倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后置于-70℃放置15min 。
（7）4℃，12000r ／min 离心10min ，弃上清，加入500ul70％乙醇洗涤沉淀，4℃，
13000r ／min ，离心5min 。
（8）干燥后，溶于30u1 TE（含RNase ）缓冲液中。
（9）取2～5ul 电泳分析。
3.9衣藻RNA 的提取
取20ml 对数生长期的转基因衣藻，4℃，5000r/min，5min 收集细胞。提取RNA 方法:
使用购自Invitrogen 公司 TRIzol试剂，按试剂说明书所述方法提取。
3.10 PCR鉴定
根据e-gfp 基因序列，利用计算机辅助系统设计一对PCR 引物，由上海生工合成并聚
丙烯凝胶电泳纯化。
e-gfp 基因引物序列为：PrG1：5’CAAGTTCAGCGTGTCCG3’
PrG2: 5’CCAGCAGGACCATGTGA3’
此引物可从e-gfp 基因中扩增出590bp 片段。
3.10.1重组载体的PCR 鉴定
PCR 反应条件：94℃变性3min ；
94℃，1min ；
54℃，30sec ；
30 Cycles
72℃，30sec ；
72℃延伸10min 。3.10.2转基因衣藻的PCR 鉴定
PCR 反应条件：95℃变性5min ；
95℃，1min ；
55℃，50s ； 30 Cycles
72℃，1min ；
72℃延伸10min 。
3.10.3转基因衣藻的RT －PCR 鉴定
RBCS2启动子是来源于衣藻的光诱导型启动子，在光照条件下培养衣藻就可表达目的
基因。所以光照条件下培养转基因衣藻，提取衣藻总RNA ，使用Oligo dT-Adaptor Primer,
反转录合成的cDNA 链为模板，PrG1、PrG2为引物进行扩增，得到e-gfp 基因的部分片段
（约590bp ）。方法参照RNA PCR Kit（AMV ）Ver.2.1
RT-PCR 条件： 30℃，10min ；
50℃，30sec ；
99℃，5min ； 1 Cycle
5℃， 5min。
PCR 条件：94℃变性5min ；
94℃，2min ；
52℃，1min ；
30 Cycles
72℃，2min ；
72℃延伸3.11转基因衣藻总蛋白的提取及荧光强度测定
3.11.1转基因衣藻总蛋白的提取
分别取40ml 未转基因的对照衣藻和各个转基因衣藻，4℃，5000r/min，离心5min ，
收集细胞。分别置于冰冷的研钵中，再各加4ml 冰冷的CBS 提取液
（1.59gNa 2CO 3,2.93gNaHCO 3，加入蒸馏水溶解至1000ml ）和少许氧化铝，研磨成浆状，
4℃、10000r/min、离心5分钟，取上清3ml 。
3.11.2总蛋白含量的测定
利用紫外分光光度计在280nm 处测定供试溶液中蛋白质的总含量。
3.11.3 GFP绿色荧光强度的测量
利用荧光分光光度计在460nm 激发光下激发，测定各组织蛋白提取液在509nm 处的
发射光强度。测得所得数据后依据下面的公式换算出各种植株每克蛋白中的EGFP 的相对
荧光强度：
相对荧光强度=发射光强度÷(1.5×总蛋白量)
然后再算出各转基因材料中的EGFP 的相对含量值作为衡量该组织中e-gfp 基因表达
水平的相对标准：
相对含量值=供试材料的相对荧光强度值-对照材料的相对荧光强度值
（该方法参照：利用荧光分光光度计定量分析GFP 基因的表达水平 笱吉庆 李敏 张锐
郭三堆 生物技术通报）
4、结果与讨论
4.1e-gfp 基因分离
e-gfp 基因的载体构建，如下图所示：
smaI
实验所需的e-gfp 基因是从E-gfp 质粒（见图1）中酶切得到的，通过用NotI （Klenow
补平）和SmaI 酶切，得到的e-gfp 基因大约是740bp （见图2）。
图1 图2
4.2表达载体p105G 构建与分析
利用限制性内切酶酶切，回收目的片段e-gfp 基因(约740bp) ，并连接到载体p105中，e-gfp 基因插入到p105载体的1，5－二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco ）小亚基编码基因的启动子和终止子之间形成重组质粒p105G （见图3）。由于e-gfp 基因与p105载体是平端与平端的连接，存在正向插入和反向插入问题，所以利用e-gfp 基因23bp 处具有NcoI 位点，p105载体上的终止子（大约231bp ）处具有KpnI 位点，采用NcoI 和KpnI 双酶切p105G ，则正向插入得到的片断是954bp ，反向插入得到的片断是254bp ，通过电泳筛选出正向连接的重组子。
图3
用引物PrG1、PrG2对构建好的载体进行PCR 鉴定，能扩增出e-gfp 基因的部分片段（约590bp ），与e-gfp 的扩增结果一致（见图5）。
4.3转化载体p105G124的构建与分析
利用限制性内切酶酶切，回收e-gfp 基因的表达框架（约1.7kp ），并连接到载体p124中，形成重组质粒p105G124。用EcoRI 可以从p105G124上切下e-gfp 基因的表达框架（约
1.7kp ），与用EcoRI 酶切p105G 的结果一致（见图4）。同样的，用引物PrG1、PrG2对p105G124进行PCR 鉴定，能扩增出e-gfp 基因的部分片段（约590bp ），与e-gfp 的扩增结果一致（见图5）。
图4 图5
衣藻e-gfp 克隆载体（p105G124）结构，如下图所示：
4.4通过“珠磨法”获取转e-gfp 基因衣藻
将构建得到的载体p105G124通过“珠磨法”转入到衣藻cc-849中，光照培养约3 周，经Zeocin 抗性筛选得到约8个单克隆。
为了提高外源基因的转化率，将酶切后的p105G124通过DNA Fragment Purification Kit进行纯化，与未纯化的转化组比较结果如下：
外源基因 转基因藻单克隆数 转化率
纯化的p125G124
未纯化的p105G124 6个 2个 6转化体/ug质粒DNA 2转化体/ug质粒DNA
实验表明，通过用DNA Fragment Purification Kit对外源基因纯化可以提高外源基因在衣藻细胞的转化效率，因为使用试剂盒可以将酶切反应时的酶、DNA 引物、dNTP 等去除，以降低外源物质对转化率的影响。
4.5转基因衣藻的DNA-PCR 分析
提取转e-gfp 基因衣藻DNA （见图6），用引物PrG1、PrG2进行PCR 检测，能扩增出e-gfp 基因的部分片段（约590bp ），与e-gfp 基因的扩增结果一致（见图7），表明e-gfp 基因已经整合到莱茵衣藻核基因组中，其中有三株转基因藻（5，6，7泳道）的扩增效率较差，可能是e-gfp 基因在衣藻基因组中整合的拷贝数比较低。
图6 图7
4.6转基因衣藻的RT-PCR 分析
提取转e-gfp 基因衣藻的总RNA （见图8），对反转录得到的cDAN 链用引物PrG1、PrG2进行扩增，能扩增出e-gfp 基因的部分片段（约590bp ），与e-gfp 的扩增结果一致（见图9），表明整合进衣藻DNA 组的e-gfp 基因在转录水平得到表达，从第一次RT-PCR 的结果可以看出e-gfp 基因在衣藻转录水平的表达效率并不高。由于第一次RT-PCR 结果的浓度很低（见图9中2），所以取2ul RT-PCR结果进行第二次PCR （见图9中3－5）。
图8 图9
4.7转基因衣藻的荧光分析
e-gfp 经蓝光激发而发射绿色荧光，其吸收波长为460nm ，发射波长为509nm ，所以可以通过荧光分光光度计测量其蛋白提取液在460/509时的荧光强度来分析。本实验共测试了7种转基因衣藻和1种野生型莱茵衣藻（cc-849），用CBS 提取这些衣藻的总蛋白，分别用紫外分光光度计和荧光分光光度计测转基因衣藻总蛋白含量值和EGFP 的荧光强度值，共得原始数据16个，按照方法中所述的计算方法算出每个样品的EGFP 含量的相对标准值。结果如下：
cc-849
总蛋白量
(OD280)
发射光强度
（460/509）
相对荧光
强度
相对含量值 0 从统计表可以看出，除7号藻外所得到的转化株的荧光强度都明显高于野生型莱茵衣
藻，其中以1号（16.433）和4号（13.221）最高，7号藻荧光强度接近与野生型衣藻，可能是没有EGFP 表达或表达量极低；相对荧光强度显示了不同转e-gfp 基因藻EGFP 表达的水平，表达高低依次是1>4>3>2>6>5>7。通过该方法可以粗略的观察e-gfp 基因在衣藻中蛋白水平的表达高低。
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2001年第五期
（指导老师 胡章立博士 教授）