国外医学卫生学分册 2008年 第35卷 第6期
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085 军团菌检测方法概述
张丽霞综述 刘 凡(, 摘要: 军团菌是引起军团菌病的病原体。, 已在世界各地引起多起军团菌病暴发流行, 快速、, 这些方法主要包括:。关键词:; +中图分类号: 1 文献标识码: A 文章编号: 100121226(2008) 0620377205
1976年7月在美国费城退伍军人集会时, 参加会议的200多名军人突发原因不明的呼吸道感染, 20多人死亡。1977年McDade 等从4例死亡患者肺组织中分离到一种新的革兰氏阴性杆菌, 从而发现了一个新的细菌家族成员军团菌属(Legionella ) 。此次爆发的呼吸道传染病被命名为军团病(Legionnaires ’disease , LD ) , 又称军团菌病(Legionellosis ) 。
目前已确认军团菌属有50个种, 共70个血清[1]
型, 其中与人类疾病关系最密切的是嗜肺军团菌种(Legionella pneum ophila , Lp ) , 现已发现其有16个
[2]
血清型。嗜肺军团菌血清1型(Lp1) 与人类疾病关系最密切, 其次为血清4型和6型。有研究表明, 社区获得性肺炎中有2%～5%是由军团菌属引起的。在美国有91%的军团菌病是由Lp1引起的。
军团菌广泛存在于天然淡水(如湖泊、河流、小溪等) 和人工水环境(如冷却塔、冷热水管、喷泉等) 中, 其适宜生长温度为34℃～54℃。易感人群可通过吸入带有军团菌的气溶胶而致病。为预防军团菌病的暴发和对军团菌病人进行早期诊断治疗, 发展
收稿日期:2008207210; 修回日期:2008207230
基金项目“:十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAI19B04) 作者简介:张丽霞, 女, 硕士研究生, 研究方向:流行病与卫生统计。审者简介:刘凡, 男, 研究员, 研究方向:环境卫生学。
适宜的军团菌快速检测方法至关重要。本文对军团菌的各种检测方法作一综述。1 细菌培养法
军团菌为革兰氏阴性杆菌, 专性需氧, 胞内寄生菌。军团菌最初是从以军团菌病人肺组织感染的豚鼠中分离出来的。这种方法虽然有较高的可靠性, 但非常昂贵, 而且费时费力, 不久就被平板培养法所取代。目前公认的最适宜培养基是缓冲活性炭酵母
浸出液, 加上铁、L 2半胱氨酸和α2酮戊二酸, 称之为α培养基。培养法可对各种生物样品和环境样BCYE
品进行检测, 包括痰液、支气管肺泡灌洗液、肺组织、血液、粪便和各种环境水样、土壤等。军团菌分离培养法的特异性为100%, 是军团菌检测的“金标准”, 但其敏感性较低, 据相关报道仅为25%～75%
[2,3]
。
据美国病理学家学会的一项调查显示, 美国大约2Π3的临床微生物实验室不能培养出纯化的嗜肺军团菌。而且临床微生物实验室通常不接受含有大量鳞状上皮细胞或少量多核粒性白细胞的痰液样品, 即使这些样品可能含有可培养的军团菌。
由于军团菌体外培养营养要求苛刻, 研究者们一直在努力尝试各种方法来提高军团菌的回收率。这些方法包括改进培养基配方, 尽量满足军团菌的营养要求; 对检测样品进行酸处理或热处理以抑制
・378・
其他杂菌生长。Bartiea 等研究表明对环境水样进
[5]
行热处理可提高军团菌检出率。胡朝晖等研究表
α培养基中添加合适的抗生素可有效抑明, 在BCYE
制环境水样中的杂菌, 提高嗜肺军团菌的分离率。细菌培养法虽然存在许多缺点, 如:(1) 培养结果受实验室技术影响较大; (2) 操作繁琐, 费时较长, 约7～10天; (3) 培养基不易制作, 技术要求高, 价格昂贵。但其也具有一些不可替代的优点, 如:(1) 对免疫抑制病人无法进行抗体检测时, 可用培养法进行检测; (2) 对于由非嗜肺军团菌血清1型引起的军团菌肺炎还需采用培养法进行确诊。2 血清抗体检测
[4]
国外医学卫生学分册 2008年 第35卷 第6期力低下造成的。(2) 有研究报道33%的病人在发病
[11]
2年后仍可检出军团菌抗体。所以测定单份血清中抗体滴度常难以断定是现症还是既往感染。(3) 目前临床上主要检测IgG 抗体, 由于血清抗体升高缓慢, 需在病程4～6周才能达到诊断所需标准(双份血清效价4倍增长, 单份血清效价>1∶128) , 仅少数患者第1周即有抗体的明显升高, 故血清学诊断缺乏早期诊断意义。
少, 目前, 331 尿抗原的检测
军团菌感染1异性IgM 抗体。种, (IFA ) 、微量凝集试验(MAT ) 和酶联免疫吸附试验(E LIS A ) 等。
IFA 是最早用于嗜肺军团菌抗体检测的血清学
最早在1979年就有人用E LIS A 法, 从经血清检
[11,12]
测确诊的军团菌病人尿中检测到相应抗原。之后各种检测病人尿中军团菌抗原的方法相继出现, 这些方法包括放射免疫检测法(RI A ) 、酶免疫检测法(EI A ) 、免疫层析检测法(ICT ) 等。上述这些检测方法所用的捕获抗体绝大多数为Lp1, 故只能用于
[13]
感染Lp1的病人尿抗原检测。K ohler 等对Lp1感染患者尿中可溶性抗原排出的开始时间和持续时间进行了监测, 结果显示, 在发病后尿抗原检出率1～3天为88%,4～7天为80%,8～14天为89%,14天
方法, 这种方法是1977年由美国C DC 建立的, 用于对在美国费城退伍军人集会时暴发的肺炎病人血清进行检测。用于IFA 检测的抗原最初是在卵黄囊中培养的活抗原, 后来发展到用乙醚灭活的生长在Mueller 2Hinton 培养基上的抗原, 再到经加热灭活或
[6]
福尔马林灭活的生长在各种培养基上的抗原。MAT 是1978年建立的,1982年又建立了快速微量凝集试验(RMAT ) 方法, 并在欧洲得到广泛应用。Harris on 等对IFA 和RMAT 两种方法进行了比较,
[7]
后为100%, 持续最长的尿抗原排出时间>300天。
[14]
K ohler 等在另一项研究中, 收集了23名病人在抗生素治疗前后的多份尿样, 以测定尿抗原的持续排出时间。结果显示, 一些病人在治疗后4天内就无法检测到抗原, 但有一名病人接受治疗300天后仍可从其尿中检出抗原。多项研究表明, 尿抗原检测的特异性>99%, 根据病人所感染的嗜肺军团菌血清型不同、所检测的尿样是否浓缩、病人的症状轻重不同, 其敏感性也不同。尿样经浓缩后敏感性可达。
目前许多公司生产嗜肺军团菌尿抗原检测试剂盒, 主要有Binax NOW ICT 、Binax EI A 、Bartels EI A 、Biotest EI A 等。为评价上述几种试剂盒的检测敏感性和特异性, 已有许多研究者做了大量的研究工作, 8014%
[15]
两种方法的敏感性均为80%, 特异性为97%～99%, 而RMAT 在进行大量样品检测时和反应时间上具有一定的优势。现在越来越多的实验室更愿意采用E LIS A 法进行嗜肺军团菌血清抗体检测,E LIS A 法的结果判定更加客观、精确, 适合发展成为自动检
[8,9]
测法。
由于血清特异性抗体的测定方法容易掌握, 检测结果可靠, 目前仍是国内外临床诊断军团菌病的常用方法。但其也存在许多缺点:(1) 即使在已经培养法确诊的病人中也有20%～30%的病人其抗体滴度不呈4倍或以上增高, 有些病人在发病2个
[10]
月后也不出现抗体滴度升高。上述情况可能是由于早期抗生素治疗、使用免疫抑制剂或患者免疫
研究结果显示上述各检测试剂盒的敏感性为
5914%～9711%, 特异性100%。各试剂盒对Lp1的检测敏感性均高于其他血清型。不同的研究表明, 检测敏感性差异可能是由以下原因造成的:(1) 患
国外医学卫生学分册 2008年 第35卷 第6期者感染血清型不同; (2) 感染严重程度不同; (3) 尿标本本采集时间不同; (4) 是否已经抗生素治疗; (5) 尿液是否经浓缩或冷冻等。
4 核酸检测411 核酸探针技术
・379・
尿抗原检测具有很多优点:(1) 在军团菌病患者发病后1～3天即可从其尿中检测出嗜肺军团菌
抗原, 为早期诊断治疗提供依据; (2) 简便、快速、敏感, 不需要贵重仪器设备, 对操作人员的技术要求不高。(3) 尿标本容易获得, 对病人没有创伤。但尿抗原检测也存在一些缺点:如(1) 只适用于检测Lp1, 对其他血清型的检测敏感性很低; (2) 检测试剂盒价格昂贵, 在实际应用的推广遇到一定困难。312 水中军团菌抗原的检测
应用核酸探针技术检测病原微生物核酸是临床
诊断学的重大发展, 其原理是用带有酶、化学荧光物、放射性核素或生物素标记的已知序列特定DNA 片段(称为探针) , 在一定条件下, 按碱基互补原则, 探针与待测标本中的核酸杂交, 通过对杂交信号的检测, 从而鉴定标本中有无相应的病原微生物基因及其分子大小。1986, I 标记的cDNA 探针, rRNA , [20]
, 等用该探针, 在剔除经重复培养阴性或无法进行培养的标本后, 其敏感性为76%, 特异性为100%。在一项前
[21]
瞻性研究中,D oebbeling 等报道, 与培养法相比, 核酸探针检测的敏感性为63%, 而特异性只有95%, 假阳性率为415%。在将阳性阈值从≥4提高到≥7后, 特异性提高到99%, 而敏感性降低到
[22]
50%。Laussucq 等对一个医院的23名经核酸探针检测阳性的病人进行了病例2对照研究和问卷调查, 其中13名病人没有发热和肺炎症状。在这项调查后不久, 该核酸探针就从市场上消失了。412 核酸扩增技术
核酸扩增技术(或称聚合酶链反应技术, PCR )
]
T , , 在试管中直接接种Lp1菌种, 其最低检测限为1000cfu Πml , 无法检测Lp2214型的军团菌。Helbig 等
[17]
用相同的方法对Biotest EI A
4
军团菌抗原检测试剂盒进行了评价, 对于Lp1不同的种其测得的最低检测限分别为3×10cfu Πml 和6×10cfu Πml 。Blanco 等
5
[18]
对Bartels E LIS A 试剂盒
进行了评价, 该试剂盒最低可检出780cfu Πml 直接接种于试管中的Lp1, 并可检出Lp2214型的军团菌。
虽然军团菌抗原检测试剂盒的检测敏感性偏低, 但其快速、操作简便的优势使其在对军团菌污染严重的水样或对大量的水样进行检测时具有一定的应用价值。
313 直接免疫荧光染色测定
是体外酶促合成DNA 片段的方法, 其原理类似于
DNA 的体内半保留复制。主要由高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复的热循环构成, 经过25～40个循环后, 靶序列可以扩增成1×10～1×10, 能最大限度地满足操作DNA 的要求。PCR 理
8
6
直接免疫荧光染色(DFA ) 检测法就是以荧光素作为标记物, 与已知的抗体结合, 但不影响其免疫学特性, 然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂, 用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下, 可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。对经直接荧光抗体染色的肺组织标本和呼吸道分泌物标本进行显微镜检查是最早检测嗜肺军团菌的方法。用DFA 法对经培养法证实的军团菌病人的呼吸道分泌物进行检测, 其阳性率为25%～70%, 检测特异性>9919%。单克隆抗体的荧光试
论上可检测已知的引起人类致病的所有军团菌种。目前用于检测军团菌DNA 的引物主要有:(1) 针对军团菌属特异性的基因引物5S rRNA 和16S rRNA ; (2) 嗜肺军团菌种特异性引物mip 基因。41211 常规PCR
应用PCR 技术可对水样及各种临床标本(包括血液、尿液、痰液、胸水、肺泡灌洗液、肺组织等) 进
[23]
行军团菌DNA 检测。Maiwald 等通过特异性引物扩增军团菌5S rRNA 基因一段长约108bp 的属特异性DNA 片段, 对临床患者及感染豚鼠的尿液进行军团菌检测, 结果表明其敏感性高于EI A 法检测尿抗
[24]
原, 且具有较好的特异性。倪佳琳等采用军团菌
剂比多价的试剂DFA 检测敏感性高
[19]
。
DFA 检测法直接快速, 但其检测敏感性低, 技术
要求高, 需有经验的实验技术人员在实验室内完成。
・380・
5S rRNA 的rDNA 序列片段特异性地扩增全军团菌
国外医学卫生学分册 2008年 第35卷 第6期致水样中存在大量活的但无法培养的军团菌。41215 PCR 2探针法和PCR 2E LISA 法
PCR 2探针法是用PCR 扩增军团菌的特异靶序
属, 对上海市372份环境水样进行了检测, 同时用BCYE 平板培养法进行平行试验。结果平板培养法
检测出阳性标本157件, 阳性率4214%, 而PCR 法
检测出阳性标本266件, 阳性率7115%。除常规PCR 外, 在此基础上还发展了巢式PCR 、多重PCR 、定量PCR 等。41212 巢式PCR
巢式PCR (nested PCR ) 选用两对引物先后进行两次扩增, 后一次PCR 扩增引物互补于前一次PCR 扩增序列的内侧, 可提高检测的敏感性。Catalan [25]
等采用巢式PCR 选用mip 基因中两对引物进行两次扩增, 对34, 与培养法相比巢式PCR ]
性。Dev os 等2858和J FP 2JRP , 对46PCR 检测, 结果军团菌检出阳性率分别为56%和98%, 而培养法的阳性率仅为41%。41213 多重PCR
列, 然后结合基因探针杂交检测扩增产物。二者联合使用敏感性比单用探针法高100～10000倍。PCR 2E LIS A 法是用PCR 扩增军团菌的特异靶序列
后, 通过和标记生物素的探针杂交, 再经底物酶培养后, 样品的结果可通过酶标仪来读取。具备操作简便、结果判断客观、灵敏、特异、。刘广华等
[30]
, 含量为190fg 的军, 微孔板液相杂交法最低限度可测DNA 含量为19fg 的军团菌基因组DNA 。
基于PCR 技术发展起来的各种检测方法具有较高的敏感性和特异性, 可检测所有种群的军团菌。但其也存在一定的假阴性和假阳性, 并易受检测样品中PCR 抑制剂的影响。不同的样品前处理、核酸扩增过程、引物和探针的选择对检测结果具有很大的影响。5 结语
多重PCR 是指在同一反应体系中加入两对或多对特异性引物, 可同时扩增目的基因中的几个片段, 未扩增出的片段与扩增出的片段互为参照, 进一
[27]
步排除假阳性和假阴性。Wils on 等通过对军团菌16S rRNA 基因的多个片段进行扩增, 对49种军团菌(26种Lp ,23种非Lp ) 进行分型鉴定, 结果正确鉴定
从军团菌被发现到20世纪90年代, 培养法和血清学检测法是大多数微生物实验室选用的方法。培养法较低的敏感性以及需要较长的培养时间和血清学检测的滞后性导致军团菌病较低的诊断率和较高的死亡率。此后, 军团菌尿抗原检测试剂盒的商业化大大提高了军团菌病的检出率和治愈率。然而, 军团菌尿抗原检测由Lp1感染引起的军团菌病总的敏感性只有70%, 对由非Lp1引起的军团菌病检测的敏感性更低。今后的研究重点应在提高尿抗原检测的敏感性和对其它血清型的检测能力上。对PCR 检测程序进行标准化, 提高检测的敏感性和特
出26种Lp 和23种非Lp , 并鉴定出大多数(20Π23; 87%) 非Lp 所属种群。41214 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR (real 2time PCR ) 是指在PCR 反应体系中加入荧光基团, 通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性分析的方法。有研究者报道, 应用实时荧光定量PCR 从临床标本中检测军团菌, 该法减少了交叉污染, 缩短了样品的前处理时间, 省去了对PCR 终产物的分析, 而且具有较高的敏感性和
[28]
特异性。Fiume 等用实时荧光定量PCR 与巢式PCR 对124份自来水样进行检测, 结果显示这两种方法的敏感性比培养法分别高5%和14%。Joly [29]
等用实时荧光定量PCR 法对环境水样(包括热水样品和冷却塔水样) 进行军团菌检测, 并与培养法进行了比较, 结果显示实时荧光定量PCR 的阳性率远高于培养法, 作者解释这可能是由于使用消毒剂导
异性, 生产操作简便的PCR 试剂盒也是今后发展的方向。
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・382・国外医学卫生学分册 2008年 第35卷 第6期
简讯
对肉类与癌症之间关系的质疑
近期, 一个由政府部门、大学及企业等领域专家组成的专门小组对目前广泛传播的肉类消费与癌症有关的说法提出质疑。
美国肉类研究所基金会主席Huffman 博士称:“实就是如此, 所(AICR ) 年世界癌症研究报告”进行了广泛详尽的评论。尽管AICR 声称发现了消费红肉及加工肉制品与结肠直肠癌之间存在着肯定的联系, 但通过对其500页报告及随后2334页系统的文献综述的仔细阅读,K lurfeld 博士注意到该报告并不支持其宣称的这一“可怕”的警告。
在一次有关亚硝酸钠安全性及其有益作用的会议上, 美国德克萨斯大学休斯顿分子医学研究所的Bryan 博士称, 目前媒体、公众以及科学团体对亚硝
管有益的作用。据Bryan 博士所说, 亚硝酸盐能够预防心脏的损伤, 可作为体内的活性来源。此外, 100倍。提高亚, 他还指出, 他们初步研究发现, 当将亚硝酸盐直接给予肿瘤细胞时不会促进其生
长, 但当同时给予抗坏血酸(Vc ) 时, 肿瘤细胞生长被抑制。国家卫生研究所的Cladwin 博士也发现了亚硝酸盐在医疗方面的价值。
Huffman 博士强调, 新鲜的及加工的肉制品含有
许多重要的营养物质, 如蛋白质、必需维生素和矿物质、氨基酸, 食用肉类还能够带来满足感。新的研究发现, 利用低碳水化合物、高蛋白质膳食来控制体重比单纯减少热量摄入更有效。
C oughlin 博士30年来一直从事亚硝酸盐的研
究, 他指出, 评价有关肉类与亚硝酸盐关系的流行病学和毒理学研究结果时, 应仔细考虑现有的科学证据。
(http :ΠΠw w w. meatami. com , 崔彦红)
酸钠安全性的认识已经过时了。他解释说, 每日人们通过水果和蔬菜摄入的亚硝酸盐和硝酸盐要远远多于从腌肉中摄入的。例如, 一个人从石榴汁饮料中摄入的亚硝酸盐是其从一个热狗中摄入的100倍。他还指出, 目前发现亚硝酸盐具有某些对心血
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085 军团菌检测方法概述
张丽霞综述 刘 凡(, 摘要: 军团菌是引起军团菌病的病原体。, 已在世界各地引起多起军团菌病暴发流行, 快速、, 这些方法主要包括:。关键词:; +中图分类号: 1 文献标识码: A 文章编号: 100121226(2008) 0620377205
1976年7月在美国费城退伍军人集会时, 参加会议的200多名军人突发原因不明的呼吸道感染, 20多人死亡。1977年McDade 等从4例死亡患者肺组织中分离到一种新的革兰氏阴性杆菌, 从而发现了一个新的细菌家族成员军团菌属(Legionella ) 。此次爆发的呼吸道传染病被命名为军团病(Legionnaires ’disease , LD ) , 又称军团菌病(Legionellosis ) 。
目前已确认军团菌属有50个种, 共70个血清[1]
型, 其中与人类疾病关系最密切的是嗜肺军团菌种(Legionella pneum ophila , Lp ) , 现已发现其有16个
[2]
血清型。嗜肺军团菌血清1型(Lp1) 与人类疾病关系最密切, 其次为血清4型和6型。有研究表明, 社区获得性肺炎中有2%～5%是由军团菌属引起的。在美国有91%的军团菌病是由Lp1引起的。
军团菌广泛存在于天然淡水(如湖泊、河流、小溪等) 和人工水环境(如冷却塔、冷热水管、喷泉等) 中, 其适宜生长温度为34℃～54℃。易感人群可通过吸入带有军团菌的气溶胶而致病。为预防军团菌病的暴发和对军团菌病人进行早期诊断治疗, 发展
收稿日期:2008207210; 修回日期:2008207230
基金项目“:十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAI19B04) 作者简介:张丽霞, 女, 硕士研究生, 研究方向:流行病与卫生统计。审者简介:刘凡, 男, 研究员, 研究方向:环境卫生学。
适宜的军团菌快速检测方法至关重要。本文对军团菌的各种检测方法作一综述。1 细菌培养法
军团菌为革兰氏阴性杆菌, 专性需氧, 胞内寄生菌。军团菌最初是从以军团菌病人肺组织感染的豚鼠中分离出来的。这种方法虽然有较高的可靠性, 但非常昂贵, 而且费时费力, 不久就被平板培养法所取代。目前公认的最适宜培养基是缓冲活性炭酵母
浸出液, 加上铁、L 2半胱氨酸和α2酮戊二酸, 称之为α培养基。培养法可对各种生物样品和环境样BCYE
品进行检测, 包括痰液、支气管肺泡灌洗液、肺组织、血液、粪便和各种环境水样、土壤等。军团菌分离培养法的特异性为100%, 是军团菌检测的“金标准”, 但其敏感性较低, 据相关报道仅为25%～75%
[2,3]
。
据美国病理学家学会的一项调查显示, 美国大约2Π3的临床微生物实验室不能培养出纯化的嗜肺军团菌。而且临床微生物实验室通常不接受含有大量鳞状上皮细胞或少量多核粒性白细胞的痰液样品, 即使这些样品可能含有可培养的军团菌。
由于军团菌体外培养营养要求苛刻, 研究者们一直在努力尝试各种方法来提高军团菌的回收率。这些方法包括改进培养基配方, 尽量满足军团菌的营养要求; 对检测样品进行酸处理或热处理以抑制
・378・
其他杂菌生长。Bartiea 等研究表明对环境水样进
[5]
行热处理可提高军团菌检出率。胡朝晖等研究表
α培养基中添加合适的抗生素可有效抑明, 在BCYE
制环境水样中的杂菌, 提高嗜肺军团菌的分离率。细菌培养法虽然存在许多缺点, 如:(1) 培养结果受实验室技术影响较大; (2) 操作繁琐, 费时较长, 约7～10天; (3) 培养基不易制作, 技术要求高, 价格昂贵。但其也具有一些不可替代的优点, 如:(1) 对免疫抑制病人无法进行抗体检测时, 可用培养法进行检测; (2) 对于由非嗜肺军团菌血清1型引起的军团菌肺炎还需采用培养法进行确诊。2 血清抗体检测
[4]
国外医学卫生学分册 2008年 第35卷 第6期力低下造成的。(2) 有研究报道33%的病人在发病
[11]
2年后仍可检出军团菌抗体。所以测定单份血清中抗体滴度常难以断定是现症还是既往感染。(3) 目前临床上主要检测IgG 抗体, 由于血清抗体升高缓慢, 需在病程4～6周才能达到诊断所需标准(双份血清效价4倍增长, 单份血清效价>1∶128) , 仅少数患者第1周即有抗体的明显升高, 故血清学诊断缺乏早期诊断意义。
少, 目前, 331 尿抗原的检测
军团菌感染1异性IgM 抗体。种, (IFA ) 、微量凝集试验(MAT ) 和酶联免疫吸附试验(E LIS A ) 等。
IFA 是最早用于嗜肺军团菌抗体检测的血清学
最早在1979年就有人用E LIS A 法, 从经血清检
[11,12]
测确诊的军团菌病人尿中检测到相应抗原。之后各种检测病人尿中军团菌抗原的方法相继出现, 这些方法包括放射免疫检测法(RI A ) 、酶免疫检测法(EI A ) 、免疫层析检测法(ICT ) 等。上述这些检测方法所用的捕获抗体绝大多数为Lp1, 故只能用于
[13]
感染Lp1的病人尿抗原检测。K ohler 等对Lp1感染患者尿中可溶性抗原排出的开始时间和持续时间进行了监测, 结果显示, 在发病后尿抗原检出率1～3天为88%,4～7天为80%,8～14天为89%,14天
方法, 这种方法是1977年由美国C DC 建立的, 用于对在美国费城退伍军人集会时暴发的肺炎病人血清进行检测。用于IFA 检测的抗原最初是在卵黄囊中培养的活抗原, 后来发展到用乙醚灭活的生长在Mueller 2Hinton 培养基上的抗原, 再到经加热灭活或
[6]
福尔马林灭活的生长在各种培养基上的抗原。MAT 是1978年建立的,1982年又建立了快速微量凝集试验(RMAT ) 方法, 并在欧洲得到广泛应用。Harris on 等对IFA 和RMAT 两种方法进行了比较,
[7]
后为100%, 持续最长的尿抗原排出时间>300天。
[14]
K ohler 等在另一项研究中, 收集了23名病人在抗生素治疗前后的多份尿样, 以测定尿抗原的持续排出时间。结果显示, 一些病人在治疗后4天内就无法检测到抗原, 但有一名病人接受治疗300天后仍可从其尿中检出抗原。多项研究表明, 尿抗原检测的特异性>99%, 根据病人所感染的嗜肺军团菌血清型不同、所检测的尿样是否浓缩、病人的症状轻重不同, 其敏感性也不同。尿样经浓缩后敏感性可达。
目前许多公司生产嗜肺军团菌尿抗原检测试剂盒, 主要有Binax NOW ICT 、Binax EI A 、Bartels EI A 、Biotest EI A 等。为评价上述几种试剂盒的检测敏感性和特异性, 已有许多研究者做了大量的研究工作, 8014%
[15]
两种方法的敏感性均为80%, 特异性为97%～99%, 而RMAT 在进行大量样品检测时和反应时间上具有一定的优势。现在越来越多的实验室更愿意采用E LIS A 法进行嗜肺军团菌血清抗体检测,E LIS A 法的结果判定更加客观、精确, 适合发展成为自动检
[8,9]
测法。
由于血清特异性抗体的测定方法容易掌握, 检测结果可靠, 目前仍是国内外临床诊断军团菌病的常用方法。但其也存在许多缺点:(1) 即使在已经培养法确诊的病人中也有20%～30%的病人其抗体滴度不呈4倍或以上增高, 有些病人在发病2个
[10]
月后也不出现抗体滴度升高。上述情况可能是由于早期抗生素治疗、使用免疫抑制剂或患者免疫
研究结果显示上述各检测试剂盒的敏感性为
5914%～9711%, 特异性100%。各试剂盒对Lp1的检测敏感性均高于其他血清型。不同的研究表明, 检测敏感性差异可能是由以下原因造成的:(1) 患
国外医学卫生学分册 2008年 第35卷 第6期者感染血清型不同; (2) 感染严重程度不同; (3) 尿标本本采集时间不同; (4) 是否已经抗生素治疗; (5) 尿液是否经浓缩或冷冻等。
4 核酸检测411 核酸探针技术
・379・
尿抗原检测具有很多优点:(1) 在军团菌病患者发病后1～3天即可从其尿中检测出嗜肺军团菌
抗原, 为早期诊断治疗提供依据; (2) 简便、快速、敏感, 不需要贵重仪器设备, 对操作人员的技术要求不高。(3) 尿标本容易获得, 对病人没有创伤。但尿抗原检测也存在一些缺点:如(1) 只适用于检测Lp1, 对其他血清型的检测敏感性很低; (2) 检测试剂盒价格昂贵, 在实际应用的推广遇到一定困难。312 水中军团菌抗原的检测
应用核酸探针技术检测病原微生物核酸是临床
诊断学的重大发展, 其原理是用带有酶、化学荧光物、放射性核素或生物素标记的已知序列特定DNA 片段(称为探针) , 在一定条件下, 按碱基互补原则, 探针与待测标本中的核酸杂交, 通过对杂交信号的检测, 从而鉴定标本中有无相应的病原微生物基因及其分子大小。1986, I 标记的cDNA 探针, rRNA , [20]
, 等用该探针, 在剔除经重复培养阴性或无法进行培养的标本后, 其敏感性为76%, 特异性为100%。在一项前
[21]
瞻性研究中,D oebbeling 等报道, 与培养法相比, 核酸探针检测的敏感性为63%, 而特异性只有95%, 假阳性率为415%。在将阳性阈值从≥4提高到≥7后, 特异性提高到99%, 而敏感性降低到
[22]
50%。Laussucq 等对一个医院的23名经核酸探针检测阳性的病人进行了病例2对照研究和问卷调查, 其中13名病人没有发热和肺炎症状。在这项调查后不久, 该核酸探针就从市场上消失了。412 核酸扩增技术
核酸扩增技术(或称聚合酶链反应技术, PCR )
]
T , , 在试管中直接接种Lp1菌种, 其最低检测限为1000cfu Πml , 无法检测Lp2214型的军团菌。Helbig 等
[17]
用相同的方法对Biotest EI A
4
军团菌抗原检测试剂盒进行了评价, 对于Lp1不同的种其测得的最低检测限分别为3×10cfu Πml 和6×10cfu Πml 。Blanco 等
5
[18]
对Bartels E LIS A 试剂盒
进行了评价, 该试剂盒最低可检出780cfu Πml 直接接种于试管中的Lp1, 并可检出Lp2214型的军团菌。
虽然军团菌抗原检测试剂盒的检测敏感性偏低, 但其快速、操作简便的优势使其在对军团菌污染严重的水样或对大量的水样进行检测时具有一定的应用价值。
313 直接免疫荧光染色测定
是体外酶促合成DNA 片段的方法, 其原理类似于
DNA 的体内半保留复制。主要由高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复的热循环构成, 经过25～40个循环后, 靶序列可以扩增成1×10～1×10, 能最大限度地满足操作DNA 的要求。PCR 理
8
6
直接免疫荧光染色(DFA ) 检测法就是以荧光素作为标记物, 与已知的抗体结合, 但不影响其免疫学特性, 然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂, 用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下, 可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。对经直接荧光抗体染色的肺组织标本和呼吸道分泌物标本进行显微镜检查是最早检测嗜肺军团菌的方法。用DFA 法对经培养法证实的军团菌病人的呼吸道分泌物进行检测, 其阳性率为25%～70%, 检测特异性>9919%。单克隆抗体的荧光试
论上可检测已知的引起人类致病的所有军团菌种。目前用于检测军团菌DNA 的引物主要有:(1) 针对军团菌属特异性的基因引物5S rRNA 和16S rRNA ; (2) 嗜肺军团菌种特异性引物mip 基因。41211 常规PCR
应用PCR 技术可对水样及各种临床标本(包括血液、尿液、痰液、胸水、肺泡灌洗液、肺组织等) 进
[23]
行军团菌DNA 检测。Maiwald 等通过特异性引物扩增军团菌5S rRNA 基因一段长约108bp 的属特异性DNA 片段, 对临床患者及感染豚鼠的尿液进行军团菌检测, 结果表明其敏感性高于EI A 法检测尿抗
[24]
原, 且具有较好的特异性。倪佳琳等采用军团菌
剂比多价的试剂DFA 检测敏感性高
[19]
。
DFA 检测法直接快速, 但其检测敏感性低, 技术
要求高, 需有经验的实验技术人员在实验室内完成。
・380・
5S rRNA 的rDNA 序列片段特异性地扩增全军团菌
国外医学卫生学分册 2008年 第35卷 第6期致水样中存在大量活的但无法培养的军团菌。41215 PCR 2探针法和PCR 2E LISA 法
PCR 2探针法是用PCR 扩增军团菌的特异靶序
属, 对上海市372份环境水样进行了检测, 同时用BCYE 平板培养法进行平行试验。结果平板培养法
检测出阳性标本157件, 阳性率4214%, 而PCR 法
检测出阳性标本266件, 阳性率7115%。除常规PCR 外, 在此基础上还发展了巢式PCR 、多重PCR 、定量PCR 等。41212 巢式PCR
巢式PCR (nested PCR ) 选用两对引物先后进行两次扩增, 后一次PCR 扩增引物互补于前一次PCR 扩增序列的内侧, 可提高检测的敏感性。Catalan [25]
等采用巢式PCR 选用mip 基因中两对引物进行两次扩增, 对34, 与培养法相比巢式PCR ]
性。Dev os 等2858和J FP 2JRP , 对46PCR 检测, 结果军团菌检出阳性率分别为56%和98%, 而培养法的阳性率仅为41%。41213 多重PCR
列, 然后结合基因探针杂交检测扩增产物。二者联合使用敏感性比单用探针法高100～10000倍。PCR 2E LIS A 法是用PCR 扩增军团菌的特异靶序列
后, 通过和标记生物素的探针杂交, 再经底物酶培养后, 样品的结果可通过酶标仪来读取。具备操作简便、结果判断客观、灵敏、特异、。刘广华等
[30]
, 含量为190fg 的军, 微孔板液相杂交法最低限度可测DNA 含量为19fg 的军团菌基因组DNA 。
基于PCR 技术发展起来的各种检测方法具有较高的敏感性和特异性, 可检测所有种群的军团菌。但其也存在一定的假阴性和假阳性, 并易受检测样品中PCR 抑制剂的影响。不同的样品前处理、核酸扩增过程、引物和探针的选择对检测结果具有很大的影响。5 结语
多重PCR 是指在同一反应体系中加入两对或多对特异性引物, 可同时扩增目的基因中的几个片段, 未扩增出的片段与扩增出的片段互为参照, 进一
[27]
步排除假阳性和假阴性。Wils on 等通过对军团菌16S rRNA 基因的多个片段进行扩增, 对49种军团菌(26种Lp ,23种非Lp ) 进行分型鉴定, 结果正确鉴定
从军团菌被发现到20世纪90年代, 培养法和血清学检测法是大多数微生物实验室选用的方法。培养法较低的敏感性以及需要较长的培养时间和血清学检测的滞后性导致军团菌病较低的诊断率和较高的死亡率。此后, 军团菌尿抗原检测试剂盒的商业化大大提高了军团菌病的检出率和治愈率。然而, 军团菌尿抗原检测由Lp1感染引起的军团菌病总的敏感性只有70%, 对由非Lp1引起的军团菌病检测的敏感性更低。今后的研究重点应在提高尿抗原检测的敏感性和对其它血清型的检测能力上。对PCR 检测程序进行标准化, 提高检测的敏感性和特
出26种Lp 和23种非Lp , 并鉴定出大多数(20Π23; 87%) 非Lp 所属种群。41214 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR (real 2time PCR ) 是指在PCR 反应体系中加入荧光基团, 通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性分析的方法。有研究者报道, 应用实时荧光定量PCR 从临床标本中检测军团菌, 该法减少了交叉污染, 缩短了样品的前处理时间, 省去了对PCR 终产物的分析, 而且具有较高的敏感性和
[28]
特异性。Fiume 等用实时荧光定量PCR 与巢式PCR 对124份自来水样进行检测, 结果显示这两种方法的敏感性比培养法分别高5%和14%。Joly [29]
等用实时荧光定量PCR 法对环境水样(包括热水样品和冷却塔水样) 进行军团菌检测, 并与培养法进行了比较, 结果显示实时荧光定量PCR 的阳性率远高于培养法, 作者解释这可能是由于使用消毒剂导
异性, 生产操作简便的PCR 试剂盒也是今后发展的方向。
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・382・国外医学卫生学分册 2008年 第35卷 第6期
简讯
对肉类与癌症之间关系的质疑
近期, 一个由政府部门、大学及企业等领域专家组成的专门小组对目前广泛传播的肉类消费与癌症有关的说法提出质疑。
美国肉类研究所基金会主席Huffman 博士称:“实就是如此, 所(AICR ) 年世界癌症研究报告”进行了广泛详尽的评论。尽管AICR 声称发现了消费红肉及加工肉制品与结肠直肠癌之间存在着肯定的联系, 但通过对其500页报告及随后2334页系统的文献综述的仔细阅读,K lurfeld 博士注意到该报告并不支持其宣称的这一“可怕”的警告。
在一次有关亚硝酸钠安全性及其有益作用的会议上, 美国德克萨斯大学休斯顿分子医学研究所的Bryan 博士称, 目前媒体、公众以及科学团体对亚硝
管有益的作用。据Bryan 博士所说, 亚硝酸盐能够预防心脏的损伤, 可作为体内的活性来源。此外, 100倍。提高亚, 他还指出, 他们初步研究发现, 当将亚硝酸盐直接给予肿瘤细胞时不会促进其生
长, 但当同时给予抗坏血酸(Vc ) 时, 肿瘤细胞生长被抑制。国家卫生研究所的Cladwin 博士也发现了亚硝酸盐在医疗方面的价值。
Huffman 博士强调, 新鲜的及加工的肉制品含有
许多重要的营养物质, 如蛋白质、必需维生素和矿物质、氨基酸, 食用肉类还能够带来满足感。新的研究发现, 利用低碳水化合物、高蛋白质膳食来控制体重比单纯减少热量摄入更有效。
C oughlin 博士30年来一直从事亚硝酸盐的研
究, 他指出, 评价有关肉类与亚硝酸盐关系的流行病学和毒理学研究结果时, 应仔细考虑现有的科学证据。
(http :ΠΠw w w. meatami. com , 崔彦红)
酸钠安全性的认识已经过时了。他解释说, 每日人们通过水果和蔬菜摄入的亚硝酸盐和硝酸盐要远远多于从腌肉中摄入的。例如, 一个人从石榴汁饮料中摄入的亚硝酸盐是其从一个热狗中摄入的100倍。他还指出, 目前发现亚硝酸盐具有某些对心血
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