医学细胞生物学设计型实验设计报告
姓名： 李 飘 班级：K —10班 学号：1020151004 评分
【实验项目】： 动物细胞细胞核的分离与鉴定
【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的
细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此, 我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。
细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA ，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理, 抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。
【实验步骤】：
1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。
2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。
3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml 预热至37 ℃的细胞松弛素B 溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB 溶液。
4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。
5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min ，室温晾干。
7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min ，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。
8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min ，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。
【注意事项】：
1．在离心管内加入的5ml 细胞核松弛素B 溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。
2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。
3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。
4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。
【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性
蛋白，即细胞核。
医学细胞生物学设计型实验设计报告
姓名： 李 飘 班级：K —10班 学号：1020151004 评分
【实验项目】： 动物细胞细胞核的分离与鉴定
【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的
细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此, 我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。
细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA ，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理, 抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。
【实验步骤】：
1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。
2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。
3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml 预热至37 ℃的细胞松弛素B 溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB 溶液。
4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。
5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min ，室温晾干。
7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min ，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。
8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min ，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。
【注意事项】：
1．在离心管内加入的5ml 细胞核松弛素B 溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。
2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。
3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。
4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。
【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性
蛋白，即细胞核。