摘要：目的：研究临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌相关耐药基因及整合酶的存在情况。方法：采用美国MicroScan96鉴定药敏分析仪测定菌株及其耐药性。采用聚合酶链反应（PCR）方法检测β-内酰胺酶基因型及整合酶基因。结果：33株鲍曼不动杆菌对阿米卡星耐药率20.3%，左氧氟沙星和环丙沙星耐药率分别30.3%和46.3%，对临床常用抗菌药物均高达70.0%以上。检出β-内酰胺酶基因28株（84.8%），OXA-23阳性22株（66.7%），OXA-51阳性18株（54.5%），AMPC酶阳性18株（54.5%），TEM阳性5株（15.1%），SHV阳性4株（12.1%），PER阳性3株（0.9%），14株（50%）同时携带3种以上基因。整合酶Intl 1阳性26株（78.8%），Intl 2阳性5株（15.1%），未检出IMP、VIM、CTX-M-9，DHA、OXA-24、OXA-58，Intl 3。结论：本地区多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因携带率高，整合酶Intl 1携带率高。 关键词：鲍曼不动杆菌 多重耐药 耐药基因 整合子 Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.02.006 【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）02-0006-02 鲍曼不动杆菌（ABA）是医院感染常见的病原菌之一。由于抗菌药物的大量使用，使该菌多重耐药甚至泛耐药的菌株不断增加[1]，其引起的感染治疗不断面临诸多挑战。为研究本地区多重耐药ABA菌株对抗菌药物的耐药机制，我们采用聚合酶链反应（PCR）方法对临床分离的33株多重耐药ABA菌株检测相关β-内酰胺酶基因型及整合酶基因。 1 材料和方法 1.1 菌株来源。33株菌从2008年9月-2012年5月住院患者临床标本中分离收集，其中痰液29株，中段尿2株和伤口分泌物2株，科室分布主要来自神经外科ICU和中心ICU。质控菌株为ATCC25922大肠埃希菌和ATCC27853铜绿假单胞菌。 1.2 仪器与试剂。鉴定药敏分析仪为美国MicroScan96型；电泳仪；PCR扩增仪；UVI凝胶成像仪；Premix Tag酶体系及DNA Marker DL2000引物。 1.3 药敏试验。采用微量肉汤稀释法。采用美国MicroScan96全自动微生物鉴定药敏分析仪，阴性复合板NC50测定13种抗菌药物的敏感性，敏感性判断依据为2010年美国临床实验室标准化研究所（CLSI）标准。 1.4 模板的制备。采用煮沸法。挑取已分纯的菌落至内含0.5ml无菌蒸馏水的离心管内，沸水煮10min后立即放冰块上冷却，然后离心（4℃1200r/min）5分钟，无菌吸取上清液即为DNA模板液，-20℃冰箱保存备用。 1.5 耐药基因检测。均采用PCR法。15种耐药基因PCR引物序列见表1。靶基因PCR扩增体系：Premix Tag酶体系25ul，上下游引物各10pmol，模板DNA 4ul，用ddH2O补足至50ul。热循环参数均为：94℃预变性45s，然后94℃45s→55℃45s→72℃1min，循环35周期，最后一个72℃延长至10min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现目的条带判定为阳性。 表1 相关耐药基因PCR引物序列 2 结果 2.1 药敏试验结果。33株鲍曼不动杆菌除对阿米卡星耐药率最低20.3%，左氧氟沙星和环丙沙星耐药率分别为30.3%和46.3%外，对其他临床常用11种抗菌药物均高达70.0%以上。对碳青霉烯类药物亚胺培南及美罗培南耐药率也分别高达80.0%和76.5%。结果见表2。 表2 33株鲍曼不动杆菌对13种抗菌药物的耐药情况（%） 2.2 基因PCR检测结果。检出β-内酰胺酶基因28株，检出率为84.8%。OXA-23样阳性22株（66.7%），OXA-51样阳性18株（54.5%），AMPC酶阳性18株（54.5%），TEM阳性5株（16.6%），SHV阳性4株13.3%，PER阳性3株（10%）。同时携带3种或以上耐药基因有14株（50%）。整合酶Intl 1阳性26株（78.8%），Intl 2阳性5株（15.1%），未检出VIM、IMP、OXA-24、OXA-58、DHA、CTX-M-9组和Intl 3。 3 讨论 多重耐药鲍曼不动杆菌已成为医院感染重要病原菌之一，可引起医院内呼吸道感染，泌尿系感染，软组织感染，菌血症等，给临床治疗带来极大困难[2]。本组研究显示，临床标本来源包括痰液、伤口分泌物和中段尿。33例感染多重耐药鲍曼不动杆菌的患者中28例来源于痰液，并且这些患者均有不同程度的呼吸道感染症状。科室分布集中在神经外科ICU和中心ICU，这些患者基础疾病重，抵抗力差，说明多重耐药ABA菌引起的感染以呼吸道感染为主，且容易感染免疫力低下及重症患者。医院感然管理应重点加强ICU病房的环境监测，加强消毒隔离措施，特别是呼吸机，吸痰器的消毒处理，防止病原菌的污染，引起医院内交叉传播。碳青霉烯类药物曾是治疗多重耐药细菌感染的有效药物，本组研究对碳青霉烯类药物美罗培南及亚胺培南耐药率分别高达76.5%和80.0%，对三代以上头孢菌素耐药率均在80.0%以上，耐药率较低是阿米卡星20.3%，其次为左氧氟沙星30.3%，因此，本地区多重耐药ABA感染治疗首选药物应考虑阿米卡星及左氧氟沙星。临床医师应重视病原菌的送检，根据药敏结果选用抗菌药物。尽量减少因经验用药引起的治疗失败，减少病人经济负担，降低耐药菌的出现。 鲍曼不动杆菌耐药基制复杂，其通过产生多种β-内酰胺酶、金属β-内酰胺酶、质粒头孢菌素酶及外膜孔蛋白OprD2缺失[3-5]等，对多种抗菌药物产生耐药性。我国研究发现ABA菌可以获得多种β内酰胺酶基因如TEM、SHV、PER及OXA等[6-7]。本组研究发现，33株多重耐药鲍曼不动杆菌中有28株携带β内酰胺酶耐药基因，携带率高达84.8%（28/33），其中22株携带OXA-23样基因，携带率为66.7%；OXA-51样18株，携带率为54.5%；AMPC18株，携带率54.5%；TEM5株，携带率15.1%；SHV4株，携带率12.1%；PER3株，携带率0.9%。提示本地区多重耐药ABA的耐药机制与产OXA-23样、OXA-51样和AMPC酶密切相关，是引起本地区β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因之一，少数菌株与TEM、SHV、PER相关。 整合子是一种携带有位点特异性重组功能的基因片段，能够识别和俘获携带有耐药基因的移动性基因盒。整合酶属于络氨酸整合酶家族，整合子根据其携带的整合酶基因不同可分6类，与细菌密切相关的整合酶基因主要有Intl1，Intl2和Intl3。整合子通过位点专一重组系统整合外来耐药基因，使耐药基因不断得到累积，从而使细菌形成耐药性和多重耐药性[8]。本研究中Ⅰ类整合酶的检出率为78.8%，与国内林丽等报道检出率80.4%基本一致[9]。ABA菌Ⅰ类整合酶的高携带可能是其多重耐药的原因之一。Ⅰ类整合酶是临床分布最广的一类整合酶，应引起临床医疗工作者及科研人员的高度关注。研究表明，细菌整合子可以通过存在于质粒、转座子等可移动基因，在同种或不同种属间进行耐药基因的水平移动，从而引起细菌耐药性的传播。因此，应及时了解ABA的耐药情况，采取有效预防和治疗措施，减少多重耐药菌的传播。 综上所述，多重耐药鲍曼不动杆菌耐药情况严重，携带多种β-内酰胺酶基因，整合酶基因Intl1携带率高。研究多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药机制，进一步指导临床合理应用抗生素，严格控制抗菌药物的使用，防止耐药菌株的暴发流行。 参考文献 [1] 胡婧，都鹏飞.1003株鲍曼不动杆菌医院感染的分布与耐药性分析.中华医院感染学杂志，2010，20：1010-1012 [2] Doi Y，Husain S，Potoski BA，et al.Extensively drug-resistanta Acinciobacter baumannii.Emerg Infect Dis，2009，15：980-982 [3] HeritierC，ProiretL，LambertT，et al.Contribution of Acqured Carbapenem-Hydrolyzing Oxacillinases to Carbapenem Resistance in Acinetobter baumannii[J].Antimicrob Agents Chcntother，2005，49（8）：3198-3202 [4] Jeon BC，Jeong SH，Bae IK，ct al.Investingatian of a nonsocomial outbreak of imipenem Acintobacter baumannii producting the OXA-23 beta-lactamase in korea[J].J Clin Microbiol，2005，43（5）：2241-2245 [5] 王辉，孙红莉，廖康，等.北京和广州地区四家医药不动杆菌碳青霉烯基因型研究[J].中华检验医学杂志，2005，28（6）：636-641 [6] 史伟峰，姜建平，姚玉华.鲍曼不动杆菌的耐药性及β-内酰胺酶基因型研究[J].临床检验杂志，2005，23（4）：275-276 [7] 汤凤珍，张伟红，陈惠玲.碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯基因型研究[J].中国感染与化疗杂志，2010，10（5）：636-641 [8] 段荣，陈文骏.细菌整合子的研究进展[J].国际检验医学杂志，2008，27（3）：247-249 [9] 林丽，凌保东，张翔，等.鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子与多重耐药相关性研究[J].中国抗生素杂志，2010，35（1）：54-58
摘要：目的：研究临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌相关耐药基因及整合酶的存在情况。方法：采用美国MicroScan96鉴定药敏分析仪测定菌株及其耐药性。采用聚合酶链反应（PCR）方法检测β-内酰胺酶基因型及整合酶基因。结果：33株鲍曼不动杆菌对阿米卡星耐药率20.3%，左氧氟沙星和环丙沙星耐药率分别30.3%和46.3%，对临床常用抗菌药物均高达70.0%以上。检出β-内酰胺酶基因28株（84.8%），OXA-23阳性22株（66.7%），OXA-51阳性18株（54.5%），AMPC酶阳性18株（54.5%），TEM阳性5株（15.1%），SHV阳性4株（12.1%），PER阳性3株（0.9%），14株（50%）同时携带3种以上基因。整合酶Intl 1阳性26株（78.8%），Intl 2阳性5株（15.1%），未检出IMP、VIM、CTX-M-9，DHA、OXA-24、OXA-58，Intl 3。结论：本地区多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因携带率高，整合酶Intl 1携带率高。 关键词：鲍曼不动杆菌 多重耐药 耐药基因 整合子 Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.02.006 【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）02-0006-02 鲍曼不动杆菌（ABA）是医院感染常见的病原菌之一。由于抗菌药物的大量使用，使该菌多重耐药甚至泛耐药的菌株不断增加[1]，其引起的感染治疗不断面临诸多挑战。为研究本地区多重耐药ABA菌株对抗菌药物的耐药机制，我们采用聚合酶链反应（PCR）方法对临床分离的33株多重耐药ABA菌株检测相关β-内酰胺酶基因型及整合酶基因。 1 材料和方法 1.1 菌株来源。33株菌从2008年9月-2012年5月住院患者临床标本中分离收集，其中痰液29株，中段尿2株和伤口分泌物2株，科室分布主要来自神经外科ICU和中心ICU。质控菌株为ATCC25922大肠埃希菌和ATCC27853铜绿假单胞菌。 1.2 仪器与试剂。鉴定药敏分析仪为美国MicroScan96型；电泳仪；PCR扩增仪；UVI凝胶成像仪；Premix Tag酶体系及DNA Marker DL2000引物。 1.3 药敏试验。采用微量肉汤稀释法。采用美国MicroScan96全自动微生物鉴定药敏分析仪，阴性复合板NC50测定13种抗菌药物的敏感性，敏感性判断依据为2010年美国临床实验室标准化研究所（CLSI）标准。 1.4 模板的制备。采用煮沸法。挑取已分纯的菌落至内含0.5ml无菌蒸馏水的离心管内，沸水煮10min后立即放冰块上冷却，然后离心（4℃1200r/min）5分钟，无菌吸取上清液即为DNA模板液，-20℃冰箱保存备用。 1.5 耐药基因检测。均采用PCR法。15种耐药基因PCR引物序列见表1。靶基因PCR扩增体系：Premix Tag酶体系25ul，上下游引物各10pmol，模板DNA 4ul，用ddH2O补足至50ul。热循环参数均为：94℃预变性45s，然后94℃45s→55℃45s→72℃1min，循环35周期，最后一个72℃延长至10min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现目的条带判定为阳性。 表1 相关耐药基因PCR引物序列 2 结果 2.1 药敏试验结果。33株鲍曼不动杆菌除对阿米卡星耐药率最低20.3%，左氧氟沙星和环丙沙星耐药率分别为30.3%和46.3%外，对其他临床常用11种抗菌药物均高达70.0%以上。对碳青霉烯类药物亚胺培南及美罗培南耐药率也分别高达80.0%和76.5%。结果见表2。 表2 33株鲍曼不动杆菌对13种抗菌药物的耐药情况（%） 2.2 基因PCR检测结果。检出β-内酰胺酶基因28株，检出率为84.8%。OXA-23样阳性22株（66.7%），OXA-51样阳性18株（54.5%），AMPC酶阳性18株（54.5%），TEM阳性5株（16.6%），SHV阳性4株13.3%，PER阳性3株（10%）。同时携带3种或以上耐药基因有14株（50%）。整合酶Intl 1阳性26株（78.8%），Intl 2阳性5株（15.1%），未检出VIM、IMP、OXA-24、OXA-58、DHA、CTX-M-9组和Intl 3。 3 讨论 多重耐药鲍曼不动杆菌已成为医院感染重要病原菌之一，可引起医院内呼吸道感染，泌尿系感染，软组织感染，菌血症等，给临床治疗带来极大困难[2]。本组研究显示，临床标本来源包括痰液、伤口分泌物和中段尿。33例感染多重耐药鲍曼不动杆菌的患者中28例来源于痰液，并且这些患者均有不同程度的呼吸道感染症状。科室分布集中在神经外科ICU和中心ICU，这些患者基础疾病重，抵抗力差，说明多重耐药ABA菌引起的感染以呼吸道感染为主，且容易感染免疫力低下及重症患者。医院感然管理应重点加强ICU病房的环境监测，加强消毒隔离措施，特别是呼吸机，吸痰器的消毒处理，防止病原菌的污染，引起医院内交叉传播。碳青霉烯类药物曾是治疗多重耐药细菌感染的有效药物，本组研究对碳青霉烯类药物美罗培南及亚胺培南耐药率分别高达76.5%和80.0%，对三代以上头孢菌素耐药率均在80.0%以上，耐药率较低是阿米卡星20.3%，其次为左氧氟沙星30.3%，因此，本地区多重耐药ABA感染治疗首选药物应考虑阿米卡星及左氧氟沙星。临床医师应重视病原菌的送检，根据药敏结果选用抗菌药物。尽量减少因经验用药引起的治疗失败，减少病人经济负担，降低耐药菌的出现。 鲍曼不动杆菌耐药基制复杂，其通过产生多种β-内酰胺酶、金属β-内酰胺酶、质粒头孢菌素酶及外膜孔蛋白OprD2缺失[3-5]等，对多种抗菌药物产生耐药性。我国研究发现ABA菌可以获得多种β内酰胺酶基因如TEM、SHV、PER及OXA等[6-7]。本组研究发现，33株多重耐药鲍曼不动杆菌中有28株携带β内酰胺酶耐药基因，携带率高达84.8%（28/33），其中22株携带OXA-23样基因，携带率为66.7%；OXA-51样18株，携带率为54.5%；AMPC18株，携带率54.5%；TEM5株，携带率15.1%；SHV4株，携带率12.1%；PER3株，携带率0.9%。提示本地区多重耐药ABA的耐药机制与产OXA-23样、OXA-51样和AMPC酶密切相关，是引起本地区β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因之一，少数菌株与TEM、SHV、PER相关。 整合子是一种携带有位点特异性重组功能的基因片段，能够识别和俘获携带有耐药基因的移动性基因盒。整合酶属于络氨酸整合酶家族，整合子根据其携带的整合酶基因不同可分6类，与细菌密切相关的整合酶基因主要有Intl1，Intl2和Intl3。整合子通过位点专一重组系统整合外来耐药基因，使耐药基因不断得到累积，从而使细菌形成耐药性和多重耐药性[8]。本研究中Ⅰ类整合酶的检出率为78.8%，与国内林丽等报道检出率80.4%基本一致[9]。ABA菌Ⅰ类整合酶的高携带可能是其多重耐药的原因之一。Ⅰ类整合酶是临床分布最广的一类整合酶，应引起临床医疗工作者及科研人员的高度关注。研究表明，细菌整合子可以通过存在于质粒、转座子等可移动基因，在同种或不同种属间进行耐药基因的水平移动，从而引起细菌耐药性的传播。因此，应及时了解ABA的耐药情况，采取有效预防和治疗措施，减少多重耐药菌的传播。 综上所述，多重耐药鲍曼不动杆菌耐药情况严重，携带多种β-内酰胺酶基因，整合酶基因Intl1携带率高。研究多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药机制，进一步指导临床合理应用抗生素，严格控制抗菌药物的使用，防止耐药菌株的暴发流行。 参考文献 [1] 胡婧，都鹏飞.1003株鲍曼不动杆菌医院感染的分布与耐药性分析.中华医院感染学杂志，2010，20：1010-1012 [2] Doi Y，Husain S，Potoski BA，et al.Extensively drug-resistanta Acinciobacter baumannii.Emerg Infect Dis，2009，15：980-982 [3] HeritierC，ProiretL，LambertT，et al.Contribution of Acqured Carbapenem-Hydrolyzing Oxacillinases to Carbapenem Resistance in Acinetobter baumannii[J].Antimicrob Agents Chcntother，2005，49（8）：3198-3202 [4] Jeon BC，Jeong SH，Bae IK，ct al.Investingatian of a nonsocomial outbreak of imipenem Acintobacter baumannii producting the OXA-23 beta-lactamase in korea[J].J Clin Microbiol，2005，43（5）：2241-2245 [5] 王辉，孙红莉，廖康，等.北京和广州地区四家医药不动杆菌碳青霉烯基因型研究[J].中华检验医学杂志，2005，28（6）：636-641 [6] 史伟峰，姜建平，姚玉华.鲍曼不动杆菌的耐药性及β-内酰胺酶基因型研究[J].临床检验杂志，2005，23（4）：275-276 [7] 汤凤珍，张伟红，陈惠玲.碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯基因型研究[J].中国感染与化疗杂志，2010，10（5）：636-641 [8] 段荣，陈文骏.细菌整合子的研究进展[J].国际检验医学杂志，2008，27（3）：247-249 [9] 林丽，凌保东，张翔，等.鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子与多重耐药相关性研究[J].中国抗生素杂志，2010，35（1）：54-58