生物化学论文——
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究
学院：生命科学学院 学号：A09110038 班级：生科1101班 姓名：冯旭
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究
冯 旭， 张仲文
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）
摘 要：测定萌发小麦种子中淀粉酶的活性并对淀粉酶的活性影响因素进行讨论，对淀粉酶活性的测定是通过测定淀粉酶分解淀粉所得产物——麦芽糖的量来表示酶的活性。麦芽糖能将3、5—二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基化合物（520nm 处有最大吸收峰），其颜色深浅与麦芽糖浓度成正比，利用分光光度法测定棕红色的氨基化合物吸光值，从而得到产物麦芽糖的量，来表示酶的活力。定性分析了温度，PH 值及激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响（利用分解剩余的淀粉和碘液呈蓝色的程度来进行比较）。由此得到最适宜的温度和PH 值，以及抑制剂和激活剂的种类。
关键词：淀粉酶、温度、PH 、抑制剂、激活剂、分光光度计
[1]
12
The research of amylase from sprouting wheat seed
Feng Xu1 , Zhang Zhongwen
(College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China) Abstract: Determine the amylase activity from sprouting wheat seed and discus the reason that
have influenced the activity of amylase. The way to determine the amylase is by determines the content of Malt sugar from starch. Malt sugar cans reduction 3, 5 two salicylic acid to azyl_compound (have the maximum absorption on 520nm), the color will be deep when it has much Malt sugar. We can determine the amylase activity by this way. We always analyses the effect of temperature, PH, activator and restrainer to the activity of amylase, then draw a conclusion what temperature, PH, activator and restrainer is the best to amylase. Key word: Amylase; temperature; PH; activator; restrainer; spectrophotometer
2
收稿日期：2012—12—8 基金项目：无 作者简介： 冯旭（1993-），男，本科生，生物科学专业。E-mail: [email protected]
本实验以萌发的小麦种子为材料，提取得到了淀粉酶，利用α－淀粉酶和β－淀粉酶的活性对温度的差异，分离出α－淀粉酶，并测定了α－淀粉酶的活性和α－淀粉酶和β－淀粉酶的总活性，计算出β－淀粉酶的活性，然后对淀粉酶活性影响因素进行了讨论。不同温度、PH 条件下和抑制剂﹑激活剂情况下淀粉酶对淀粉水解的程度不同，通过定性的分析温度、PH 值和抑制剂﹑激活剂对淀粉酶活性的影响。由此得到酶活性的最适宜的温度和PH 值，以及抑制剂和激活剂的种类。
1 实验材料与方法
1．1材料 小麦（Triticum aestivum L.）、电子天平、研钵、容量瓶、量筒、刻度试管、试管、移液管、离心机、离心管、恒温水浴锅（40度、100度）、分光光度计、1％淀
粉溶液、0.4mol/L NaOH、pH=3.0、5.6、8.0的柠檬酸缓冲液
2实验方法
2．1麦芽糖标准曲线的制作
2．1．1实验原理：植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中有α－淀粉酶及β－淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。
α－淀粉酶和β－淀粉酶都各有其一定的特性，如β－淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β－淀粉酶，便可测定α－淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0℃加以处理，钝化α－淀粉酶，以测出β－淀粉酶的活性。
淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5－二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3－氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽谈到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。
2．1．2操作步骤：称取化学纯麦芽糖0、05g 溶于少量蒸馏水中仔细移入50mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。取25mL 的刻度试管6个，编号1,2,3,4,5,6，分别加入麦芽糖标准液（1mg/mL）0.0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mL ，然后依次分别按编号加入蒸馏水2.0、1.8、1.4、1.0、0.6、0.2，再在各个试管中加3，5-二硝基水杨酸各2.0mL ，
混合沸水浴反应5min 后用蒸馏水定容至25mL ，以第一样为空白试剂在540nm 的波长下进行比色，并记录消光值。，记录光密度，以光密度为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。（表2-1）
表2-1麦芽糖含量实验及吸光值
项目 麦芽糖溶液（mL ） 蒸馏水（mL ） DNS 试剂（mL ）
反应 定容 比色
1 0.0 2.0 2.0
2 0.2 1.8 2.0
3 0.6 1.4 2.0
4 1.0 1.0 2.0
5 1.4 0.6 2.0
6 1.8 0.2 2.0
混合后沸水浴反应5min 用蒸馏水将反应后的溶液定容至25mL 以1试管为空白对照测540nm 时的消光值
表2-2原始数据
项目 吸光值
1 0
2 0．007
3 0．044
4 0．085
5 0．109
6 0．182
2.1.3麦芽糖标准曲线:
2．2淀粉酶活性的测定
2．2．1实验原理：α-淀粉酶耐高温（70℃）不耐酸，β-淀粉酶耐酸但不耐高温；
温度对酶活性的影响很大，因其本质为蛋白质，因此，在不同的温度下酶的活性因而不同。淀粉酶可使淀粉水解，则当被不同温度处理后，让最后的溶液与KI 溶液反应，碘液可使淀粉变蓝，故加入碘液后根据显色可推知大体上淀粉含量的多少，从而得出不同温度对酶
活性的影响程度，并在此之下得出其最适温度。
淀粉酶的活性受pH 影响显著，淀粉酶在一定pH 值范围内才表现它的活性，当被不同pH 处理后，让溶液与KI 溶液反应，碘液可使淀粉变蓝，从而得出不同pH 对酶活性的影响程度，并在此之下得出其最适pH 。 2．2．2操作步骤
2．2．2．1α-淀粉酶活性的测定
称取萌发的小麦种子2g ，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入50mL 刻度试管中定容，振荡，放置15分钟后4000r/min离心，取上清液备用。取三支试管，编号注明1为对照管，2、3支为测试管。于每管中各加入酶提取液1mL ，在70℃恒温水浴中，准确加热5分钟，取出后迅速在自来水中冷却。在试管中各加入1mLpH=5.6的柠檬酸缓冲液。向对照管中加入4mL0.4mol/LnaOH， 40℃恒温水浴中保温15分钟，再加入40℃下预热的1％淀粉溶液2mL ，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min 取出，迅速加入4mL0.4mol/LnaOH，然后准备下一步糖的测定。
取上述酶提取液2mL ，放入刻度试管中，用蒸馏水稀释至50mL ，混合均匀后，按α
－淀粉酶测定法操作，（省略70度水浴）（如表2-2，2-3）
表（2-2） 酶反应体系和程度
管号
淀粉酶提取液（mL ）
加热
柠檬酸缓冲液（mL ） 0.4mol/LNaOH（mL ）
保温
预热的淀粉酶溶液
酶促反应 0.4mol/LNaOH（mL ）
0.0 4.0 A` 1.0
A 1 1.0
A 2 1.0
70℃水浴15min 后冷却至室温（20℃）
各1mL 0.0 40℃水浴15min
各2 mL
摇匀后，40℃水浴15min
4.0
4.0 0.0
经表2-2的处理后，让各个样液与3，5-二硝基水杨酸作用，并测器消光值。详尽步骤如下：
（表2-3）麦芽糖样品的测定
操作＼管号 淀粉酶反应液（mL ） DNS 试剂（mL ） 蒸馏水（mL ）
反应 定容 比色
0 0.0 2.0 2.0
Ⅰ 2.0 2.0 0.0
Ⅱ 2.0 2.0 0.0
Ⅲ 2.0 2.0 0.0
各管混匀沸水浴5min 冷却，用蒸馏水定容至25mL 以0管为空白对比测540nm 处的消光值
2．2．3结果计算
淀粉酶活性=（A-A ’）×样品稀释总体积
样品重*C A:淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量 A 1:淀粉酶对照管中麦芽糖量 C 比色所用样品的毫升数
α-淀粉酶含量：24.5 mg/FW(g)5min β-淀粉酶含量：547.6 mg/FW(g)5min 总淀粉酶含量：572.1 mg/FW(g)5min 2．3淀粉酶酶学性质研究
2．3．1粗酶的提取 称取1克萌发的小麦种子研磨成匀浆，倒入25ml 具塞刻度的试管中，用蒸馏水稀释至刻度线处，离心（5000r/min）10分钟，取上清液备用。
2．3．2定性法分析温度对酶活性影响 准备8支试管分别编号A 、a 、B 、b 、C 、c 、D 、d ，分别在A 、B 、C 、D 管中加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸1ml ，淀粉溶液2.5ml; 在a 、b 、c 、d 管中加入淀粉酶提取液1ml ，分别把A 、a 管放在4℃冷冻箱中, 把B 、b 管放在室温下, 把C 、c 管放在40℃水浴中, 把D 、d 管放在沸水浴中,10min 钟后把A 管中的溶液倒入a 管, 把B 管中的溶液倒入b 管, 把C 管中的溶液倒入c 管, 把D 管中的溶液倒入d 管, 再把a 管放在4℃冷冻箱中, 把b 管放在室温下, 把c 管放在40℃水浴中, 把d 管放在沸水浴中, 进行酶促反应10min; 最后在a 、b 、c 、d 管中加入碘液各3滴, 并观察颜色变化情况。(表2-4)
（表2-4） 温度对酶活性的影响
管号
缓冲液（pH5.6）（mL ）
淀粉溶液（mL ） 淀粉酶提取液（mL ） 预保温（10min ）
混合 酶促反应 KI 溶液 显色
A 1.0 2.5
a 1.0 4℃
B 1.0 2.5
b 1.0
C 1.0 2.5
c 1.0
D 1.0 2.5
d 1.0
室温 B →b 室温
40℃ C →c 40℃
沸水浴 D →d 沸水浴
A →a 4℃
各三滴（滴管先冷却至室温）
蓝色
淡紫
淡黄
淡蓝
2．3.3定性法分析PH 值对酶活性影响 准备三支试管分别编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ, 在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ管中分别加入PH=3.0、PH=5.6、PH=8.0的缓冲液柠檬酸2ml, 淀粉溶液2.5ml, 淀粉酶提取液1ml; 最后各管混匀，放在40℃水浴中进行酶促反应10min, 各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。表2-5
（表五） pH 对淀粉酶活性的影响
操作＼管号 缓冲液（pH5.6）（mL ）
淀粉溶液（mL ） 淀粉酶提取液（mL ）
酶促反应 碘液 显色
蓝色 Ⅰ 2.0/（pH3.0）
Ⅱ 2.0/（pH5.6） 各2.5mL 各1.0mL 摇匀，40℃水浴10min
各三滴 无色
蓝色 Ⅲ 2.0/（pH8.0）
2.3.4定性法分析激活剂或抑制剂对酶活性影响 准备4支试管分别编号1、2、3、4, 第一步在1、2、3、4管中分别加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸2ml; 在1管中加入NaCl 溶液1ml ，在2管中加入CuSO4溶液1ml ，在3中加入NaSO41ml ，在4管中加入蒸馏水1ml ，分别中加入0.1%的淀粉溶液2.5ml; 分别在4只管中加入淀粉酶提取液1ml; 最后各管混匀，放在40℃水浴中进行酶促反应10min, 各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。（表2-6）
（表2-6）激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响
管号 4缓冲液（mL ） Nacl 溶液（mL ） CuSO4溶液（mL ） NaSO4溶液（mL ）
蒸馏水 淀粉溶液（mL ） 淀粉酶提取液（mL ）
酶促反应 碘液 显色
透明
淡蓝兰
1.0
1.0
各2.5mL 各1.0mL
摇匀，40℃水浴10min
各3滴
较浑
较透明
1
2
各2.0mL
1.0
1.0
3
4
2．3．5 结果
2．3．5．1温度对小麦淀粉酶的影响
浅蓝色 几乎无色 无色 深蓝色
a.4℃：酶的活性几乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色； b. 室温：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈浅蓝色； c.40℃：酶的活性达到相对最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近无色； d. 沸水浴：酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色； 由此可以看出40℃是小麦淀粉酶的最适温度。
2．3．5．2 PH对小麦淀粉酶的影响
浅蓝色 无色 淡蓝紫色
a.PH=3.0：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色 b.PH=5.6：淀粉酶活性达到相对最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈无色 c.PH=8.0：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈浅蓝色 由此可以看出pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH 2．3．5．3激活剂，抑制剂对小麦淀粉酶的影响
a. 空白对照组：加入碘液后几乎呈无色
b. 加NaCl 的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈无色 c. 加CuSO 4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深蓝色 由此可以看出NaCl 是小麦淀粉酶的激活剂；CuSO 4小麦淀粉酶的抑制剂 3讨论
3．1通过对淀粉酶活性初步研究, 说明温度、PH 、激活剂、抑制剂是影响淀粉酶活性的重要因素。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40℃
澄清 蓝色 稍浑浊 澄清稍浑浊
左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱; 在一定PH 范围内，酶的活性随PH 的升高而升高，当达到某一PH （5.6左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一PH 时，酶的活性随PH 的升高而降低，直到失去活性；Cl 使酶的活性增强Cu 使酶活性减弱。
3．2研究酶有重要的意义。生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的, 酶有两种功能:其一, 催化各种生化反应, 是生物催化剂; 其二, 调节和控制代谢的速度、方向和途径, 是新陈代谢的调节元件。酶对细胞代谢的调节主要有两种方式:一是通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性; 另一种是通过影响酶分子的合成和降解, 以改变酶分子的含量。这种酶水平的调节机制是代谢的最关键的调节。现代酶学正向着两个方向发展：酶的分子生物学和酶工程学，它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益。
3．3对于酶活力测定的方法有很多, 比如测定酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法, 该法建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测α-淀粉酶活性的方法, 此法的实验条件容易控制, 重复性好。组织印渍法在玉米种子吸水约5h 后即可检测到α-淀粉酶活性; 再如2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷作底物直接测定α-淀粉酶法, 该法用新底物2－氯－4－硝基苯－α－半乳糖－麦芽糖苷（Gal －G2－α－CNP ）直接测定α－淀粉酶，不需要辅助酶，延滞时间短（＜15s ），线性范围宽（可达2200U ／L ），试剂稳定性好，不使用KSCN 、NaN3等激活剂，不受内源性葡萄糖苷酶的干扰，与EPS 法对比相关良好。 致 谢：生命科学学院刘冬梅讲师；生命科学学院生物化工教研室 [参考文献]
[1]王林嵩．生物化学实验技术[M]．北京：科学出版社，2001，29—32．
[2]刘春莉, 张文学, 江孝明, 杨瑞. 新型耐酸性液化糖化酶的分离提取及其特性 [J];酿酒; 2003年03期 [3]胡琼英，狄洌等．生物化学实验[M]．北京：化学工业出版社，2007，24—26 [4]王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学（下）. 北京：高等教育出版社，2002，543 [5] 罗贯民，曹淑桂等．酶工程[M]．北京：中国农业出版社，2000，1—4． [6] 李勇. 2-氯-4-硝基苯-D-葡萄糖苷合成方法的研究[D]南京理工大学 , 2004
[6]
[3]
[5]
[4]
2+
[3]
-
生物化学论文——
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究
学院：生命科学学院 学号：A09110038 班级：生科1101班 姓名：冯旭
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究
冯 旭， 张仲文
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）
摘 要：测定萌发小麦种子中淀粉酶的活性并对淀粉酶的活性影响因素进行讨论，对淀粉酶活性的测定是通过测定淀粉酶分解淀粉所得产物——麦芽糖的量来表示酶的活性。麦芽糖能将3、5—二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基化合物（520nm 处有最大吸收峰），其颜色深浅与麦芽糖浓度成正比，利用分光光度法测定棕红色的氨基化合物吸光值，从而得到产物麦芽糖的量，来表示酶的活力。定性分析了温度，PH 值及激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响（利用分解剩余的淀粉和碘液呈蓝色的程度来进行比较）。由此得到最适宜的温度和PH 值，以及抑制剂和激活剂的种类。
关键词：淀粉酶、温度、PH 、抑制剂、激活剂、分光光度计
[1]
12
The research of amylase from sprouting wheat seed
Feng Xu1 , Zhang Zhongwen
(College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China) Abstract: Determine the amylase activity from sprouting wheat seed and discus the reason that
have influenced the activity of amylase. The way to determine the amylase is by determines the content of Malt sugar from starch. Malt sugar cans reduction 3, 5 two salicylic acid to azyl_compound (have the maximum absorption on 520nm), the color will be deep when it has much Malt sugar. We can determine the amylase activity by this way. We always analyses the effect of temperature, PH, activator and restrainer to the activity of amylase, then draw a conclusion what temperature, PH, activator and restrainer is the best to amylase. Key word: Amylase; temperature; PH; activator; restrainer; spectrophotometer
2
收稿日期：2012—12—8 基金项目：无 作者简介： 冯旭（1993-），男，本科生，生物科学专业。E-mail: [email protected]
本实验以萌发的小麦种子为材料，提取得到了淀粉酶，利用α－淀粉酶和β－淀粉酶的活性对温度的差异，分离出α－淀粉酶，并测定了α－淀粉酶的活性和α－淀粉酶和β－淀粉酶的总活性，计算出β－淀粉酶的活性，然后对淀粉酶活性影响因素进行了讨论。不同温度、PH 条件下和抑制剂﹑激活剂情况下淀粉酶对淀粉水解的程度不同，通过定性的分析温度、PH 值和抑制剂﹑激活剂对淀粉酶活性的影响。由此得到酶活性的最适宜的温度和PH 值，以及抑制剂和激活剂的种类。
1 实验材料与方法
1．1材料 小麦（Triticum aestivum L.）、电子天平、研钵、容量瓶、量筒、刻度试管、试管、移液管、离心机、离心管、恒温水浴锅（40度、100度）、分光光度计、1％淀
粉溶液、0.4mol/L NaOH、pH=3.0、5.6、8.0的柠檬酸缓冲液
2实验方法
2．1麦芽糖标准曲线的制作
2．1．1实验原理：植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中有α－淀粉酶及β－淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。
α－淀粉酶和β－淀粉酶都各有其一定的特性，如β－淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β－淀粉酶，便可测定α－淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0℃加以处理，钝化α－淀粉酶，以测出β－淀粉酶的活性。
淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5－二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3－氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽谈到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。
2．1．2操作步骤：称取化学纯麦芽糖0、05g 溶于少量蒸馏水中仔细移入50mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。取25mL 的刻度试管6个，编号1,2,3,4,5,6，分别加入麦芽糖标准液（1mg/mL）0.0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mL ，然后依次分别按编号加入蒸馏水2.0、1.8、1.4、1.0、0.6、0.2，再在各个试管中加3，5-二硝基水杨酸各2.0mL ，
混合沸水浴反应5min 后用蒸馏水定容至25mL ，以第一样为空白试剂在540nm 的波长下进行比色，并记录消光值。，记录光密度，以光密度为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。（表2-1）
表2-1麦芽糖含量实验及吸光值
项目 麦芽糖溶液（mL ） 蒸馏水（mL ） DNS 试剂（mL ）
反应 定容 比色
1 0.0 2.0 2.0
2 0.2 1.8 2.0
3 0.6 1.4 2.0
4 1.0 1.0 2.0
5 1.4 0.6 2.0
6 1.8 0.2 2.0
混合后沸水浴反应5min 用蒸馏水将反应后的溶液定容至25mL 以1试管为空白对照测540nm 时的消光值
表2-2原始数据
项目 吸光值
1 0
2 0．007
3 0．044
4 0．085
5 0．109
6 0．182
2.1.3麦芽糖标准曲线:
2．2淀粉酶活性的测定
2．2．1实验原理：α-淀粉酶耐高温（70℃）不耐酸，β-淀粉酶耐酸但不耐高温；
温度对酶活性的影响很大，因其本质为蛋白质，因此，在不同的温度下酶的活性因而不同。淀粉酶可使淀粉水解，则当被不同温度处理后，让最后的溶液与KI 溶液反应，碘液可使淀粉变蓝，故加入碘液后根据显色可推知大体上淀粉含量的多少，从而得出不同温度对酶
活性的影响程度，并在此之下得出其最适温度。
淀粉酶的活性受pH 影响显著，淀粉酶在一定pH 值范围内才表现它的活性，当被不同pH 处理后，让溶液与KI 溶液反应，碘液可使淀粉变蓝，从而得出不同pH 对酶活性的影响程度，并在此之下得出其最适pH 。 2．2．2操作步骤
2．2．2．1α-淀粉酶活性的测定
称取萌发的小麦种子2g ，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入50mL 刻度试管中定容，振荡，放置15分钟后4000r/min离心，取上清液备用。取三支试管，编号注明1为对照管，2、3支为测试管。于每管中各加入酶提取液1mL ，在70℃恒温水浴中，准确加热5分钟，取出后迅速在自来水中冷却。在试管中各加入1mLpH=5.6的柠檬酸缓冲液。向对照管中加入4mL0.4mol/LnaOH， 40℃恒温水浴中保温15分钟，再加入40℃下预热的1％淀粉溶液2mL ，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min 取出，迅速加入4mL0.4mol/LnaOH，然后准备下一步糖的测定。
取上述酶提取液2mL ，放入刻度试管中，用蒸馏水稀释至50mL ，混合均匀后，按α
－淀粉酶测定法操作，（省略70度水浴）（如表2-2，2-3）
表（2-2） 酶反应体系和程度
管号
淀粉酶提取液（mL ）
加热
柠檬酸缓冲液（mL ） 0.4mol/LNaOH（mL ）
保温
预热的淀粉酶溶液
酶促反应 0.4mol/LNaOH（mL ）
0.0 4.0 A` 1.0
A 1 1.0
A 2 1.0
70℃水浴15min 后冷却至室温（20℃）
各1mL 0.0 40℃水浴15min
各2 mL
摇匀后，40℃水浴15min
4.0
4.0 0.0
经表2-2的处理后，让各个样液与3，5-二硝基水杨酸作用，并测器消光值。详尽步骤如下：
（表2-3）麦芽糖样品的测定
操作＼管号 淀粉酶反应液（mL ） DNS 试剂（mL ） 蒸馏水（mL ）
反应 定容 比色
0 0.0 2.0 2.0
Ⅰ 2.0 2.0 0.0
Ⅱ 2.0 2.0 0.0
Ⅲ 2.0 2.0 0.0
各管混匀沸水浴5min 冷却，用蒸馏水定容至25mL 以0管为空白对比测540nm 处的消光值
2．2．3结果计算
淀粉酶活性=（A-A ’）×样品稀释总体积
样品重*C A:淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量 A 1:淀粉酶对照管中麦芽糖量 C 比色所用样品的毫升数
α-淀粉酶含量：24.5 mg/FW(g)5min β-淀粉酶含量：547.6 mg/FW(g)5min 总淀粉酶含量：572.1 mg/FW(g)5min 2．3淀粉酶酶学性质研究
2．3．1粗酶的提取 称取1克萌发的小麦种子研磨成匀浆，倒入25ml 具塞刻度的试管中，用蒸馏水稀释至刻度线处，离心（5000r/min）10分钟，取上清液备用。
2．3．2定性法分析温度对酶活性影响 准备8支试管分别编号A 、a 、B 、b 、C 、c 、D 、d ，分别在A 、B 、C 、D 管中加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸1ml ，淀粉溶液2.5ml; 在a 、b 、c 、d 管中加入淀粉酶提取液1ml ，分别把A 、a 管放在4℃冷冻箱中, 把B 、b 管放在室温下, 把C 、c 管放在40℃水浴中, 把D 、d 管放在沸水浴中,10min 钟后把A 管中的溶液倒入a 管, 把B 管中的溶液倒入b 管, 把C 管中的溶液倒入c 管, 把D 管中的溶液倒入d 管, 再把a 管放在4℃冷冻箱中, 把b 管放在室温下, 把c 管放在40℃水浴中, 把d 管放在沸水浴中, 进行酶促反应10min; 最后在a 、b 、c 、d 管中加入碘液各3滴, 并观察颜色变化情况。(表2-4)
（表2-4） 温度对酶活性的影响
管号
缓冲液（pH5.6）（mL ）
淀粉溶液（mL ） 淀粉酶提取液（mL ） 预保温（10min ）
混合 酶促反应 KI 溶液 显色
A 1.0 2.5
a 1.0 4℃
B 1.0 2.5
b 1.0
C 1.0 2.5
c 1.0
D 1.0 2.5
d 1.0
室温 B →b 室温
40℃ C →c 40℃
沸水浴 D →d 沸水浴
A →a 4℃
各三滴（滴管先冷却至室温）
蓝色
淡紫
淡黄
淡蓝
2．3.3定性法分析PH 值对酶活性影响 准备三支试管分别编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ, 在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ管中分别加入PH=3.0、PH=5.6、PH=8.0的缓冲液柠檬酸2ml, 淀粉溶液2.5ml, 淀粉酶提取液1ml; 最后各管混匀，放在40℃水浴中进行酶促反应10min, 各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。表2-5
（表五） pH 对淀粉酶活性的影响
操作＼管号 缓冲液（pH5.6）（mL ）
淀粉溶液（mL ） 淀粉酶提取液（mL ）
酶促反应 碘液 显色
蓝色 Ⅰ 2.0/（pH3.0）
Ⅱ 2.0/（pH5.6） 各2.5mL 各1.0mL 摇匀，40℃水浴10min
各三滴 无色
蓝色 Ⅲ 2.0/（pH8.0）
2.3.4定性法分析激活剂或抑制剂对酶活性影响 准备4支试管分别编号1、2、3、4, 第一步在1、2、3、4管中分别加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸2ml; 在1管中加入NaCl 溶液1ml ，在2管中加入CuSO4溶液1ml ，在3中加入NaSO41ml ，在4管中加入蒸馏水1ml ，分别中加入0.1%的淀粉溶液2.5ml; 分别在4只管中加入淀粉酶提取液1ml; 最后各管混匀，放在40℃水浴中进行酶促反应10min, 各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。（表2-6）
（表2-6）激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响
管号 4缓冲液（mL ） Nacl 溶液（mL ） CuSO4溶液（mL ） NaSO4溶液（mL ）
蒸馏水 淀粉溶液（mL ） 淀粉酶提取液（mL ）
酶促反应 碘液 显色
透明
淡蓝兰
1.0
1.0
各2.5mL 各1.0mL
摇匀，40℃水浴10min
各3滴
较浑
较透明
1
2
各2.0mL
1.0
1.0
3
4
2．3．5 结果
2．3．5．1温度对小麦淀粉酶的影响
浅蓝色 几乎无色 无色 深蓝色
a.4℃：酶的活性几乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色； b. 室温：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈浅蓝色； c.40℃：酶的活性达到相对最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近无色； d. 沸水浴：酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色； 由此可以看出40℃是小麦淀粉酶的最适温度。
2．3．5．2 PH对小麦淀粉酶的影响
浅蓝色 无色 淡蓝紫色
a.PH=3.0：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色 b.PH=5.6：淀粉酶活性达到相对最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈无色 c.PH=8.0：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈浅蓝色 由此可以看出pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH 2．3．5．3激活剂，抑制剂对小麦淀粉酶的影响
a. 空白对照组：加入碘液后几乎呈无色
b. 加NaCl 的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈无色 c. 加CuSO 4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深蓝色 由此可以看出NaCl 是小麦淀粉酶的激活剂；CuSO 4小麦淀粉酶的抑制剂 3讨论
3．1通过对淀粉酶活性初步研究, 说明温度、PH 、激活剂、抑制剂是影响淀粉酶活性的重要因素。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40℃
澄清 蓝色 稍浑浊 澄清稍浑浊
左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱; 在一定PH 范围内，酶的活性随PH 的升高而升高，当达到某一PH （5.6左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一PH 时，酶的活性随PH 的升高而降低，直到失去活性；Cl 使酶的活性增强Cu 使酶活性减弱。
3．2研究酶有重要的意义。生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的, 酶有两种功能:其一, 催化各种生化反应, 是生物催化剂; 其二, 调节和控制代谢的速度、方向和途径, 是新陈代谢的调节元件。酶对细胞代谢的调节主要有两种方式:一是通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性; 另一种是通过影响酶分子的合成和降解, 以改变酶分子的含量。这种酶水平的调节机制是代谢的最关键的调节。现代酶学正向着两个方向发展：酶的分子生物学和酶工程学，它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益。
3．3对于酶活力测定的方法有很多, 比如测定酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法, 该法建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测α-淀粉酶活性的方法, 此法的实验条件容易控制, 重复性好。组织印渍法在玉米种子吸水约5h 后即可检测到α-淀粉酶活性; 再如2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷作底物直接测定α-淀粉酶法, 该法用新底物2－氯－4－硝基苯－α－半乳糖－麦芽糖苷（Gal －G2－α－CNP ）直接测定α－淀粉酶，不需要辅助酶，延滞时间短（＜15s ），线性范围宽（可达2200U ／L ），试剂稳定性好，不使用KSCN 、NaN3等激活剂，不受内源性葡萄糖苷酶的干扰，与EPS 法对比相关良好。 致 谢：生命科学学院刘冬梅讲师；生命科学学院生物化工教研室 [参考文献]
[1]王林嵩．生物化学实验技术[M]．北京：科学出版社，2001，29—32．
[2]刘春莉, 张文学, 江孝明, 杨瑞. 新型耐酸性液化糖化酶的分离提取及其特性 [J];酿酒; 2003年03期 [3]胡琼英，狄洌等．生物化学实验[M]．北京：化学工业出版社，2007，24—26 [4]王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学（下）. 北京：高等教育出版社，2002，543 [5] 罗贯民，曹淑桂等．酶工程[M]．北京：中国农业出版社，2000，1—4． [6] 李勇. 2-氯-4-硝基苯-D-葡萄糖苷合成方法的研究[D]南京理工大学 , 2004
[6]
[3]
[5]
[4]
2+
[3]
-