09级3班
组长：李江琴
组员：郝建花 李咏霞 罗文菲 李画 李琼 姜大韧 孙劭华
产纤溶活性酶芽孢杆菌的分离鉴定及活性测定
实验方案
一、分离材料
豆豉（豆豉酱、豆瓣酱、腐乳、酱油、甜面酱）
二、培养基
1、富集培养基: 葡萄糖12 g/L, 酵母膏5 g/L, 水1000 mL, 血粉20 g, pH7.2～7.5。
2、初筛培养基: 0.5%牛肉膏, 1.0%蛋白胨,0.5%NaCl, 2.0%琼脂, pH7.2～7.4。
3、复筛培养基:3%麦芽糖, 0.7%蛋白胨,0 . 15% 酵母粉, 0.02%二水氯化钙, 0.25%磷酸氢二钾, 0.05% 五水硫酸镁, 0.05% 磷酸二氢钾,pH7.2～7.4。
4、液体发酵培养基：大豆粉4％，大米粉2％，氯化钙0.04％，硫酸镁 0.07％，磷酸氢二钾0.4％ ，磷酸二氢钾0.2％。
三、筛选 （即菌株的获得）
1、接种
将收集到的豆豉制成悬浮液, 取稀释为不同浓度梯度稀释液0. 2 mL 涂布于富集营养基平板上，37℃培养24h ，4 ℃冰箱保存备用。
2、菌种的初筛
挑选拉粘丝的、水解圈与菌落直径比值较大的菌株接种于初筛培养基中, 再于37 ℃下150 r/min 振荡培养24小时, 然后挑取溶圈大的菌进行复筛。
3、菌种的复筛
用无菌牙签将初筛得到的菌接种在复筛培养基平板上,37 ℃培养18h 后用游标卡尺测定菌落直径和透明圈直径, 计算溶圈与菌落的面积比, 选择比值大的菌落。垂直直径的乘积为溶解圈的面积。溶解圈面积最大的菌株作为发酵生产纤溶酶的目的菌株。
四、发酵
所获菌种接种液体发酵培养基, 37 ℃ 180r/ min 培养24 h 。
五、分离
离心取发酵液上清液, 测其纤溶活性。 具有纤溶活性的菌株进行分离纯化, 如此循环多次。
六、鉴定
1、菌种鉴定
按R1 E1 布坎南,N1 E1 吉本斯等编《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版) 所述芽孢杆菌属(B acillus) 典型的菌体、菌落形态特征和生理生化特性, 对筛选的菌株进行鉴定。
2、菌体形态
革兰氏染色呈阳性，菌体为短杆状，两端钝圆，大致呈椭圆形，长1.4—2.0um, 宽0.6—0.8um 。有芽孢，芽孢偏端生，呈柱状，不膨
大，多为两端均匀染色。具有运动性, 周生鞭毛。
3、菌落形态
单菌落为白色或微黄色, 近圆形, 边缘呈波状, 不整齐，中央突起有褶皱，呈火山口状, 不透明, 质地干燥, 无光泽。
将观察到的菌株与枯草芽孢杆菌标准菌对照, 包括形态、生理、生化, 同时根据《伯杰氏细菌鉴定手册》, 该菌株可初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
4、生理生化鉴定
胞内无聚2β2羟基丁酸盐(PHB) 颗粒, 氧化酶、接触酶皆阳性, 不产卵磷脂酶, 产乙酰甲基甲醇(V2P 反应阳性) , 在7 % NaCl 中不生长, 在p H 517 肉汤中生长, 石蕊牛奶产酸, 水解淀粉, 硝酸盐可还原到亚硝酸盐, 能在厌氧培养基中生长, 对葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇均能产酸, 能利用柠檬酸盐而不利用丙酸盐, 明胶不液化, 能产二羟基丙酮。
七、发酵液纤溶酶活性测定
8000r/ min ,离心5min ，取上清液, 测定其纤溶酶活力。 测定纤溶酶活力: 将90mm 纤维蛋白平板37 ℃孵育10min 后均匀打6 个直径2mm 的孔, 分别移入10μL 粗酶液。室温静置10 min ,37 ℃培养18h ,测定透明圈的最大直径以及与之垂直的直径, 并计算直径积。参照尿激酶标准曲线, 将待测菌落透明圈的直径积与标准曲线比较, 查出样品酶活。
尿激酶标准曲线的绘制:取适量尿激酶标准品, 用PBS 制成2 IU/
μL , 4 IU/μL , 6 IU/μL , 8 IU/μL ,10 IU/μL 标准液。分别取10μL 标准酶液, 加入纤维蛋白平板上的孔中。37 ℃培养18h 后测量透明圈的最大直径以及与之垂直的直径, 计算直径乘积; 以直径积为横坐标, 酶活为纵坐标, 在对数坐标纸上制作标准曲线。
09级3班
组长：李江琴
组员：郝建花 李咏霞 罗文菲 李画 李琼 姜大韧 孙劭华
产纤溶活性酶芽孢杆菌的分离鉴定及活性测定
实验方案
一、分离材料
豆豉（豆豉酱、豆瓣酱、腐乳、酱油、甜面酱）
二、培养基
1、富集培养基: 葡萄糖12 g/L, 酵母膏5 g/L, 水1000 mL, 血粉20 g, pH7.2～7.5。
2、初筛培养基: 0.5%牛肉膏, 1.0%蛋白胨,0.5%NaCl, 2.0%琼脂, pH7.2～7.4。
3、复筛培养基:3%麦芽糖, 0.7%蛋白胨,0 . 15% 酵母粉, 0.02%二水氯化钙, 0.25%磷酸氢二钾, 0.05% 五水硫酸镁, 0.05% 磷酸二氢钾,pH7.2～7.4。
4、液体发酵培养基：大豆粉4％，大米粉2％，氯化钙0.04％，硫酸镁 0.07％，磷酸氢二钾0.4％ ，磷酸二氢钾0.2％。
三、筛选 （即菌株的获得）
1、接种
将收集到的豆豉制成悬浮液, 取稀释为不同浓度梯度稀释液0. 2 mL 涂布于富集营养基平板上，37℃培养24h ，4 ℃冰箱保存备用。
2、菌种的初筛
挑选拉粘丝的、水解圈与菌落直径比值较大的菌株接种于初筛培养基中, 再于37 ℃下150 r/min 振荡培养24小时, 然后挑取溶圈大的菌进行复筛。
3、菌种的复筛
用无菌牙签将初筛得到的菌接种在复筛培养基平板上,37 ℃培养18h 后用游标卡尺测定菌落直径和透明圈直径, 计算溶圈与菌落的面积比, 选择比值大的菌落。垂直直径的乘积为溶解圈的面积。溶解圈面积最大的菌株作为发酵生产纤溶酶的目的菌株。
四、发酵
所获菌种接种液体发酵培养基, 37 ℃ 180r/ min 培养24 h 。
五、分离
离心取发酵液上清液, 测其纤溶活性。 具有纤溶活性的菌株进行分离纯化, 如此循环多次。
六、鉴定
1、菌种鉴定
按R1 E1 布坎南,N1 E1 吉本斯等编《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版) 所述芽孢杆菌属(B acillus) 典型的菌体、菌落形态特征和生理生化特性, 对筛选的菌株进行鉴定。
2、菌体形态
革兰氏染色呈阳性，菌体为短杆状，两端钝圆，大致呈椭圆形，长1.4—2.0um, 宽0.6—0.8um 。有芽孢，芽孢偏端生，呈柱状，不膨
大，多为两端均匀染色。具有运动性, 周生鞭毛。
3、菌落形态
单菌落为白色或微黄色, 近圆形, 边缘呈波状, 不整齐，中央突起有褶皱，呈火山口状, 不透明, 质地干燥, 无光泽。
将观察到的菌株与枯草芽孢杆菌标准菌对照, 包括形态、生理、生化, 同时根据《伯杰氏细菌鉴定手册》, 该菌株可初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
4、生理生化鉴定
胞内无聚2β2羟基丁酸盐(PHB) 颗粒, 氧化酶、接触酶皆阳性, 不产卵磷脂酶, 产乙酰甲基甲醇(V2P 反应阳性) , 在7 % NaCl 中不生长, 在p H 517 肉汤中生长, 石蕊牛奶产酸, 水解淀粉, 硝酸盐可还原到亚硝酸盐, 能在厌氧培养基中生长, 对葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇均能产酸, 能利用柠檬酸盐而不利用丙酸盐, 明胶不液化, 能产二羟基丙酮。
七、发酵液纤溶酶活性测定
8000r/ min ,离心5min ，取上清液, 测定其纤溶酶活力。 测定纤溶酶活力: 将90mm 纤维蛋白平板37 ℃孵育10min 后均匀打6 个直径2mm 的孔, 分别移入10μL 粗酶液。室温静置10 min ,37 ℃培养18h ,测定透明圈的最大直径以及与之垂直的直径, 并计算直径积。参照尿激酶标准曲线, 将待测菌落透明圈的直径积与标准曲线比较, 查出样品酶活。
尿激酶标准曲线的绘制:取适量尿激酶标准品, 用PBS 制成2 IU/
μL , 4 IU/μL , 6 IU/μL , 8 IU/μL ,10 IU/μL 标准液。分别取10μL 标准酶液, 加入纤维蛋白平板上的孔中。37 ℃培养18h 后测量透明圈的最大直径以及与之垂直的直径, 计算直径乘积; 以直径积为横坐标, 酶活为纵坐标, 在对数坐标纸上制作标准曲线。