实用医技杂志2010年4月第17卷第4期JournalofPracticalMedicalTechniques，April2010，Vol.17，No.4
·307·
冰冻切片免疫荧光中组织固定方法研究
上海中医药大学附属曙光医院（201203）
【摘
陈高峰
要】目的通过对3种不同固定液对肝组织冰冻切片免疫荧光过程中固定情况的比较，探寻保存抗原最
取Wistar大鼠肝脏，OCT包埋后置于冰冻机切片，片厚8～10μm。分别用10%甲醛、丙
佳固定效果的方法。方法
进行免疫荧光染色，经Image-pro图像分析软件及单因素方差分析统计，比较酮和1%多聚甲醛3种固定液固定后，
其染色效果。结果丙酮固定的肝组织的免疫荧光组织结构清晰，核浆对比度好，其Heppar肝细胞抗原的阳性面积为（73.2±1.2）%，与10%甲醛（46.2±1.5）%及1%多聚甲醛（62.2±1.1）%固定的肝组织比较差异有统计学意义。结论在保存肝组织中抗原活性方面，相对于10%甲醛和1%多聚甲醛液，以丙酮固定液固定效果最好。
【关键词】冷冻超薄切片术；荧光免疫测定；组织包埋
ExplorationonmethodoftissuefixationforfrozensectionsstainedwithimmunofluorescenceCHENGao-feng.
ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine.Shanghai201203,China
【Abstract】ObjectiveTocomparetheeffectsofthreedifferentfixativesonfrozensectionsoflivertissuestainedwithimmunofluorescenceinordertofindthebestfixationwaytopreserveantigen.MethodsTheliversofWistarratwereembeddedwithOCTandsectionedinfreezingmicrotome,thethicknessofsectionswere8~10μm.Afterfixedwithwith10%formaldehyde,acetoneand1%paraformaldehyderespectively,thesectionswerestainedwithimmunofluorescence,andimageanalysisweremadebyusingtheImage-proimageanalysissoftware.ResultsThelivertissuefixedwithace-toneshowedclearorganizationalstructureandthenuclearplasmacontrastwasgood,theHepparantigen-positivearea（73.2±1.2）%,whichwashigherthanthatinlivertissuefixedwith10%formaldehyde（46.2±1.5%）and1%paraformal-）%.ConclusionForpurposesofantigenpreservation,thefixedeffectofacetoneisbatterthan10%dehyde（62.2±1.1
formaldehydeandparaformaldehydesolution.
【Keywords】Cryoultramicrotomy；Fluoroimmunoassay；Tissueembedding
在免疫荧光中，组织的固定方法极为重要，关系到染色结果的好坏。本研究比较3种不同的组织固定液，探寻一种能较好保存肝组织抗原的固定液，为医学基础研究提供可靠的实验方法。1
材料与方法
1.1材料：①实验动物：Wistar大鼠，雄性，SPF级，体质量180~10只。由上海中医药大学实验动物中心提供。②仪器：200g，
CM1850冰冻切片机，德国LEICA；OlympusIx70荧光显微镜；Image-proplus6.1图像分析软件。③试剂：肝细胞特殊抗原Heppar单克隆抗体（Dako公司）；Cy3标记单克隆二抗（碧云天生物技术研究所）；甲醛溶液、多聚甲醛、丙酮，分析纯，均购自中国医药集团上海化学试剂公司。
1.2方法：（1）标本采集：Wistar大鼠称重后注射2%戊巴比妥麻醉，剖开腹腔从下腔动脉放血处死，摘取肝脏，标本大小不能超过1.0cm×1.0cm，厚度0.3cm。（2）标本包埋：用一药膜盒滴上OCT包埋剂，将肝组织包埋于内，把药膜盒缓慢浸入液氮内冷冻保存。（3）染色：把OCT包埋的肝组织置于冰冻切片机内，每个标本以8μm的厚度各切3张，分为①、②、③3组。分别用不同的固定液进行固定：①组：切片置于盛有10%甲醛的染色缸内4℃10min。②组：切片置于盛有丙酮的切片置于盛有1%多聚甲醛液的染色缸内4℃10min。③组：
染色缸内4℃10min。固定10min后，用0.01mmol/L磷酸（5min×3次。3次后，封闭：小牛血清封闭，
37℃1h。加一抗：1∶100Heppar抗体50μL，37℃1h，0.01Cy3标记单克隆二抗50mmol/LPBS洗5min×3次。加二抗：
μL，37℃1h，0.01mmol/LPBS洗5min×3次；50%甘油封片；显微镜观察。（4）染色结果观察：在Olymps1×70荧光显微镜下，观察肝组织内Heppar肝细胞抗原的表达情况，并用Image-proplus6.1图像分析软件进行分析。1.3统计学处理
采用SPSS12.0软件包，运用单因素方差分析进行统计。
2结果
2.13种不同固定液染色效果比较：10%甲醛固定：组织结构Heppar表达减少。丙酮固定：组织结构模糊，核浆对比不佳，清晰，核浆对比度好，Heppar表达强。1%多聚甲醛固定：组织结构清晰，核浆对比度好，但Heppar表达有所减少。2.23种固定液Heppar阳性表达半定量分析结果：见表1。
表1Heppar阳性表达半定量分析比较（±s）组别10%甲醛丙酮1%多聚甲醛
片数101010
Heppar阳性表达的面积（%）
46.2±1.5
）
73.2±1.21
62.2±1.1
）3组间两两比较P＜0.05。1
3讨论
作为冰冻切片的固定液，不仅是使细胞内蛋白质凝固，更重要
·308·
实用医技杂志2010年4月第17卷第4期JournalofPracticalMedicalTechniques，April2010，Vol.17，No.4
是能迅速地最大限度地保存细胞和组织的抗原性，所以选择最佳固定液尤为重要。它和免疫荧光染色的好坏有着十分密切的关系[1]。
本实验通过肝组织内Heppar（Heppar，Cy3标记，红色）抗原荧光染色，经过数据统计结果显示丙酮固定液能较好的保存抗原。笔者认为甲醛液虽然它可以较好的保持细胞形态结构，然而随着甲醛交联蛋白质的增加，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变从而降低了抗原敏感性。1%多聚甲醛属甲醛低分子聚合物，它在组织固定过程中使组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键，使
得不少抗原决定簇被封闭。而丙酮为沉淀类固定剂，
对组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定,其保存抗原性更好。总之，做一张好的片子，不仅需要丰富的经验和高超的技术，具体应用哪种固定液需要根据组织的特性和实验条件灵活选择[2]。
参考文献
12
胥维勇,杨红,李科,等.介绍一种FAAPT冷冻切片快速固定液.临床与实验病理学杂志,2002，18（2）：217.
何金鑫,宋芳,崔成立,等.3种固定液对神经纤维冰冻切片固定效果之比较.包头医学院学报,2008，24（3）：236.
（收稿日期：2009-11-10）
·医学检验·
临床尿液分析仪与尿沉渣镜检联合应用
山西省长治市郊区人民医院（046011）
本研究收集了400例尿标本检测事例，旨在说明干化学分析与尿沉渣镜检联合应用的必要性，以求更好地为临床服务。
1材料与方法
1.1材料：桂林市华通医用仪器有限公司产的MA—4280KB型尿液分析仪，配套HT系列—11HK干化学尿液分析试纸条）。XSZ-N107显微镜。胶（室温条件下保存不超过6d的试纸
体金尿隐血试纸条。随机收集的400例患者的尿标本。1.2实验方法：用一次性塑料杯随机收集上述人员的洁净中1管用于常段尿，充分混匀后分3管。1管用于干化学分析，规镜检，1管用于隐血试验，测定结果见表1。
干化学分析仪按仪器操作说明对每份混匀的标本进行测定（每天开机时均用校正带仪器进行监控，试纸室温下保存不超过6d）记录试验结果。
表1干化学法与常规镜检法检查尿液结果比较项目潜血白细胞
干化学法阳性20484
阴性196316
常规镜检法阳性160102
阴性240298
鹿晓芳
法完全符合者325例，达81.25%；白细胞干化学法与常规镜检完全符合者360例，达90%，对36例潜血干化学阳性而镜15例检阴性的标本，经胶体金隐血试纸测定21例隐血阳性，加热后重新测定为假阳性。3讨
论
3.1关于潜血：干化学测定潜血既可测定完整的红细胞，又可测定游离的血红蛋白，同时具有过氧化物酸作用的其他物质也可干扰测定而产生假阳性，故应辅以镜检提高结果的准确性，400例尿标本中，干化学法潜血测定204例阳性，而镜检160例阳性，对于不相符的标本，经胶体金隐血试验发现57.7%的标本隐血呈阳性，42.3%为假阳性，因此，对于干化学呈阳性的标本不但要联合镜检，而且镜检阴性的标本还有必要进行免疫法隐血测定，切不可盲目认定有或无红细胞。3.2关于白细胞：所测定的400例尿标本，18例干化学法假阳性，同时发现女性患者白带多。冬季盐类结晶析出也可造成假阳性，因而联合测定可确定白细胞来源，确保检验结果的可靠性。3.3
尿沉渣镜检：对肾脏疾病的检测具有重要意义，是诊断泌尿系疾病不可缺少的手段，虽方便但难以标准化，与干化学法联合应用较好地解决了尿常规检验中存在的不足，更具准可靠、全面、可比性强等特点，所以干化学分析与尿沉渣镜确、
检联合应用很有必要。
（收稿日期：2009-11-28）
镜检：取混匀尿液标本，用一次性滴管滴到载玻片上在高倍镜下计数。2结
果
在所检测的400例尿标本中，潜血干化学法与常规镜检
实用医技杂志2010年4月第17卷第4期JournalofPracticalMedicalTechniques，April2010，Vol.17，No.4
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冰冻切片免疫荧光中组织固定方法研究
上海中医药大学附属曙光医院（201203）
【摘
陈高峰
要】目的通过对3种不同固定液对肝组织冰冻切片免疫荧光过程中固定情况的比较，探寻保存抗原最
取Wistar大鼠肝脏，OCT包埋后置于冰冻机切片，片厚8～10μm。分别用10%甲醛、丙
佳固定效果的方法。方法
进行免疫荧光染色，经Image-pro图像分析软件及单因素方差分析统计，比较酮和1%多聚甲醛3种固定液固定后，
其染色效果。结果丙酮固定的肝组织的免疫荧光组织结构清晰，核浆对比度好，其Heppar肝细胞抗原的阳性面积为（73.2±1.2）%，与10%甲醛（46.2±1.5）%及1%多聚甲醛（62.2±1.1）%固定的肝组织比较差异有统计学意义。结论在保存肝组织中抗原活性方面，相对于10%甲醛和1%多聚甲醛液，以丙酮固定液固定效果最好。
【关键词】冷冻超薄切片术；荧光免疫测定；组织包埋
ExplorationonmethodoftissuefixationforfrozensectionsstainedwithimmunofluorescenceCHENGao-feng.
ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine.Shanghai201203,China
【Abstract】ObjectiveTocomparetheeffectsofthreedifferentfixativesonfrozensectionsoflivertissuestainedwithimmunofluorescenceinordertofindthebestfixationwaytopreserveantigen.MethodsTheliversofWistarratwereembeddedwithOCTandsectionedinfreezingmicrotome,thethicknessofsectionswere8~10μm.Afterfixedwithwith10%formaldehyde,acetoneand1%paraformaldehyderespectively,thesectionswerestainedwithimmunofluorescence,andimageanalysisweremadebyusingtheImage-proimageanalysissoftware.ResultsThelivertissuefixedwithace-toneshowedclearorganizationalstructureandthenuclearplasmacontrastwasgood,theHepparantigen-positivearea（73.2±1.2）%,whichwashigherthanthatinlivertissuefixedwith10%formaldehyde（46.2±1.5%）and1%paraformal-）%.ConclusionForpurposesofantigenpreservation,thefixedeffectofacetoneisbatterthan10%dehyde（62.2±1.1
formaldehydeandparaformaldehydesolution.
【Keywords】Cryoultramicrotomy；Fluoroimmunoassay；Tissueembedding
在免疫荧光中，组织的固定方法极为重要，关系到染色结果的好坏。本研究比较3种不同的组织固定液，探寻一种能较好保存肝组织抗原的固定液，为医学基础研究提供可靠的实验方法。1
材料与方法
1.1材料：①实验动物：Wistar大鼠，雄性，SPF级，体质量180~10只。由上海中医药大学实验动物中心提供。②仪器：200g，
CM1850冰冻切片机，德国LEICA；OlympusIx70荧光显微镜；Image-proplus6.1图像分析软件。③试剂：肝细胞特殊抗原Heppar单克隆抗体（Dako公司）；Cy3标记单克隆二抗（碧云天生物技术研究所）；甲醛溶液、多聚甲醛、丙酮，分析纯，均购自中国医药集团上海化学试剂公司。
1.2方法：（1）标本采集：Wistar大鼠称重后注射2%戊巴比妥麻醉，剖开腹腔从下腔动脉放血处死，摘取肝脏，标本大小不能超过1.0cm×1.0cm，厚度0.3cm。（2）标本包埋：用一药膜盒滴上OCT包埋剂，将肝组织包埋于内，把药膜盒缓慢浸入液氮内冷冻保存。（3）染色：把OCT包埋的肝组织置于冰冻切片机内，每个标本以8μm的厚度各切3张，分为①、②、③3组。分别用不同的固定液进行固定：①组：切片置于盛有10%甲醛的染色缸内4℃10min。②组：切片置于盛有丙酮的切片置于盛有1%多聚甲醛液的染色缸内4℃10min。③组：
染色缸内4℃10min。固定10min后，用0.01mmol/L磷酸（5min×3次。3次后，封闭：小牛血清封闭，
37℃1h。加一抗：1∶100Heppar抗体50μL，37℃1h，0.01Cy3标记单克隆二抗50mmol/LPBS洗5min×3次。加二抗：
μL，37℃1h，0.01mmol/LPBS洗5min×3次；50%甘油封片；显微镜观察。（4）染色结果观察：在Olymps1×70荧光显微镜下，观察肝组织内Heppar肝细胞抗原的表达情况，并用Image-proplus6.1图像分析软件进行分析。1.3统计学处理
采用SPSS12.0软件包，运用单因素方差分析进行统计。
2结果
2.13种不同固定液染色效果比较：10%甲醛固定：组织结构Heppar表达减少。丙酮固定：组织结构模糊，核浆对比不佳，清晰，核浆对比度好，Heppar表达强。1%多聚甲醛固定：组织结构清晰，核浆对比度好，但Heppar表达有所减少。2.23种固定液Heppar阳性表达半定量分析结果：见表1。
表1Heppar阳性表达半定量分析比较（±s）组别10%甲醛丙酮1%多聚甲醛
片数101010
Heppar阳性表达的面积（%）
46.2±1.5
）
73.2±1.21
62.2±1.1
）3组间两两比较P＜0.05。1
3讨论
作为冰冻切片的固定液，不仅是使细胞内蛋白质凝固，更重要
·308·
实用医技杂志2010年4月第17卷第4期JournalofPracticalMedicalTechniques，April2010，Vol.17，No.4
是能迅速地最大限度地保存细胞和组织的抗原性，所以选择最佳固定液尤为重要。它和免疫荧光染色的好坏有着十分密切的关系[1]。
本实验通过肝组织内Heppar（Heppar，Cy3标记，红色）抗原荧光染色，经过数据统计结果显示丙酮固定液能较好的保存抗原。笔者认为甲醛液虽然它可以较好的保持细胞形态结构，然而随着甲醛交联蛋白质的增加，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变从而降低了抗原敏感性。1%多聚甲醛属甲醛低分子聚合物，它在组织固定过程中使组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键，使
得不少抗原决定簇被封闭。而丙酮为沉淀类固定剂，
对组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定,其保存抗原性更好。总之，做一张好的片子，不仅需要丰富的经验和高超的技术，具体应用哪种固定液需要根据组织的特性和实验条件灵活选择[2]。
参考文献
12
胥维勇,杨红,李科,等.介绍一种FAAPT冷冻切片快速固定液.临床与实验病理学杂志,2002，18（2）：217.
何金鑫,宋芳,崔成立,等.3种固定液对神经纤维冰冻切片固定效果之比较.包头医学院学报,2008，24（3）：236.
（收稿日期：2009-11-10）
·医学检验·
临床尿液分析仪与尿沉渣镜检联合应用
山西省长治市郊区人民医院（046011）
本研究收集了400例尿标本检测事例，旨在说明干化学分析与尿沉渣镜检联合应用的必要性，以求更好地为临床服务。
1材料与方法
1.1材料：桂林市华通医用仪器有限公司产的MA—4280KB型尿液分析仪，配套HT系列—11HK干化学尿液分析试纸条）。XSZ-N107显微镜。胶（室温条件下保存不超过6d的试纸
体金尿隐血试纸条。随机收集的400例患者的尿标本。1.2实验方法：用一次性塑料杯随机收集上述人员的洁净中1管用于常段尿，充分混匀后分3管。1管用于干化学分析，规镜检，1管用于隐血试验，测定结果见表1。
干化学分析仪按仪器操作说明对每份混匀的标本进行测定（每天开机时均用校正带仪器进行监控，试纸室温下保存不超过6d）记录试验结果。
表1干化学法与常规镜检法检查尿液结果比较项目潜血白细胞
干化学法阳性20484
阴性196316
常规镜检法阳性160102
阴性240298
鹿晓芳
法完全符合者325例，达81.25%；白细胞干化学法与常规镜检完全符合者360例，达90%，对36例潜血干化学阳性而镜15例检阴性的标本，经胶体金隐血试纸测定21例隐血阳性，加热后重新测定为假阳性。3讨
论
3.1关于潜血：干化学测定潜血既可测定完整的红细胞，又可测定游离的血红蛋白，同时具有过氧化物酸作用的其他物质也可干扰测定而产生假阳性，故应辅以镜检提高结果的准确性，400例尿标本中，干化学法潜血测定204例阳性，而镜检160例阳性，对于不相符的标本，经胶体金隐血试验发现57.7%的标本隐血呈阳性，42.3%为假阳性，因此，对于干化学呈阳性的标本不但要联合镜检，而且镜检阴性的标本还有必要进行免疫法隐血测定，切不可盲目认定有或无红细胞。3.2关于白细胞：所测定的400例尿标本，18例干化学法假阳性，同时发现女性患者白带多。冬季盐类结晶析出也可造成假阳性，因而联合测定可确定白细胞来源，确保检验结果的可靠性。3.3
尿沉渣镜检：对肾脏疾病的检测具有重要意义，是诊断泌尿系疾病不可缺少的手段，虽方便但难以标准化，与干化学法联合应用较好地解决了尿常规检验中存在的不足，更具准可靠、全面、可比性强等特点，所以干化学分析与尿沉渣镜确、
检联合应用很有必要。
（收稿日期：2009-11-28）
镜检：取混匀尿液标本，用一次性滴管滴到载玻片上在高倍镜下计数。2结
果
在所检测的400例尿标本中，潜血干化学法与常规镜检