分 析 化 学 实 验 报 告
实 验 专 班 姓 指 导日 名 称：反相高效液相色谱法测定雪碧中的苯甲酸 业： 级： 名：教 师： 期：
11化学班 郭老师 2013.9.7
一、实验目的
1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定苯甲酸的基本原理。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 一、 实验原理
苯甲酸为具有苯或甲醛的气味的鳞片状或针状结晶，具有苯或甲醛的臭味。熔点
122.13℃，沸点249℃，相对密度1.2659（15/4℃）。在100℃时迅速升华，它的蒸气有很强的刺激性，吸入后易引起咳嗽。微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。苯甲酸是弱酸，比脂肪酸强。苯甲酸是重要的酸型食品防腐剂。在酸性条件下，对霉菌、酵母和细菌均有抑制作用，但对产酸菌作用较弱。抑菌的最适pH 值为2.5～4.0，一般以低于pH 值4.5～5.0
为宜。在食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁，最大使用量不得超过2.0g/kg；在果酱(不包括罐头) 、果汁(味) 型饮料、酱油、食醋中最大使用量1.0g/kg；在软糖、葡萄酒、果酒中最大使用量0.8g/kg；在低盐酱菜、酱类、蜜饯，最大使用量0.5g/kg；在碳酸饮料中最大使用量0.2g/kg。
用高效液相色谱法将饮料中的苯甲酸与其它组分（如：柠檬酸（钠）、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的苯甲酸标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的苯甲酸含量。
三、仪器和试剂
1、Agilent 1220高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5µ 150×4.6mm 。
3、流动相：75%甲醇（色谱纯）+25%PH=3.3的磷酸缓冲溶液（过三次）。
4、苯甲酸标准贮备溶液：准确称取0.0109g 含量99.5%苯甲酸，用过三次的蒸馏水溶解，定量至50mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度217μg·mL-1。
4、测饮料试液：雪碧 四、实验内容
1、 将标准贮备液分别稀释为0.434、0.868、2.17、4.34、8.68、21.7、43.4μg·mL-1的标准系列溶液，并贴上标签。（稀释为50mL ） 2、 谱仪器条件：
泵的流速：1.0mL/min；检测波长：254nm ；进样量：20μL ；柱温：室温。 3、 仪器基线稳定后，进苯甲酸标准样，浓度由低到高。
4、 品处理如下：（1）将约100mL 雪碧置于一100mL 洁净、干燥的烧杯中，用超声波脱气10min ，以赶尽雪碧中二氧化碳。取5mL 雪碧样品转移至50mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。
5、 将雪碧样品注入2mL 样品瓶中备用。
6、 “Agilent 1220高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。 五、结果处理
1、C=43.4时的谱图为下图1：
图1 2、样品谱图为下图2：
图2
五、计算苯甲酸的含量
由标准曲线可得：C=（A-223503）/164090 A为样品峰面积；A=3788329 算得C=21.725ug/mL
1mL雪碧里含苯甲酸的量为：21.725ug/mL*50mL/5mL=217.25ug/mL=217.25ug/mL
500mL雪碧里含苯甲酸的量为：217.25ug/mL*500mL=108625ug=0.107g 所以苯甲酸含量为0.107g/500mL=0.107g/500g=0.214g/kg
注意：
1、若出峰时间短，则应适当调整水与缓冲溶液（水）的比例，缓冲溶液（水）的比例上升出峰时间忘后推。 2、出峰不好：（1）改变波长；（2）可能是冲柱时没冲干净，重新冲柱 3、峰太高可能是因为浓度太大，适当稀释。
分 析 化 学 实 验 报 告
实 验 专 班 姓 指 导日 名 称：反相高效液相色谱法测定雪碧中的苯甲酸 业： 级： 名：教 师： 期：
11化学班 郭老师 2013.9.7
一、实验目的
1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定苯甲酸的基本原理。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 一、 实验原理
苯甲酸为具有苯或甲醛的气味的鳞片状或针状结晶，具有苯或甲醛的臭味。熔点
122.13℃，沸点249℃，相对密度1.2659（15/4℃）。在100℃时迅速升华，它的蒸气有很强的刺激性，吸入后易引起咳嗽。微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。苯甲酸是弱酸，比脂肪酸强。苯甲酸是重要的酸型食品防腐剂。在酸性条件下，对霉菌、酵母和细菌均有抑制作用，但对产酸菌作用较弱。抑菌的最适pH 值为2.5～4.0，一般以低于pH 值4.5～5.0
为宜。在食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁，最大使用量不得超过2.0g/kg；在果酱(不包括罐头) 、果汁(味) 型饮料、酱油、食醋中最大使用量1.0g/kg；在软糖、葡萄酒、果酒中最大使用量0.8g/kg；在低盐酱菜、酱类、蜜饯，最大使用量0.5g/kg；在碳酸饮料中最大使用量0.2g/kg。
用高效液相色谱法将饮料中的苯甲酸与其它组分（如：柠檬酸（钠）、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的苯甲酸标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的苯甲酸含量。
三、仪器和试剂
1、Agilent 1220高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5µ 150×4.6mm 。
3、流动相：75%甲醇（色谱纯）+25%PH=3.3的磷酸缓冲溶液（过三次）。
4、苯甲酸标准贮备溶液：准确称取0.0109g 含量99.5%苯甲酸，用过三次的蒸馏水溶解，定量至50mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度217μg·mL-1。
4、测饮料试液：雪碧 四、实验内容
1、 将标准贮备液分别稀释为0.434、0.868、2.17、4.34、8.68、21.7、43.4μg·mL-1的标准系列溶液，并贴上标签。（稀释为50mL ） 2、 谱仪器条件：
泵的流速：1.0mL/min；检测波长：254nm ；进样量：20μL ；柱温：室温。 3、 仪器基线稳定后，进苯甲酸标准样，浓度由低到高。
4、 品处理如下：（1）将约100mL 雪碧置于一100mL 洁净、干燥的烧杯中，用超声波脱气10min ，以赶尽雪碧中二氧化碳。取5mL 雪碧样品转移至50mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。
5、 将雪碧样品注入2mL 样品瓶中备用。
6、 “Agilent 1220高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。 五、结果处理
1、C=43.4时的谱图为下图1：
图1 2、样品谱图为下图2：
图2
五、计算苯甲酸的含量
由标准曲线可得：C=（A-223503）/164090 A为样品峰面积；A=3788329 算得C=21.725ug/mL
1mL雪碧里含苯甲酸的量为：21.725ug/mL*50mL/5mL=217.25ug/mL=217.25ug/mL
500mL雪碧里含苯甲酸的量为：217.25ug/mL*500mL=108625ug=0.107g 所以苯甲酸含量为0.107g/500mL=0.107g/500g=0.214g/kg
注意：
1、若出峰时间短，则应适当调整水与缓冲溶液（水）的比例，缓冲溶液（水）的比例上升出峰时间忘后推。 2、出峰不好：（1）改变波长；（2）可能是冲柱时没冲干净，重新冲柱 3、峰太高可能是因为浓度太大，适当稀释。