一. 重组质粒的构建 T 质粒载体
重组的DNA 分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2 、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA 分子进行连接。
DNA 连接酶有两种：T4噬菌体DNA 连接酶和大肠杆菌DNA 连接酶。两种DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA 分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA 连接酶还有一种大肠杆菌DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA 上，使DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA 聚合酶在进行PCR 扩增时会在PCR 产物双链DNA 每条链的3’端加上一个突出的碱基A 。pUCm-T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T 。这样，pUCm-T 载体的两端就可以和PCR 产物的两端进行正确的AT 配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR 产物连接到pUCm-T 载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
二. 感受态制备原理
细菌在0°C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易
吸收外源DNA 的感受态。
三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法
LacZ 基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal 为底物进行染色时，呈蓝色。
现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N 端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS ）, 它并不影响lacZ 的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C 端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG 的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N 端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C 端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
Amp （100mg/ml）：溶解0.1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml ，用0.22μm 滤膜过滤除菌.
实验过程 （一）. 目的基因片段与载体连接
器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。
试剂
T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 。 操作步骤
PCR 产物与T 载体直接连接：
（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C 。
（2） 取4个灭菌的200ul 微量离心管，加入：（需要调整） 4ml 目的基因 ；1ml T载体 ；0.5ml T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 连接酶缓冲液10 x buffer ；3.5 ml dd Water ，总量10ml 体系。
（3） 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C 干式恒温仪（或14°C 水中）中保温过夜（12-16h ）。
（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C 冰箱备用。
（二）. 大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化
仪器：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，
1.5ml 微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp ），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器
试剂： E. coli 菌种，LB 培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water ，LB 培养基（不加抗菌素），LB 培养基（加抗菌素），无菌dd water ，IPTG ，X-gal 。
步骤（1） 在超净工作台中，将1ml 大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基（不含抗菌素），37℃摇床培养过夜。
（2） 取0.5ml 上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下
250r/min摇床培养2~3h，测定OD590为0.35~0.4左右（
（3） 将1ml 菌液加入到4支1.5mL 预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min ，然后于4℃，5000rpm 离心5min 。
（4） 将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min 。
（5） 4℃，5000rpm 离心5min ，弃上清液后，用100μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h ，可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。
（6） 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（7） 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μL ）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（8） 加入5μL 连接好的质粒混合液（DNA 含量不超过100ng ），轻轻震荡后放置冰上20min 。
（9） 轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s 进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min 。
（10） 在超净工作台中向上述各管中分别加入300μL LB 培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h 。
（11） 在超净工作台中取上述转化混合液200μL ，分别滴到含合适抗菌素（Amp 100ug/L）的固体LB 平板培养皿中，再在平板上滴加40μL 20mg/ml X-gal，7μL 200mg/ml IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。）。
（12） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
（13） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。
（14） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
（三）. 转化克隆的筛选和鉴定
器材 旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。
试剂LB 培养基（加抗菌素），PCR 用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0）。
操作步骤 方法一：快速PCR 筛选法
（1） 在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl 反应体系。
dd water 16μl
10×PCR buffer（不含MgCl2）2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl （每种dNTP 终浓度0.2mM ）
10μmol/L Primer1 1μl （12.5—25pmoles ）
10μmol/L primer2 1μl （12.5—25pmoles ）
模板质粒 用小tip 头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR 混合液中洗一洗 Taq 酶 0.5μl （1.5u ）
总体积 25μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR 仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ ）： ① 94℃5min ②94℃1min ③60℃1min ④72℃1min50s ⑤goto ②29 times ⑥72℃10min
（2） PCR结束后，取10μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比对）。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（3） 按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒
（4） 提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，以进一步确认。
方法二：提质粒再PCR 或酶切鉴定
（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。
（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基 上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB （含50mg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。
（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。
（4）提取到的3管质粒样品可用PCR 法扩增，或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断（方法见有关实验）。
（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL 菌液与500mL 65%甘油混合后-80℃保存。
（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面
一. 重组质粒的构建 T 质粒载体
重组的DNA 分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2 、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA 分子进行连接。
DNA 连接酶有两种：T4噬菌体DNA 连接酶和大肠杆菌DNA 连接酶。两种DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA 分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA 连接酶还有一种大肠杆菌DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA 上，使DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA 聚合酶在进行PCR 扩增时会在PCR 产物双链DNA 每条链的3’端加上一个突出的碱基A 。pUCm-T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T 。这样，pUCm-T 载体的两端就可以和PCR 产物的两端进行正确的AT 配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR 产物连接到pUCm-T 载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
二. 感受态制备原理
细菌在0°C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易
吸收外源DNA 的感受态。
三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法
LacZ 基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal 为底物进行染色时，呈蓝色。
现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N 端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS ）, 它并不影响lacZ 的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C 端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG 的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N 端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C 端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
Amp （100mg/ml）：溶解0.1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml ，用0.22μm 滤膜过滤除菌.
实验过程 （一）. 目的基因片段与载体连接
器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。
试剂
T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 。 操作步骤
PCR 产物与T 载体直接连接：
（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C 。
（2） 取4个灭菌的200ul 微量离心管，加入：（需要调整） 4ml 目的基因 ；1ml T载体 ；0.5ml T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 连接酶缓冲液10 x buffer ；3.5 ml dd Water ，总量10ml 体系。
（3） 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C 干式恒温仪（或14°C 水中）中保温过夜（12-16h ）。
（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C 冰箱备用。
（二）. 大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化
仪器：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，
1.5ml 微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp ），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器
试剂： E. coli 菌种，LB 培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water ，LB 培养基（不加抗菌素），LB 培养基（加抗菌素），无菌dd water ，IPTG ，X-gal 。
步骤（1） 在超净工作台中，将1ml 大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基（不含抗菌素），37℃摇床培养过夜。
（2） 取0.5ml 上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下
250r/min摇床培养2~3h，测定OD590为0.35~0.4左右（
（3） 将1ml 菌液加入到4支1.5mL 预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min ，然后于4℃，5000rpm 离心5min 。
（4） 将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min 。
（5） 4℃，5000rpm 离心5min ，弃上清液后，用100μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h ，可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。
（6） 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（7） 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μL ）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（8） 加入5μL 连接好的质粒混合液（DNA 含量不超过100ng ），轻轻震荡后放置冰上20min 。
（9） 轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s 进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min 。
（10） 在超净工作台中向上述各管中分别加入300μL LB 培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h 。
（11） 在超净工作台中取上述转化混合液200μL ，分别滴到含合适抗菌素（Amp 100ug/L）的固体LB 平板培养皿中，再在平板上滴加40μL 20mg/ml X-gal，7μL 200mg/ml IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。）。
（12） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
（13） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。
（14） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
（三）. 转化克隆的筛选和鉴定
器材 旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。
试剂LB 培养基（加抗菌素），PCR 用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0）。
操作步骤 方法一：快速PCR 筛选法
（1） 在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl 反应体系。
dd water 16μl
10×PCR buffer（不含MgCl2）2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl （每种dNTP 终浓度0.2mM ）
10μmol/L Primer1 1μl （12.5—25pmoles ）
10μmol/L primer2 1μl （12.5—25pmoles ）
模板质粒 用小tip 头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR 混合液中洗一洗 Taq 酶 0.5μl （1.5u ）
总体积 25μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR 仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ ）： ① 94℃5min ②94℃1min ③60℃1min ④72℃1min50s ⑤goto ②29 times ⑥72℃10min
（2） PCR结束后，取10μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比对）。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（3） 按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒
（4） 提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，以进一步确认。
方法二：提质粒再PCR 或酶切鉴定
（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。
（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基 上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB （含50mg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。
（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。
（4）提取到的3管质粒样品可用PCR 法扩增，或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断（方法见有关实验）。
（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL 菌液与500mL 65%甘油混合后-80℃保存。
（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面