31(3):277～282,2005浙江大学学报(农业与生命科学版)
JournalofZhejiangUniversity(Agric1&LifeSci1)
文章编号:100829209(2005)0320277206
百山祖冷杉的ISSR分析优化和遗传多样性初步研究
哀建国1,2,邱英雄1,余久华3,陈小荣3,丁炳扬4
(11浙江大学生命科学学院,浙江杭州310029;21浙江林学院生命科学学院,浙江临安311300;31百山祖自然保护区,浙江庆元323800;41温州师范学院生命与环境科学学院,浙江温州325027)
摘 要:以百山祖冷杉DNA为材料,分析了DNA浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶的含量以及退火温度对ISSR2PCR扩增结果的影响,经过优化实验建立了百山祖冷杉ISSR2PCR最佳反应体系.25μL的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:约40ng模板DNA,112UTaq酶,014μmol/L引物,115
mmol/LMgCl2,012mmol/LdNTPs,2%去离子甲酰胺.利用优化反应体系从100个ISSR引物中,筛选
出了13个稳定性高、重复性好的引物,对40个百山祖冷杉个体材料的DNA进行正式扩增,共扩增得到
91条带,其中39条为多态性条带,多态位点百分率(PPB)为42186%.百山祖冷杉的3个群体遗传多样
性比较分析表明,人工辅助授粉产生的实生苗群体(PPB=37136%)遗传多样性明显高于老树群体
(PPB=16148%)和嫁接苗群体(PPB=20188%),这说明了人工辅助授粉繁育措施能有效提高百山祖
冷杉的遗传变异水平.
关 键 词:ISSR;优化;遗传变异;百山祖冷杉中图分类号:Q16 文献标识码:A
AIJian2guo1,2,QIUYing2xiong1,YUJiu2hua3,CHENXiao2rong3,DINGBing2yang4(11CollegeofLifeSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China;21LifeScienceCollege,ZhejiangForestryUniversity,Lin′an,Zhejiang311300,China;31BaishanzuNatureReserve,Qingyuan,Zhejiang323800,China;41SchoolofLifeandEnvironmentalScience,WenzhouNormalCollege,Wenzhou,Zhejiang325027,China)
Optimizationofintersimplesequencerepeats(ISSR)analysisasappliedtopreliminarystudyofgeneticvariationinAbiesbeshanzuensisM.H.Wu.JournalofZhejiangUniversity(Agric1&LifeSci1),2005,31(3):2772282
Abstract:FactorswhichaffecttheISSRanalysisofAbiesbeshanzuensis,suchasannealingtemperatureandconcentrationsoftemplateDNA,TaqDNApolymerase,Mg2+anddNTP,etc.wereexamined.TheoptimalISSR2PCRreactionsystem(25μL)inourexperimentswasasthefollowing:1×Taqbuffer,40ngtemplateDNA,112UTaqDNApolymerase,014μmol/Lprimer,210mmol/LMgCl2,012mmol/LdNTPsand2%formamide.Ofthe100primerssubjectedtoscreening,13producedhighlyreproducibleandpolymorphicbands.Usingtheseprimers,91discernibleDNAfragmentsweregeneratedwith39(42186%)beingpolymorphicbands,indicatingtheexistenceoflowgeneticvariationinthespecies.Thelevelofgeneticvariationinpopulationoriginatedfromseedlings(PPB=37136%)washigherthanthatinpopulationofoldtrees(PPB=16148%)andpopulationofgraft2originated(PPB=20188%),which 收稿日期:2004208223
基金项目:浙江省生态环境保护专项基金资助项目(浙财建字[2003]17号).
),男,浙江海宁人,讲师,从事保护生物学研究.Tel:[1**********]63;E2mail:aijianguo@yahoo.作者简介:哀建国(1968—
com.cn.
通讯作者:丁炳扬,男,教授,从事植物系统学和保护生物学研究.Tel:[1**********]02;E2mail:[email protected].
278
浙江大学学报(农业与生命科学版)
第31卷
suggestedthatcross2pollinationbyhumanbeingswashelpfultoincreasinggeneticdiversityofA.beshanzuensis.
Keywords:ISSR;optimization;geneticvariation;Abiesbeshanzuensis
百山祖冷杉(AbiesbeshanzuensisM.H.Wu)为松科(Pinaceae)的常绿乔木,是中生代孑遗植物,野生仅存3株,均生长在百山祖国家级自然保护区海拔1700m的庆元百山祖顶峰西南坡[1].百山祖冷杉的雌球花和雄球花的花期不一,而且花期正逢雨季,不容易受粉,所以很难见到实生种子.为了保护百山祖冷杉的遗传资源,上个世纪90年代初科技人员利用人工辅助授粉技术成功地繁育了一批实生苗,并用日本冷杉作为砧木嫁接繁育了一些个体.为了了解人工辅助授粉和嫁接措施是否有效地提高百山祖冷杉群体遗传资源,有必要对百山祖冷杉的遗传多样性进行研究.
ISSR分析技术是Zietkewicz等[2]提出的锚定SSR的新策略,ISSR标记技术具有操作简单、成本低、快速、灵敏、检测多态性能力强、所需DNA模板量少等优点,其产物的多态性比RAPD丰富,而且比RAPD技术更为稳定可靠,
百山祖冷杉3个群体植株(老树3株、嫁接树
16株、幼树21株)的嫩叶,置变色硅胶中干燥保存.
112 DNA提取
取011g干燥叶片,用Fastprep(Bio101,USA)粉碎,采用改良CTAB法[6]提取总DNA,110%琼脂糖电泳检测DNA质量,根据
紫外吸收法估计DNA的浓度和纯度.113 PCR反应及其电泳
PCR反应在GeneAmpPCRSystem9700PCR仪(Perkin2Elmer,USA)上进行.ISSR2PCR反应程序:94℃预变性5min,94℃变性1min,52～55℃复性45s,72℃延伸2min,45个
循环;循环结束后72℃延伸5min.PCR产物在含有EB的115%琼脂糖凝胶中电泳,以100bpMarker(GeneRuler100ladder,FermentasUAB,Inc1)作为标准分子量对照,EPSON(Japan)紫外自动成像仪照相.参照Ge&Sun[4]的ISSR2PCR反应体系中各成份的含量,对可能影响扩
重复性更好[3].如今已成功地运用于居群生物学[4]和品种鉴定研究[5].运用ISSR标记技术时,不同的反应体系可产生不同的结果,而且各引物并不适合于所有物种,因此为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性,进行ISSR2PCR反应体系的优化和引物筛选是非常必要的.
本研究以百山祖冷杉的DNA为模板,分析了ISSR反应体系中模板DNA浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶含量和退火温度
增条带清晰度和多态性的因子:如DNA模板的含量、Mg2+浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚
合酶(上海申能博彩生物科技有限公司产品)含量、退火温度等进行交叉实验.据此筛选出百山祖冷杉ISSR2PCR反应的优化体系.
2 结果与分析
211 DNA模板浓度优化
DNA模板的含量是制约扩增产物得率及
对PCR结果的影响,建立了适合于百山祖冷杉的ISSR反应最佳体系,据此作了引物筛选,并初
步分析了濒危植物百山祖冷杉3个群体的遗传多样性水平.以期为百山祖冷杉的保护遗传学研究和和分子系统学研究奠定基础.
特异性的一个重要因子,模板含量过低,分子碰撞的机率低,偶然性大,扩增产物无或不稳定;模板含量过高,又会相应增加非特异性产物的扩增[7].本实验在25μL反应体系中DNA模板设置了5、10、20、30、40、50、60、70、80、100ng含量10个梯度,参照Ge&Sun[4]的ISSR2PCR反应体系,用3个引物(UBC825、UBC848、UBC868)进行扩增实验,结果见表1.
1 材料与方法
111 植物材料
在浙江省庆元县百山祖自然保护区采集
第3期哀建国,等:百山祖冷杉的ISSR分析优化和遗传多样性初步研究
279
表1 模板含量对PCR结果的影响
Table1 EffectoftemplatecontentonPCRresults
引物
5
UBC825UBC848UBC868
+/-+/-+/-10+/-++
20+++++
30++++++
模板含量/(ng!25μL-1)
40++++++
50++++++
60+++++
70++++
80+++
100+++
注:+表示有扩增产物,++表示扩增效率高,+/-表示扩增产物不稳定,-表示无扩增产物.
实验发现,百山祖冷杉ISSR反应对DNA模板含量的许可范围较大,25μL反应体系中20～60ng的模板含量均能扩增出基本相同的
L8个梯度的Mg2+浓度,实验结果见图1和
表2.
表2 Mg2+浓度对PCR结果的影响
Table2 EffectofMg2+concentrationonPCRresults
Mg2+/(mmol!L-1)
110
UBC825UBC848UBC868
--+
115++/-+
210++++++
215++++++
310+/-++++
315+/-+++
410+/-++
415+/-++
带型,扩增效率高.当模板含量低于20ng时,扩增效率相对较低,信号不强.当模板含量高于60ng时,扩增效率较高,但背景模糊.40ng的DNA模板含量扩增出的条带多,信号强,背景
引物
也最为清晰
.212 Mg浓度
Mg2+浓度是影响PCR结果的重要变量之
2+
注:+表示有扩增产物,++表示扩增效率高,+/-表示扩增产物不稳定,-表示无扩增产物.
一.TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶,对Mg2+浓度非常敏感.选择合适的Mg2+浓度,
对PCR反应至关重要.引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的影响,特别是其中的Mg2+浓度能影响反应的特异性和扩增片段的产率.在一般的PCR反应中,115～210mmol/LMg2+是比较合适的[7].我们设计
了110、115、210、215、310、315、410、415mmol/
不同的引物,不同的物种,对反应体系中
Mg2+浓度要求皆有可能不同.本实验发现210～310mmol/L的Mg2+浓度都扩增出了清晰的带,但215和310mmol/L条件下扩增带的产率不及210mmol/L,而310mmol/L清晰度不及215mmol/L.低于210mmol/L扩增带不稳定,高于310mmol/L扩增产率低、背景模糊.213 dNTP浓度、Taq酶含量及去离子甲酰胺
底物dNTP浓度过高,会导致聚合酶错误掺入,浓度过低,又会影响合成效率,甚至会因dNTP过早消耗而使产物单链化,影响扩增效果.在PCR反应中,dNTP浓度一般在0102～012mmol/L[7].实验设计了011、0115、012、0125、013mmol/L5个梯度的dNTP浓度,扩
泳道1～8(UBC848),Mg
2+
浓度分别为415、410、315、
310、215、210、115、110mmol/L;泳道9～16(UBC825),Mg2+
浓度分别为415、410、315、310、215、210、115、110mmol/L;M,
100bpDNA标准分子量.
图1 Mg2+浓度对ISSR反应的影响(UBC848,
UBC825)
Fig.1 EffectsofMg2+concentrationonISSRreaction
(UBC848,UBC825)
增的结果见图2.011～013mmol/L的dNTP浓度范围内均有扩增产物,011、0115mmol/L扩增产率低,信号弱.012mmol/L时,扩增产率最高,且稳定.而0125和013mmol/L的dNTP浓度则非特异性扩增增强. 在PCR反应中,Taq酶的使用量也是影响实验的一个重要因素.使用高浓度的Taq酶不仅成本过高,而且容易产生非特异性扩增产物;
280
浙江大学学报(农业与生命科学版
)
第31卷
程度增高,但扩增的条带数目明显减少.214 百山祖冷杉的引物筛选与扩增
泳道1、2、3、4、5(UBC868),dNTPs浓度分别为013、
0125、012、0115、011mmol/L;泳道6、7、8、9、10(UBC848),dNTPs浓度分别为013、0125、012、0115、011mmol/L;泳道11、12、13、14、15(UBC825),dNTPs浓度分别为013、0125、012、0115、011mmol/L1M,100bpDNA标准分子量.
图2 dNTPs浓度对ISSR反应的影响(UBC825,
UBC848,UBC868)
Fig.2 EffectsofdNTPsconcentrationonISSRreaction
UBC825,UBC848,UBC868)
通过以上优化实验,最终确定了百山祖冷杉ISSR2PCR最佳优化反应体系.在25μL反应体系中:DNA模板40ng,Taq酶112U,Mg2+2mmol/L,4种dNTP各012mmol/L,Primer014μmol/L.按此反应体系筛选由上海生工公司合成的100个引物(根据BritishColumbia大学公布的序列设计),经最佳退火温度的调试,可重复性试验,共筛选出13个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSR2PCR正式扩增(表3).13条引物扩增出的条带数目从4至9不等,条带片段大小分布在200～2500bp之间.共扩增产生了91个可统计的条带,其中具有多态性的条带39个,多态性位点百分率(PPB)为42186%,平均每个引物扩增出7100条带.13条
Taq酶浓度过低则会导致产物的合成效率下
降.一般随机扩增反应中,Taq酶的用量在015～5U之间[7].本实验设置了1、112、115、2、3共5个Taq酶含量梯度.结果表明在25μL反应体系中使用1～3UTaq酶含量均有扩增产物出现,115U时开始出现非特异性扩增,112U反应效果最佳
.
ISSR引物中包含有一定长度的重复序列,与它结合的目标序列在DNA复制过程中存在滑动和不均等交换现象,常会导致扩增带背景模糊[8].通常在反应体系中加入2%去离子甲酰胺能使背景颜色减弱,条带清晰[9].如图3所示,加入去离子甲酰胺后,使得扩增条带的清晰
引物对老树群体、嫁接苗群体和人为杂交的实生苗群体扩增的DNA多态性条带分别为15、19和34,多态性条带百分率分别为16148%、20188%和37136%,群体水平的多态性条带百分率为24191%.
表3 对百山祖冷杉3个群体40个个体进行扩增的
ISSRs引物的特点
Table3 AttributesofISSRprimersusedforgeneratingISSR
markersfrom40individualsofA.beshanzuensissampledfromthreepopulations
引物编号及序列
UBC820UBC825UBC826UBC827UBC840UBC841UBC844UBC846UBC847UBC853UBC855UBC868UBC874
(GT)8C(AC)8T(AC)8C(AC)8G(GA)8YT(GA)8YC(CT)8RC(CA)8RT(CA)8RC(TC)8RT(AC)8YT(GAA)5(CCCT)4
Total
统计条带数多态性条带数
[**************]
[**************]
A2不加去离子甲酰胺;B2加去离子甲酰胺.
图3 甲酰胺对ISSR反应的影响(引物UBC843)
Fig.3 EffectsofformamideonISSRreaction(primerUBC843)
注:R=A/T,Y=C/G.
第3期哀建国,等:百山祖冷杉的ISSR分析优化和遗传多样性初步研究
281
3 讨 论
PCR扩增容易受到DNA模板的浓度与纯度、引物与dNTP的浓度、Mg2+的浓度、扩增程序等诸多因子的影响[10],所以需要优化PCR反应的各种条件,以期得到较好的实验结果.对于给定的引物和模板,PCR扩增的条带数在一定程度上可以通过控制反应条件而得到调控.基因组中SSR一般为2～6寡聚核苷酸,用于ISSR的引物常为5′或3′端锚定的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列,重复次数一般为4～8次,使引物的总长度达到20bp左右.5’或3’端用于锚定的碱基数目一般为1～4个,锚定的目的是引起特定位点退火,使引物与相匹配SSR的一端结合,而不是中间,从而对基因组中特定片段进行扩增和检测[10].实验中发现,锚定于3’端2个碱基的引物如:UBC843、UBC844、UBC846、UBC847、UBC848等,能扩增出较多的多态性条带.说明扩增结果与引物序列和加锚位置有密切关系,3’端锚定的2个碱基的二核苷酸引物最为适合于百山祖冷杉的ISSR扩增反应.此外,正如前文所述ISSR引物中包含有一定长度的重复序列,与它结合的目标序列在DNA复制过程中存在滑动和不均等交换现象,所以ISSR在检测DNA遗传变异能力方面比RAPD分析技术更强[9].但ISSR引物的滑动也易引起背景模糊和条带拖尾,本实验表明:在百山祖冷杉ISSR2PCR反应体系中加入2%去离子甲酰胺能够降低模糊的背景,使条带更为清晰.
本实验从群体遗传学角度,对中国特有濒危孑遗植物百山祖冷杉A.beshanzuensis的自然群体和人工群体进行了ISSR2PCR分析,从百山祖冷杉的3个群体遗传多样性水平比较看,人工辅助授粉产生的实生苗群体(PPB=37136%)遗传多样性明显高于自然群体(PPB=16148%)和嫁接苗群体(PPB=20188%),说明人工辅助授粉繁育措施能有效提高百山祖冷杉的遗传变异水平.嫁接苗群体的遗传变异略高于自然群体,可能与嫁接苗群体存在突变有关.与其他裸子植物的ISSR或RAPD数据进行比较,结果表明百山
祖冷杉(A.beshanzuensis)(PPB=24191%)的遗传多样性比银杏[13](Ginkgobiloba)(PPB=52127%)、水杉[14](Metasequoiaglyptostroboides)(PPB=38162%)和银杉[15](Cathayaargyrophylla)(PPB=32%)要低得多.由于百山祖冷杉的自
然群体仅残存3株老树,因此百山祖冷杉较低遗传多样性水平与其遗传基础狭窄有关.
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关于收集与本刊论文相应获奖成果证明材料的通知
(农业与生命科学版)作者:《浙江大学学报》
(农业与生命科学版)改版以来的办刊情况和办刊质量,为了了解和检查《浙江大学学报》
加强本刊与广大作者的沟通和交流,本刊将向广大作者长期收集与本刊论文相应获奖成果证明材料,包括近年来与刊文有关的相应研究项目的获奖情况、转化为生产力(经济效益)的情况、论文获奖情况、被国内外重要检索系统收录情况等信息,并把相关证明材料、获奖证书的复印件一并邮寄反馈给我们.
在此谨向广大一贯来支持本刊工作的作者致以真诚的谢意.
———本刊编辑室
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摘 要:以百山祖冷杉DNA为材料,分析了DNA浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶的含量以及退火温度对ISSR2PCR扩增结果的影响,经过优化实验建立了百山祖冷杉ISSR2PCR最佳反应体系.25μL的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:约40ng模板DNA,112UTaq酶,014μmol/L引物,115
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91条带,其中39条为多态性条带,多态位点百分率(PPB)为42186%.百山祖冷杉的3个群体遗传多样
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冷杉的遗传变异水平.
关 键 词:ISSR;优化;遗传变异;百山祖冷杉中图分类号:Q16 文献标识码:A
AIJian2guo1,2,QIUYing2xiong1,YUJiu2hua3,CHENXiao2rong3,DINGBing2yang4(11CollegeofLifeSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China;21LifeScienceCollege,ZhejiangForestryUniversity,Lin′an,Zhejiang311300,China;31BaishanzuNatureReserve,Qingyuan,Zhejiang323800,China;41SchoolofLifeandEnvironmentalScience,WenzhouNormalCollege,Wenzhou,Zhejiang325027,China)
Optimizationofintersimplesequencerepeats(ISSR)analysisasappliedtopreliminarystudyofgeneticvariationinAbiesbeshanzuensisM.H.Wu.JournalofZhejiangUniversity(Agric1&LifeSci1),2005,31(3):2772282
Abstract:FactorswhichaffecttheISSRanalysisofAbiesbeshanzuensis,suchasannealingtemperatureandconcentrationsoftemplateDNA,TaqDNApolymerase,Mg2+anddNTP,etc.wereexamined.TheoptimalISSR2PCRreactionsystem(25μL)inourexperimentswasasthefollowing:1×Taqbuffer,40ngtemplateDNA,112UTaqDNApolymerase,014μmol/Lprimer,210mmol/LMgCl2,012mmol/LdNTPsand2%formamide.Ofthe100primerssubjectedtoscreening,13producedhighlyreproducibleandpolymorphicbands.Usingtheseprimers,91discernibleDNAfragmentsweregeneratedwith39(42186%)beingpolymorphicbands,indicatingtheexistenceoflowgeneticvariationinthespecies.Thelevelofgeneticvariationinpopulationoriginatedfromseedlings(PPB=37136%)washigherthanthatinpopulationofoldtrees(PPB=16148%)andpopulationofgraft2originated(PPB=20188%),which 收稿日期:2004208223
基金项目:浙江省生态环境保护专项基金资助项目(浙财建字[2003]17号).
),男,浙江海宁人,讲师,从事保护生物学研究.Tel:[1**********]63;E2mail:aijianguo@yahoo.作者简介:哀建国(1968—
com.cn.
通讯作者:丁炳扬,男,教授,从事植物系统学和保护生物学研究.Tel:[1**********]02;E2mail:[email protected].
278
浙江大学学报(农业与生命科学版)
第31卷
suggestedthatcross2pollinationbyhumanbeingswashelpfultoincreasinggeneticdiversityofA.beshanzuensis.
Keywords:ISSR;optimization;geneticvariation;Abiesbeshanzuensis
百山祖冷杉(AbiesbeshanzuensisM.H.Wu)为松科(Pinaceae)的常绿乔木,是中生代孑遗植物,野生仅存3株,均生长在百山祖国家级自然保护区海拔1700m的庆元百山祖顶峰西南坡[1].百山祖冷杉的雌球花和雄球花的花期不一,而且花期正逢雨季,不容易受粉,所以很难见到实生种子.为了保护百山祖冷杉的遗传资源,上个世纪90年代初科技人员利用人工辅助授粉技术成功地繁育了一批实生苗,并用日本冷杉作为砧木嫁接繁育了一些个体.为了了解人工辅助授粉和嫁接措施是否有效地提高百山祖冷杉群体遗传资源,有必要对百山祖冷杉的遗传多样性进行研究.
ISSR分析技术是Zietkewicz等[2]提出的锚定SSR的新策略,ISSR标记技术具有操作简单、成本低、快速、灵敏、检测多态性能力强、所需DNA模板量少等优点,其产物的多态性比RAPD丰富,而且比RAPD技术更为稳定可靠,
百山祖冷杉3个群体植株(老树3株、嫁接树
16株、幼树21株)的嫩叶,置变色硅胶中干燥保存.
112 DNA提取
取011g干燥叶片,用Fastprep(Bio101,USA)粉碎,采用改良CTAB法[6]提取总DNA,110%琼脂糖电泳检测DNA质量,根据
紫外吸收法估计DNA的浓度和纯度.113 PCR反应及其电泳
PCR反应在GeneAmpPCRSystem9700PCR仪(Perkin2Elmer,USA)上进行.ISSR2PCR反应程序:94℃预变性5min,94℃变性1min,52～55℃复性45s,72℃延伸2min,45个
循环;循环结束后72℃延伸5min.PCR产物在含有EB的115%琼脂糖凝胶中电泳,以100bpMarker(GeneRuler100ladder,FermentasUAB,Inc1)作为标准分子量对照,EPSON(Japan)紫外自动成像仪照相.参照Ge&Sun[4]的ISSR2PCR反应体系中各成份的含量,对可能影响扩
重复性更好[3].如今已成功地运用于居群生物学[4]和品种鉴定研究[5].运用ISSR标记技术时,不同的反应体系可产生不同的结果,而且各引物并不适合于所有物种,因此为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性,进行ISSR2PCR反应体系的优化和引物筛选是非常必要的.
本研究以百山祖冷杉的DNA为模板,分析了ISSR反应体系中模板DNA浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶含量和退火温度
增条带清晰度和多态性的因子:如DNA模板的含量、Mg2+浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚
合酶(上海申能博彩生物科技有限公司产品)含量、退火温度等进行交叉实验.据此筛选出百山祖冷杉ISSR2PCR反应的优化体系.
2 结果与分析
211 DNA模板浓度优化
DNA模板的含量是制约扩增产物得率及
对PCR结果的影响,建立了适合于百山祖冷杉的ISSR反应最佳体系,据此作了引物筛选,并初
步分析了濒危植物百山祖冷杉3个群体的遗传多样性水平.以期为百山祖冷杉的保护遗传学研究和和分子系统学研究奠定基础.
特异性的一个重要因子,模板含量过低,分子碰撞的机率低,偶然性大,扩增产物无或不稳定;模板含量过高,又会相应增加非特异性产物的扩增[7].本实验在25μL反应体系中DNA模板设置了5、10、20、30、40、50、60、70、80、100ng含量10个梯度,参照Ge&Sun[4]的ISSR2PCR反应体系,用3个引物(UBC825、UBC848、UBC868)进行扩增实验,结果见表1.
1 材料与方法
111 植物材料
在浙江省庆元县百山祖自然保护区采集
第3期哀建国,等:百山祖冷杉的ISSR分析优化和遗传多样性初步研究
279
表1 模板含量对PCR结果的影响
Table1 EffectoftemplatecontentonPCRresults
引物
5
UBC825UBC848UBC868
+/-+/-+/-10+/-++
20+++++
30++++++
模板含量/(ng!25μL-1)
40++++++
50++++++
60+++++
70++++
80+++
100+++
注:+表示有扩增产物,++表示扩增效率高,+/-表示扩增产物不稳定,-表示无扩增产物.
实验发现,百山祖冷杉ISSR反应对DNA模板含量的许可范围较大,25μL反应体系中20～60ng的模板含量均能扩增出基本相同的
L8个梯度的Mg2+浓度,实验结果见图1和
表2.
表2 Mg2+浓度对PCR结果的影响
Table2 EffectofMg2+concentrationonPCRresults
Mg2+/(mmol!L-1)
110
UBC825UBC848UBC868
--+
115++/-+
210++++++
215++++++
310+/-++++
315+/-+++
410+/-++
415+/-++
带型,扩增效率高.当模板含量低于20ng时,扩增效率相对较低,信号不强.当模板含量高于60ng时,扩增效率较高,但背景模糊.40ng的DNA模板含量扩增出的条带多,信号强,背景
引物
也最为清晰
.212 Mg浓度
Mg2+浓度是影响PCR结果的重要变量之
2+
注:+表示有扩增产物,++表示扩增效率高,+/-表示扩增产物不稳定,-表示无扩增产物.
一.TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶,对Mg2+浓度非常敏感.选择合适的Mg2+浓度,
对PCR反应至关重要.引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的影响,特别是其中的Mg2+浓度能影响反应的特异性和扩增片段的产率.在一般的PCR反应中,115～210mmol/LMg2+是比较合适的[7].我们设计
了110、115、210、215、310、315、410、415mmol/
不同的引物,不同的物种,对反应体系中
Mg2+浓度要求皆有可能不同.本实验发现210～310mmol/L的Mg2+浓度都扩增出了清晰的带,但215和310mmol/L条件下扩增带的产率不及210mmol/L,而310mmol/L清晰度不及215mmol/L.低于210mmol/L扩增带不稳定,高于310mmol/L扩增产率低、背景模糊.213 dNTP浓度、Taq酶含量及去离子甲酰胺
底物dNTP浓度过高,会导致聚合酶错误掺入,浓度过低,又会影响合成效率,甚至会因dNTP过早消耗而使产物单链化,影响扩增效果.在PCR反应中,dNTP浓度一般在0102～012mmol/L[7].实验设计了011、0115、012、0125、013mmol/L5个梯度的dNTP浓度,扩
泳道1～8(UBC848),Mg
2+
浓度分别为415、410、315、
310、215、210、115、110mmol/L;泳道9～16(UBC825),Mg2+
浓度分别为415、410、315、310、215、210、115、110mmol/L;M,
100bpDNA标准分子量.
图1 Mg2+浓度对ISSR反应的影响(UBC848,
UBC825)
Fig.1 EffectsofMg2+concentrationonISSRreaction
(UBC848,UBC825)
增的结果见图2.011～013mmol/L的dNTP浓度范围内均有扩增产物,011、0115mmol/L扩增产率低,信号弱.012mmol/L时,扩增产率最高,且稳定.而0125和013mmol/L的dNTP浓度则非特异性扩增增强. 在PCR反应中,Taq酶的使用量也是影响实验的一个重要因素.使用高浓度的Taq酶不仅成本过高,而且容易产生非特异性扩增产物;
280
浙江大学学报(农业与生命科学版
)
第31卷
程度增高,但扩增的条带数目明显减少.214 百山祖冷杉的引物筛选与扩增
泳道1、2、3、4、5(UBC868),dNTPs浓度分别为013、
0125、012、0115、011mmol/L;泳道6、7、8、9、10(UBC848),dNTPs浓度分别为013、0125、012、0115、011mmol/L;泳道11、12、13、14、15(UBC825),dNTPs浓度分别为013、0125、012、0115、011mmol/L1M,100bpDNA标准分子量.
图2 dNTPs浓度对ISSR反应的影响(UBC825,
UBC848,UBC868)
Fig.2 EffectsofdNTPsconcentrationonISSRreaction
UBC825,UBC848,UBC868)
通过以上优化实验,最终确定了百山祖冷杉ISSR2PCR最佳优化反应体系.在25μL反应体系中:DNA模板40ng,Taq酶112U,Mg2+2mmol/L,4种dNTP各012mmol/L,Primer014μmol/L.按此反应体系筛选由上海生工公司合成的100个引物(根据BritishColumbia大学公布的序列设计),经最佳退火温度的调试,可重复性试验,共筛选出13个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSR2PCR正式扩增(表3).13条引物扩增出的条带数目从4至9不等,条带片段大小分布在200～2500bp之间.共扩增产生了91个可统计的条带,其中具有多态性的条带39个,多态性位点百分率(PPB)为42186%,平均每个引物扩增出7100条带.13条
Taq酶浓度过低则会导致产物的合成效率下
降.一般随机扩增反应中,Taq酶的用量在015～5U之间[7].本实验设置了1、112、115、2、3共5个Taq酶含量梯度.结果表明在25μL反应体系中使用1～3UTaq酶含量均有扩增产物出现,115U时开始出现非特异性扩增,112U反应效果最佳
.
ISSR引物中包含有一定长度的重复序列,与它结合的目标序列在DNA复制过程中存在滑动和不均等交换现象,常会导致扩增带背景模糊[8].通常在反应体系中加入2%去离子甲酰胺能使背景颜色减弱,条带清晰[9].如图3所示,加入去离子甲酰胺后,使得扩增条带的清晰
引物对老树群体、嫁接苗群体和人为杂交的实生苗群体扩增的DNA多态性条带分别为15、19和34,多态性条带百分率分别为16148%、20188%和37136%,群体水平的多态性条带百分率为24191%.
表3 对百山祖冷杉3个群体40个个体进行扩增的
ISSRs引物的特点
Table3 AttributesofISSRprimersusedforgeneratingISSR
markersfrom40individualsofA.beshanzuensissampledfromthreepopulations
引物编号及序列
UBC820UBC825UBC826UBC827UBC840UBC841UBC844UBC846UBC847UBC853UBC855UBC868UBC874
(GT)8C(AC)8T(AC)8C(AC)8G(GA)8YT(GA)8YC(CT)8RC(CA)8RT(CA)8RC(TC)8RT(AC)8YT(GAA)5(CCCT)4
Total
统计条带数多态性条带数
[**************]
[**************]
A2不加去离子甲酰胺;B2加去离子甲酰胺.
图3 甲酰胺对ISSR反应的影响(引物UBC843)
Fig.3 EffectsofformamideonISSRreaction(primerUBC843)
注:R=A/T,Y=C/G.
第3期哀建国,等:百山祖冷杉的ISSR分析优化和遗传多样性初步研究
281
3 讨 论
PCR扩增容易受到DNA模板的浓度与纯度、引物与dNTP的浓度、Mg2+的浓度、扩增程序等诸多因子的影响[10],所以需要优化PCR反应的各种条件,以期得到较好的实验结果.对于给定的引物和模板,PCR扩增的条带数在一定程度上可以通过控制反应条件而得到调控.基因组中SSR一般为2～6寡聚核苷酸,用于ISSR的引物常为5′或3′端锚定的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列,重复次数一般为4～8次,使引物的总长度达到20bp左右.5’或3’端用于锚定的碱基数目一般为1～4个,锚定的目的是引起特定位点退火,使引物与相匹配SSR的一端结合,而不是中间,从而对基因组中特定片段进行扩增和检测[10].实验中发现,锚定于3’端2个碱基的引物如:UBC843、UBC844、UBC846、UBC847、UBC848等,能扩增出较多的多态性条带.说明扩增结果与引物序列和加锚位置有密切关系,3’端锚定的2个碱基的二核苷酸引物最为适合于百山祖冷杉的ISSR扩增反应.此外,正如前文所述ISSR引物中包含有一定长度的重复序列,与它结合的目标序列在DNA复制过程中存在滑动和不均等交换现象,所以ISSR在检测DNA遗传变异能力方面比RAPD分析技术更强[9].但ISSR引物的滑动也易引起背景模糊和条带拖尾,本实验表明:在百山祖冷杉ISSR2PCR反应体系中加入2%去离子甲酰胺能够降低模糊的背景,使条带更为清晰.
本实验从群体遗传学角度,对中国特有濒危孑遗植物百山祖冷杉A.beshanzuensis的自然群体和人工群体进行了ISSR2PCR分析,从百山祖冷杉的3个群体遗传多样性水平比较看,人工辅助授粉产生的实生苗群体(PPB=37136%)遗传多样性明显高于自然群体(PPB=16148%)和嫁接苗群体(PPB=20188%),说明人工辅助授粉繁育措施能有效提高百山祖冷杉的遗传变异水平.嫁接苗群体的遗传变异略高于自然群体,可能与嫁接苗群体存在突变有关.与其他裸子植物的ISSR或RAPD数据进行比较,结果表明百山
祖冷杉(A.beshanzuensis)(PPB=24191%)的遗传多样性比银杏[13](Ginkgobiloba)(PPB=52127%)、水杉[14](Metasequoiaglyptostroboides)(PPB=38162%)和银杉[15](Cathayaargyrophylla)(PPB=32%)要低得多.由于百山祖冷杉的自
然群体仅残存3株老树,因此百山祖冷杉较低遗传多样性水平与其遗传基础狭窄有关.
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