菌种与种子扩大培养
2008-05-11 15:12:43| 分类： 阅读337 评论0 字号：大中小 订阅
1.1 微生物工业用菌种
1.1.1 发酵工业对生产菌种的要求
1) 能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高（目标产物的产量尽可能接近理论转化率）。目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离。
2) 发酵条件粗放、易于控制，且所需的酶活性高。
3) 菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会减少；提高设备的利用率。
4) 根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株（微生物菌种缺少或丧失了合成某种或多种必需生长因子的能力）或调节突变菌株或野生菌株。
5) 抗杂菌、抗噬菌体能力强。
6) 菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品质量的稳定性。菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。
7) 菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素等），以保证安全。使用新菌种时更应注意；应用食品领域更需经严格鉴定，如早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止。
1.1.2 工业上常用的微生物
微生物的共同特性
1) 个体小、构造简单；
2) 容易培养、易于代谢；
3) 生长旺盛、繁殖迅速；
4) 适应性强、容易变异；
5) 分布广泛、种类繁多
工业上常用的微生物
发酵工业上常用的微生物有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌四大类群。要求复习微生物知识，掌握工业上常用微生物的基本形态。此处介绍其中具有工业价值的主要微生物。
细菌
细菌是自然界中分布最广、数量最多、与人类关系最为密切的一类微生物，也是发酵工业上使用最多的一种单细胞生物。细菌的一般结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体及内含物几部分；特殊结构是某些细菌所特有的，如荚膜、鞭毛、芽胞等，它们在细菌的分类鉴定中有重要的意义。
发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌大肠杆菌等。
1) 醋酸杆菌（Acetobacter ）：用于酿醋，把乙醇氧化成乙酸。
2) 假单胞菌（Pseudomonas ）
3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和CO 2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。
4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。
5) 枯草芽孢杆菌：是一类好气性的生芽孢杆菌，可用于生产淀粉酶、蛋白酶、某些氨基酸、肌苷、5’-核苷酸酶等。例如枯草杆菌BF7658是生产淀粉酶的主要菌种，枯草杆菌AS1.398是生产中性蛋白酶的主要菌种。
6) 梭状芽孢杆菌：发酵生产丙酮丁醇。
7) 棒杆菌、短杆菌：北京棒状杆菌AS1.299为谷氨酸的高产菌株。
酵母
酵母菌是工农业生产上极为重要的一类微生物，也使微生物遗传学研究的非常有价值的材料。除了广泛用于面包及酒精制造外，还应用在石油脱蜡、单细胞蛋白制造、酶制剂生产以及糖化饲料、猪血饲料发酵等许多方面。此外，从酵母菌体中还可以提取如核糖核酸、细胞色素C 、凝血质及辅酶A 等医药产品。
能产生子囊孢子并进行芽殖的酵母菌，属于有性繁殖的类型，这是鉴别酵母种属之间差别的一个重要特征。
按照洛德（Lodder ）的分类系统，酵母菌共分39属，372种。发酵工业上常用的酵母菌除了酵母属（Saccharomyces ）外，还有假丝酵母属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属及裂殖酵母属等。
1) 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）：属于酵母属，是酵母菌中最重要、应用最广泛的一类。
2) 异常汉逊氏酵母异常变种：属汉逊氏酵母属。
3) 假丝酵母属
4) 毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属：这两个属的酵母都是产膜酵母，在液体表面形成白色的膜，使液体浑浊，常常是酒类饮料的污染菌，它们在饮料表面形成干而皱的菌蹼，是酒精发酵工业及酿造工业的有害菌。
霉菌
霉菌与人类日常生活密切相关。除了用于传统的酿酒、制酱油外，近代广泛用于发酵工业和酶制剂工业。工业上常用的霉菌，有子囊菌纲的红曲霉、藻状菌纲的毛霉、根霉和犁头霉，以及半知菌纲的曲霉及青霉等
1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机酸。如米曲霉（Asp. oryzae）用于酿酒和L-乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、果胶酶、单宁酶等的黑曲霉(Asp. niger)。
2) 青霉属（Penicillium ）：j 既是使果实腐败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄糖酸的产生菌。
3) 根霉属（Rhizopus ）：用于米酒、黄酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机酸发酵以及甾体转化等许多方面。
4) 毛霉属（Mucor ）：产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族化合物。土曲霉：衣康酸
5) 犁头霉属（Absidia ）
放线菌
放线菌是由不同长短的纤细菌丝所形成的单细胞微生物。放线菌是抗生素的主要产生菌。除抗生素外，放线菌在甾体激素生物合成和酶制剂生产上也有广泛应用。链霉菌属是放线菌研究中最为广泛的一类。放线菌产生的抗生素能抑制其他微生物的生长，这种作用称为拮抗作用。不同抗生素对其他微生物的抑制作用是有选择性的。
噬菌体
噬菌体是寄生在细菌和放线菌细胞内的一类微生物。噬菌体的寄生性均有高度专一性，亦即一种噬菌体只能侵染某一种微生物的某个菌株。当噬菌体钻入寄主细胞后迅速增殖，引起微生物（寄主）细胞的裂解和死亡。
1.1.3 生产用菌种的保藏及选育
1.1.3.1 菌种保藏
在发酵工业中，得到一株高产、优良的菌种是一项艰苦的工作，因此，菌种保藏是微生物工业生产的重要环节。菌种保藏工作的要求在于提高菌种存活率和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。
菌种保藏的基本原理：
根据菌种的生理生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖受到抑制处于休眠状态，同时，使菌株避免污染、死亡、衰退和变异。保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽胞等）；其次是要创造一个最有利于休眠的条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等。
菌种保藏方法：
1) 斜面低温保藏法：将菌种接种于合适的斜面培养基上，待生长好后置于4℃冰箱保藏，每隔一定时间进行转接培养后，再将新斜面继续保藏。
2) 液体石蜡保藏法：在无菌条件下，往生长好的新鲜斜面中倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上端1cm ，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏。
3) 砂土管保藏法：将斜面培养基上长好的霉菌或放线菌孢子刮下，接到灭菌的沙土管中搅匀，置于盛有干燥剂（如CaCl 2）的容器中密封，低温保藏。
4) 冷冻干燥保藏法：在较低温度下使菌液呈冻结状态，同时抽气减压使之干燥的菌种保藏方法。
5) 液氮超低温冻结法：菌种保藏在液氮冰箱中，温度可低至－196℃。这是目前保藏菌种的新技术。
6) 硅胶保藏法：
1.1.3.2 菌种选育
根据微生物遗传变异的特点，人们在生产实践中已经试验出一套行之有效的微生物育种方法。主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。
一、自然选育
在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程，叫做自然选育。菌种的自发突变往往存在两种可能性：一种是菌种衰退，生产性能下降；另一种是代谢更加旺盛，生产性能提高。具有实践经验和善于观察的工作人员，就能利用自发突变而出现的菌种性状的变化，选育出优良菌种。例如，在谷氨酸发酵过程中，人们从被噬菌体污染的发酵液中分离出了抗噬菌体的菌种。又如，在抗生素发酵生产中，从某一批次高产的发酵液取样进行分离，往往能够得到较稳定的高产菌株。但自发突变的频率较低，出现优良性状的可能较小，需坚持相当长的时间才能收到效果。
新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。
分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定。
典型的微生物新种分离筛选过程
采样原则：
1) 材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。
2) 可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。
培养方法：
培养方法可采用分批式富集培养（摇瓶培养）和恒化富集培养（连续培养）。分批式富集培养是将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复转种几次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌落。恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度，来控制不同菌株的比生长速率。
二、诱变育种
诱变育种是指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。
出发菌种是指用于诱变的原始菌种。出发菌种可以是从自然界的土样或水样中分离出来的野生型菌种；也可以是生产中正在使用的菌种；还可以从菌种保藏机构中购买。选择的原则是菌种要对诱变剂的敏感性强、变异幅度大、产量高。
为了使菌体与诱变剂均匀接触，通常要将出发菌种制成细胞（或孢子）悬浮液，再进行诱变处理。诱变剂有物理诱变剂（如紫外线、X 射线、γ射线、快中子）、化学诱变剂（如亚硝酸、硫酸二乙酯、氮芥）等。在生产实践上，选用哪种诱变剂、剂量大小、处理时间等，都要视具体的情况和条件，并经过预备实验后才能确定。
过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的DNA ，或使交联的DNA 无法打开，不能进行复制和转录，从而引起菌体死亡。
在正常的微生物细胞中，紫外线造成的DNA 损伤是可以得到及时修复的。若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会下降，这就是光复活作用。
光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶(photoreactivating enzyme)，即光裂合酶(photolyase)。光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，此时的光复活酶没有活性。可见光光能(300-500nm)可以激活光复活酶，使之打开二聚体，将DNA 复原。与此同时，光复活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行光复活功能。
一般微生物细胞内都具有光复活酶，所以，微生物紫外线诱变育种应在避光或红光条件下操作。但因为在高剂量紫外线诱变处理后，细胞的光复活主要是致死效应的回复，突变效应不回复，所以，有时也可以采用紫外线和可见光交替处理，以增加菌体的突变率；光复活的程度与可见光照射时间、强度和温度(45-50℃温度下光复活作用最强) 等因素有关。
细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，所以称为暗修复(dark repair)或切除修复作用(excision repair)。它可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA 造成的损伤。
菌种经诱变处理后，会产生各种各样的突变类型。如何从中挑选出所需要的突变类型呢？一般要经过初筛和复筛两个阶段。下面以青霉素产生菌高产突变菌种的筛选为例说明。将经诱变处理的菌液按一定浓度稀释后，涂布在平板培养基上。培养后，将单个菌落挑到斜面培养基上，经培养后，再将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶中，振荡培养后测它们的抗生素效价。这就是初筛。初筛中所得到的超过对照效价10%以上的菌种，再进行复筛。复筛的过程与初筛基本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行1～3次。由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小型甚至中型试验，才能用到发酵生产中。
诱变育种方法中应注意的问题
1. 出发菌株的选择
用来育种处理的起始菌株或称为出发菌株，合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。首先应考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力。出发菌株的来源主要有三方面：
1) 自然界直接分离到的野生型菌株 这些菌株的特点是它们的酶系统完整，染色体或DNA 未损伤，但它们的生产性能通常很差(这正是它们能在大自然中生存的原因) 。通过诱变育种，它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变) 的可能性大。
2) 经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。
3) 已经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤，某些生理功能或酶系统有缺损，产量性状已经达到了一定水平。它们负突变(即产量或质量性状向差的方向改变) 的可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。
一般可选择(1)或(2)类菌株，第(2)类较佳，因为已证明它可以向好的方向发展。在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌株。
出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
2. 制备菌悬液
待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期。
悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。为避免细胞团出现，可用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。将经过一定时期培养的斜面上的孢子洗下，用多层擦镜纸过滤。
利用孢子进行诱变处理的优点是能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂，更重要的是它尽可能地避免了出现表型延迟现象。
所谓的表型延迟(phenotypic lag) 就是指某一突变在DNA 复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。表型延迟现象的出现是因为对数期细胞往往是多核的，很可能一个核发生突变，而另一个核未突变，若突变性状是隐性的，在当代并不表现出来，在筛选时就会被淘汰；若突变性状是显性的，那么，在当代就表现出来，但在进一步传代后，就会出现分离现象，造成生产性状衰退。所以应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。
另外，还有一种生理性延迟现象，就是虽然菌体发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变性状。这可以用营养缺陷型来说明。
一个发生营养缺陷型突变的菌株，产某种酶的基因已发生突变，但是由于突变前菌体内所含的酶系仍然存在，仍具有野生型表型。只有通过数次细胞分裂，细胞内正常的酶得以稀释或被分解，营养缺陷型突变的性状才会表现出来。
3. 诱变处理
仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。例如，同样功率的紫外线照射诱变效应还受到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物的距离、照射时间、菌悬液的浓度、厚度及其均匀程度等诸多因素的影响。另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。
要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对于诱变剂的具体用量有不同
的看法。有人认为应采用高剂量，就是造成菌体致死率在90-99.9%时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于采用低剂量(致死率在70%-80%),甚至更低剂量(致死率在30-70%)，他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。
诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性，复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理.
抗噬菌体菌株的选育
在工业微生物发酵过程中，不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。为此，可采用以下方法：消灭噬菌体和选育抗噬菌体菌株。噬菌体易变异，要不断地选育抗噬菌体菌株。
抗噬菌体菌株选育的方法
1) 自然选育：以噬菌体为筛子，敏感的菌株不经任何诱变自然突变获得的抗性菌株。抗性突变频率低。
2) 诱变选育：敏感菌株经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，经处理后的存活的孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。
3) 将敏感菌株经诱变因素处理后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天；再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取出菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。
抗噬菌体菌株的特性试验
1) 抗噬菌体性状的稳定性试验：抗性菌株分别在孢子培养、种子培养、发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。要多次传代考察稳定性。
2) 抗性菌株的产量试验：抗性菌株与原敏感菌株在发酵特性上有所改变，因此，有考察碳源、氮源、通气量等发酵条件对产量的影响。
3) 真正抗性与溶源性的区别试验。
三、杂交育种
杂交育种(Hybridization)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F 因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。
有杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中更少，而且即使发生杂交，遗传重组的频率亦不高，这影响了基因重组在微生物中的应用。
四、原生质体融合
原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称为“细胞融合”(cell fusion)。
原生质体融合技术始于1976年, 最早是在动物细胞实验中发展起来的，后来，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及细菌和放线菌中也得到了应用。
原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又一个极其重要的基因重组技术。应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1(而诱变育种一般仅为10-8) 。如今，能借助原生质体融合技术进行基因重组的细胞极其广泛，包括原核微生物、真核微生物以及动植物和人体的细胞。
原生质体融合技术示意图
主要步骤为：选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。
1、选择亲株
为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，应考虑该菌株是否适用。
2、原生质体制备
去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。
一些微生物的去壁方法
在菌体生长的培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的作用机理并不十分清楚，有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。
不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。蔗糖的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。
青霉素能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。
菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。
原生质体对渗透压极其敏感，低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。
对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。如细菌的稳定液常用SMM 液(用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖0.5M, 顺丁烯二酸0.02M, MgCl20.02M) 和DF 液(用于棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖0.25M, 琥珀酸0.25M, EDTA0.001M, K2HPO40.02M, KH2PO40.11M , MgCl2 0.01M)。在链霉菌中用得较多的是P 液(主要成分蔗糖0.3M, MgCl20.01M, CaCl20.25M及少量磷酸盐和无机离子) 。真菌中广为使用的
是0.7M NaCl或0.6M MgSO4溶液，高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，易与菌丝碎片分开。
3、原生质体融合
原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要高渗透压。
能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达100%。真菌再生率一般在20-80%。链霉菌再生率最高可达50%。
4、原生质体再生
为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。
涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。
另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。
5、筛选优良性状融合重组子
原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。
重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。
直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子；
间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。
从实际效果来看，直接法虽然方便，但由于选择条件的限制，对某些重组子的生长有影响。虽然间接法操作上要多一步，但不会因营养关系限制某些重组子的再生。特别是对一些有表型延迟现象的遗传标记，宜用间接法。若原生质体融合的两亲株带有抗药性遗传标记，可以用类似的方法筛选重组子。
原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生多种多样的基因组合，从而得到多种类型的重组子，而且参与融合的亲株数不限于两个，可以多至三、四个。这些都是常规杂交育种不可能达到的。
以上获得的还仅仅是融合重组子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定它是否是符合育种要求的优良菌株。
五、基因工程育种
基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA 分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA 分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
图： 基因工程的主要过程
目标基因可以从酶切的供体细胞染色体碎片中获得，或首先提取目标产物的mRNA ，然后将其反转录合成cDNA 而获得，或从目标蛋白的氨基酸顺序推测出基因的碱基顺序，人工合成DNA 片段。
将目标基因的两端和载体DNA 的两端用特定的核酸内切酶酶切后，让它们连接成环状的重组DNA 。因为这是在细胞外进行的基因重组过程，所以，有人将基因工程又称为体外重组DNA 技术。
以质粒为载体的重组体DNA 可以通过转化进入受体细胞，而用噬菌体为载体的重组DNA 可以通过转导或转染进入受体细胞。
重组DNA 在受体细胞中将自主复制扩增。多拷贝的重组DNA 将有利于积累更多的目标产物。
基因工程的操作有着非常强的方向性，但是，最终获得的并非是目标重组体的纯培养物，因为还有许多其它的细胞存在，如：目标基因可能没有被重组、重组的目标基因可能是反向的、重组DNA 无法稳定存在于受体细胞中等。所以，筛选仍然是基因工程育种工作中的重要内容。因为在载体DNA 中可以较容易地设置多种特定遗传标记(如药物抗性标记) ，因此筛选工作的目标性和有效性很高，是其它育种工作所无法比拟的。
1.1.3.3 菌种筛选方法
所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。
菌种筛选方案
在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，应精确测定每个菌株的生产指标。
筛选方案：
第三轮、第四轮…(操作同上)
初筛和复筛工作可以连续进行多轮，直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。
筛选获得的优良菌株还将进一步做工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。
抗性筛选
抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10–6频率的突变体存在，就容易筛选出来。 抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。
1. 一次性筛选法
一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。 抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。
耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。
耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。 而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。
耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。
2. 阶梯性筛选法
药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。
因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。
(1)梯度平板法(Gradient plate) 先将10ml 左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml 含适当浓度的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。
梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。如异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产吡哆醇的高产菌株。
阶梯性筛选法也有一定的缺点，它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。
(2) 纸片扩散法
纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。
推理选育 (Rational Selection)
抗生素产生菌的推理选育是建立在抗生素生物合成机制已知或较清楚的基础上按需要定向选育的一种方法。近几年研究较多, 应用较广, 成效亦较为显著。就一些抗生素而言, 经过多年的研究, 其代谢机理已较清楚。实践证明, 推理选育在抗生素育种上的应用其效果远比传统的随机筛选优越得多, 只需适量筛选, 即可达到所期望的目的。
培养基的调整
一个突变株由于基因突变，失去生理特性的平衡，同时也因此降低了与原来环境条件的适应能力。由于这种环境因素的选择作用，不适应的突变株优良性状不能表达，甚至被淘汰。
在实际选育中，当选育到一个优良变株时，要改变环境条件，即调整培养基配方和培养条件，使变株处于一个适应的环境中得到充分表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，这就是表达型＝基因型＋环境的作用。
基于上述道理，对诱变1～2代后的优良菌株，要进行培养基和培养条件的调整，使它在短时间内的群体遗传结构占优势，从而表现出更高的生产性能，发酵单位达到最佳水平。
培养基调整方法：正交设计和相应面方法
1.1.4 防止菌种衰退的措施
菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。常见的菌种衰退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色的改变。在生理上常指菌种发酵力的降低，或抗噬菌体能力降低。对通过诱变育种而获得的高产变异株则常表现出恢复野生型性状等。
但菌种的真正退化必须与由于环境原因变化而引起菌落形态和生理上的变异区别开来。如培养基中微量元素缺乏会导致孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变。此外，温度、pH 值、不同碳氮源都会导致菌种变化。但只要一旦恢复正常条件，这些现象就会消失。杂菌污染也会造成菌种退化的假象。因此，必须正确判断是否退化，才能找出正确的解决办法。一般菌种退化是从量变到质变逐渐发生的，同时也是整个群体中产量降低及其相联系的种种特性的变化，而不是指单个细胞的变化。
引起菌种退化的原因：
1) 核基因突变：菌种退化的主要原因是有关基因的负突变，这些负突变都是自发形成的。在发酵生产中常用营养缺陷型突变株，如缺陷型发生回复突变就会使产量水平下降。
2) 连续传代：连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。
3) 其它因素：温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变。例如在菌种保藏中基因突变率就随温度降低而减少。
菌种的复壮
菌种发生衰退，并不是所有菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的、具有更强生命力的菌体。因此，可采用单细胞菌体分离的措施淘汰已退化菌体，获得具有原来性状的菌株。也可以改变培养条件，达到复壮的目的。
纯种分离的方法常用的有三种：稀释分离法、平板划线法和组织分离法。稀释分离法是通过不断的稀释手段使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，这样分散的菌种就被固定在原处而形成菌落。平板划线法是用划线的方法将混杂的微生物在平板表面分散开来，最后以单个菌体细胞生长繁殖，形成单个菌落，达到分离，得到纯种。
1.2 种子扩大培养
1.2.1 种子扩大培养的任务
将保存于砂土管、冷冻干燥管、斜面中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程，称为种子扩大培养，这些纯种培养物称为种子。
工业发酵用的微生物菌种必须经过扩大培养，增加细胞数量，同时培养出强壮、健康、活性高的细胞，才能满足大规模工业化生产的需要。菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。
1.2.2 工业微生物的培养类型
工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
静置培养法，即将接有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基中静置培养，在转接到种子罐的培养过程中也无需通风。
通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。
在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养和固体培养两大类型，其中每一类型又有表面培养与深层培养之分。 对于好氧微生物，一般先用克氏瓶或茄子瓶进行扩大，再转接到曲盘扩大培养，或接种到装有液体培养基的三角瓶中在摇床上振荡培养。
主要培养方法及特点
1．种子扩大培养阶段
1) 液体培养法：包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。摇瓶通气量大小与摇瓶机型式、转数、振程(或偏心距) 、三角瓶容量、装料量有关。
2) 表面培养法：包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。
3) 固体培养法：包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。
2．大规模生产阶段
(1)表面培养：
表面培养是一种好氧静置培养方法。针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液(气固界面向培养基内传递，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度也越快。氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。
(2)固体培养
固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
固体培养具有以下优点：
1) 原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。
2) 防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。
3) 通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。
(3)液体深层培养
用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。
特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。
深层培养基本操作的3个控制点：
1) 灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。
2) 温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。
3) 通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH 而使加入的酸和碱均匀分散等。
(4)载体培养
载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。
特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。
载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又能允许空气流通。
1.2.3 影响种子质量的主要因素
菌种扩大培养的关键就是搞好种子罐的扩大培养，影响种子罐培养的主要因素包括营养条件、培养条件、染菌的控制、种子罐的级数和接种量控制等等。
培养基：对于某一菌种和具体设备条件来说，最适宜的培养基成分配比完全应该进行多因素的优选，通过对比试验去确定，从而最大地发挥菌种的特性，提高产量。
2) 种龄与接种量：种子罐中培养的菌种开始移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间称为种龄。通常以菌体处于生长旺盛期（对数生长期）为合适。移入的种子液体积与接种后培养液体积的比例即为接种量。接种量取决于菌种在发酵罐中生长繁殖速度，接种量的大小直接影响发酵周期。一般地，细菌0.5～1% ，酵母菌10～15%。
温度：温度直接影响微生物生长和合成酶。
4) pH 值：由于环境中pH 值不同，微生物原生质膜（具有胶体性质）所带的电荷也不同，从而影响微生物对营养物质的吸收、酶的合成及其活性、代谢途径和细胞膜的通透性的变化。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH 值。在种子扩培过程中。控制pH 值，不但可以保证微生物种子的很好生长，而且可以防止杂菌污染。
5) 通气和搅拌：通气可以供给大量的氧，而搅拌则能使通气的效果更好。
6) 泡沫：泡沫的持久存在影响微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排出；影响设备的利用率；易招致染菌。
7) 染菌的控制：必须加强接种室的消毒管理工作，定期检查消毒效果，严格无菌操作技术。
8) 种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数。种子罐级数一般根据菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖速度以及采用发酵罐体积而定。
种子质量要求
1) 纯：具体检验方法有(1)显微镜观察；(2)斜面接入种子液进行无菌试验 ，观察有无异常菌落出现；(3)有些要检查有无噬菌体
2) 活力旺盛：镜检观察菌体形态，是否粗壮、整齐、处于分裂期
3) 足够的菌体浓度：浊度测定（A640）
菌种与种子扩大培养
2008-05-11 15:12:43| 分类： 阅读337 评论0 字号：大中小 订阅
1.1 微生物工业用菌种
1.1.1 发酵工业对生产菌种的要求
1) 能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高（目标产物的产量尽可能接近理论转化率）。目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离。
2) 发酵条件粗放、易于控制，且所需的酶活性高。
3) 菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会减少；提高设备的利用率。
4) 根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株（微生物菌种缺少或丧失了合成某种或多种必需生长因子的能力）或调节突变菌株或野生菌株。
5) 抗杂菌、抗噬菌体能力强。
6) 菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品质量的稳定性。菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。
7) 菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素等），以保证安全。使用新菌种时更应注意；应用食品领域更需经严格鉴定，如早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止。
1.1.2 工业上常用的微生物
微生物的共同特性
1) 个体小、构造简单；
2) 容易培养、易于代谢；
3) 生长旺盛、繁殖迅速；
4) 适应性强、容易变异；
5) 分布广泛、种类繁多
工业上常用的微生物
发酵工业上常用的微生物有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌四大类群。要求复习微生物知识，掌握工业上常用微生物的基本形态。此处介绍其中具有工业价值的主要微生物。
细菌
细菌是自然界中分布最广、数量最多、与人类关系最为密切的一类微生物，也是发酵工业上使用最多的一种单细胞生物。细菌的一般结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体及内含物几部分；特殊结构是某些细菌所特有的，如荚膜、鞭毛、芽胞等，它们在细菌的分类鉴定中有重要的意义。
发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌大肠杆菌等。
1) 醋酸杆菌（Acetobacter ）：用于酿醋，把乙醇氧化成乙酸。
2) 假单胞菌（Pseudomonas ）
3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和CO 2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。
4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。
5) 枯草芽孢杆菌：是一类好气性的生芽孢杆菌，可用于生产淀粉酶、蛋白酶、某些氨基酸、肌苷、5’-核苷酸酶等。例如枯草杆菌BF7658是生产淀粉酶的主要菌种，枯草杆菌AS1.398是生产中性蛋白酶的主要菌种。
6) 梭状芽孢杆菌：发酵生产丙酮丁醇。
7) 棒杆菌、短杆菌：北京棒状杆菌AS1.299为谷氨酸的高产菌株。
酵母
酵母菌是工农业生产上极为重要的一类微生物，也使微生物遗传学研究的非常有价值的材料。除了广泛用于面包及酒精制造外，还应用在石油脱蜡、单细胞蛋白制造、酶制剂生产以及糖化饲料、猪血饲料发酵等许多方面。此外，从酵母菌体中还可以提取如核糖核酸、细胞色素C 、凝血质及辅酶A 等医药产品。
能产生子囊孢子并进行芽殖的酵母菌，属于有性繁殖的类型，这是鉴别酵母种属之间差别的一个重要特征。
按照洛德（Lodder ）的分类系统，酵母菌共分39属，372种。发酵工业上常用的酵母菌除了酵母属（Saccharomyces ）外，还有假丝酵母属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属及裂殖酵母属等。
1) 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）：属于酵母属，是酵母菌中最重要、应用最广泛的一类。
2) 异常汉逊氏酵母异常变种：属汉逊氏酵母属。
3) 假丝酵母属
4) 毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属：这两个属的酵母都是产膜酵母，在液体表面形成白色的膜，使液体浑浊，常常是酒类饮料的污染菌，它们在饮料表面形成干而皱的菌蹼，是酒精发酵工业及酿造工业的有害菌。
霉菌
霉菌与人类日常生活密切相关。除了用于传统的酿酒、制酱油外，近代广泛用于发酵工业和酶制剂工业。工业上常用的霉菌，有子囊菌纲的红曲霉、藻状菌纲的毛霉、根霉和犁头霉，以及半知菌纲的曲霉及青霉等
1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机酸。如米曲霉（Asp. oryzae）用于酿酒和L-乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、果胶酶、单宁酶等的黑曲霉(Asp. niger)。
2) 青霉属（Penicillium ）：j 既是使果实腐败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄糖酸的产生菌。
3) 根霉属（Rhizopus ）：用于米酒、黄酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机酸发酵以及甾体转化等许多方面。
4) 毛霉属（Mucor ）：产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族化合物。土曲霉：衣康酸
5) 犁头霉属（Absidia ）
放线菌
放线菌是由不同长短的纤细菌丝所形成的单细胞微生物。放线菌是抗生素的主要产生菌。除抗生素外，放线菌在甾体激素生物合成和酶制剂生产上也有广泛应用。链霉菌属是放线菌研究中最为广泛的一类。放线菌产生的抗生素能抑制其他微生物的生长，这种作用称为拮抗作用。不同抗生素对其他微生物的抑制作用是有选择性的。
噬菌体
噬菌体是寄生在细菌和放线菌细胞内的一类微生物。噬菌体的寄生性均有高度专一性，亦即一种噬菌体只能侵染某一种微生物的某个菌株。当噬菌体钻入寄主细胞后迅速增殖，引起微生物（寄主）细胞的裂解和死亡。
1.1.3 生产用菌种的保藏及选育
1.1.3.1 菌种保藏
在发酵工业中，得到一株高产、优良的菌种是一项艰苦的工作，因此，菌种保藏是微生物工业生产的重要环节。菌种保藏工作的要求在于提高菌种存活率和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。
菌种保藏的基本原理：
根据菌种的生理生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖受到抑制处于休眠状态，同时，使菌株避免污染、死亡、衰退和变异。保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽胞等）；其次是要创造一个最有利于休眠的条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等。
菌种保藏方法：
1) 斜面低温保藏法：将菌种接种于合适的斜面培养基上，待生长好后置于4℃冰箱保藏，每隔一定时间进行转接培养后，再将新斜面继续保藏。
2) 液体石蜡保藏法：在无菌条件下，往生长好的新鲜斜面中倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上端1cm ，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏。
3) 砂土管保藏法：将斜面培养基上长好的霉菌或放线菌孢子刮下，接到灭菌的沙土管中搅匀，置于盛有干燥剂（如CaCl 2）的容器中密封，低温保藏。
4) 冷冻干燥保藏法：在较低温度下使菌液呈冻结状态，同时抽气减压使之干燥的菌种保藏方法。
5) 液氮超低温冻结法：菌种保藏在液氮冰箱中，温度可低至－196℃。这是目前保藏菌种的新技术。
6) 硅胶保藏法：
1.1.3.2 菌种选育
根据微生物遗传变异的特点，人们在生产实践中已经试验出一套行之有效的微生物育种方法。主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。
一、自然选育
在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程，叫做自然选育。菌种的自发突变往往存在两种可能性：一种是菌种衰退，生产性能下降；另一种是代谢更加旺盛，生产性能提高。具有实践经验和善于观察的工作人员，就能利用自发突变而出现的菌种性状的变化，选育出优良菌种。例如，在谷氨酸发酵过程中，人们从被噬菌体污染的发酵液中分离出了抗噬菌体的菌种。又如，在抗生素发酵生产中，从某一批次高产的发酵液取样进行分离，往往能够得到较稳定的高产菌株。但自发突变的频率较低，出现优良性状的可能较小，需坚持相当长的时间才能收到效果。
新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。
分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定。
典型的微生物新种分离筛选过程
采样原则：
1) 材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。
2) 可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。
培养方法：
培养方法可采用分批式富集培养（摇瓶培养）和恒化富集培养（连续培养）。分批式富集培养是将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复转种几次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌落。恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度，来控制不同菌株的比生长速率。
二、诱变育种
诱变育种是指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。
出发菌种是指用于诱变的原始菌种。出发菌种可以是从自然界的土样或水样中分离出来的野生型菌种；也可以是生产中正在使用的菌种；还可以从菌种保藏机构中购买。选择的原则是菌种要对诱变剂的敏感性强、变异幅度大、产量高。
为了使菌体与诱变剂均匀接触，通常要将出发菌种制成细胞（或孢子）悬浮液，再进行诱变处理。诱变剂有物理诱变剂（如紫外线、X 射线、γ射线、快中子）、化学诱变剂（如亚硝酸、硫酸二乙酯、氮芥）等。在生产实践上，选用哪种诱变剂、剂量大小、处理时间等，都要视具体的情况和条件，并经过预备实验后才能确定。
过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的DNA ，或使交联的DNA 无法打开，不能进行复制和转录，从而引起菌体死亡。
在正常的微生物细胞中，紫外线造成的DNA 损伤是可以得到及时修复的。若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会下降，这就是光复活作用。
光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶(photoreactivating enzyme)，即光裂合酶(photolyase)。光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，此时的光复活酶没有活性。可见光光能(300-500nm)可以激活光复活酶，使之打开二聚体，将DNA 复原。与此同时，光复活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行光复活功能。
一般微生物细胞内都具有光复活酶，所以，微生物紫外线诱变育种应在避光或红光条件下操作。但因为在高剂量紫外线诱变处理后，细胞的光复活主要是致死效应的回复，突变效应不回复，所以，有时也可以采用紫外线和可见光交替处理，以增加菌体的突变率；光复活的程度与可见光照射时间、强度和温度(45-50℃温度下光复活作用最强) 等因素有关。
细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，所以称为暗修复(dark repair)或切除修复作用(excision repair)。它可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA 造成的损伤。
菌种经诱变处理后，会产生各种各样的突变类型。如何从中挑选出所需要的突变类型呢？一般要经过初筛和复筛两个阶段。下面以青霉素产生菌高产突变菌种的筛选为例说明。将经诱变处理的菌液按一定浓度稀释后，涂布在平板培养基上。培养后，将单个菌落挑到斜面培养基上，经培养后，再将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶中，振荡培养后测它们的抗生素效价。这就是初筛。初筛中所得到的超过对照效价10%以上的菌种，再进行复筛。复筛的过程与初筛基本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行1～3次。由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小型甚至中型试验，才能用到发酵生产中。
诱变育种方法中应注意的问题
1. 出发菌株的选择
用来育种处理的起始菌株或称为出发菌株，合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。首先应考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力。出发菌株的来源主要有三方面：
1) 自然界直接分离到的野生型菌株 这些菌株的特点是它们的酶系统完整，染色体或DNA 未损伤，但它们的生产性能通常很差(这正是它们能在大自然中生存的原因) 。通过诱变育种，它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变) 的可能性大。
2) 经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。
3) 已经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤，某些生理功能或酶系统有缺损，产量性状已经达到了一定水平。它们负突变(即产量或质量性状向差的方向改变) 的可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。
一般可选择(1)或(2)类菌株，第(2)类较佳，因为已证明它可以向好的方向发展。在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌株。
出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
2. 制备菌悬液
待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期。
悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。为避免细胞团出现，可用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。将经过一定时期培养的斜面上的孢子洗下，用多层擦镜纸过滤。
利用孢子进行诱变处理的优点是能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂，更重要的是它尽可能地避免了出现表型延迟现象。
所谓的表型延迟(phenotypic lag) 就是指某一突变在DNA 复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。表型延迟现象的出现是因为对数期细胞往往是多核的，很可能一个核发生突变，而另一个核未突变，若突变性状是隐性的，在当代并不表现出来，在筛选时就会被淘汰；若突变性状是显性的，那么，在当代就表现出来，但在进一步传代后，就会出现分离现象，造成生产性状衰退。所以应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。
另外，还有一种生理性延迟现象，就是虽然菌体发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变性状。这可以用营养缺陷型来说明。
一个发生营养缺陷型突变的菌株，产某种酶的基因已发生突变，但是由于突变前菌体内所含的酶系仍然存在，仍具有野生型表型。只有通过数次细胞分裂，细胞内正常的酶得以稀释或被分解，营养缺陷型突变的性状才会表现出来。
3. 诱变处理
仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。例如，同样功率的紫外线照射诱变效应还受到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物的距离、照射时间、菌悬液的浓度、厚度及其均匀程度等诸多因素的影响。另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。
要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对于诱变剂的具体用量有不同
的看法。有人认为应采用高剂量，就是造成菌体致死率在90-99.9%时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于采用低剂量(致死率在70%-80%),甚至更低剂量(致死率在30-70%)，他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。
诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性，复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理.
抗噬菌体菌株的选育
在工业微生物发酵过程中，不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。为此，可采用以下方法：消灭噬菌体和选育抗噬菌体菌株。噬菌体易变异，要不断地选育抗噬菌体菌株。
抗噬菌体菌株选育的方法
1) 自然选育：以噬菌体为筛子，敏感的菌株不经任何诱变自然突变获得的抗性菌株。抗性突变频率低。
2) 诱变选育：敏感菌株经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，经处理后的存活的孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。
3) 将敏感菌株经诱变因素处理后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天；再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取出菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。
抗噬菌体菌株的特性试验
1) 抗噬菌体性状的稳定性试验：抗性菌株分别在孢子培养、种子培养、发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。要多次传代考察稳定性。
2) 抗性菌株的产量试验：抗性菌株与原敏感菌株在发酵特性上有所改变，因此，有考察碳源、氮源、通气量等发酵条件对产量的影响。
3) 真正抗性与溶源性的区别试验。
三、杂交育种
杂交育种(Hybridization)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F 因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。
有杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中更少，而且即使发生杂交，遗传重组的频率亦不高，这影响了基因重组在微生物中的应用。
四、原生质体融合
原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称为“细胞融合”(cell fusion)。
原生质体融合技术始于1976年, 最早是在动物细胞实验中发展起来的，后来，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及细菌和放线菌中也得到了应用。
原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又一个极其重要的基因重组技术。应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1(而诱变育种一般仅为10-8) 。如今，能借助原生质体融合技术进行基因重组的细胞极其广泛，包括原核微生物、真核微生物以及动植物和人体的细胞。
原生质体融合技术示意图
主要步骤为：选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。
1、选择亲株
为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，应考虑该菌株是否适用。
2、原生质体制备
去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。
一些微生物的去壁方法
在菌体生长的培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的作用机理并不十分清楚，有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。
不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。蔗糖的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。
青霉素能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。
菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。
原生质体对渗透压极其敏感，低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。
对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。如细菌的稳定液常用SMM 液(用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖0.5M, 顺丁烯二酸0.02M, MgCl20.02M) 和DF 液(用于棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖0.25M, 琥珀酸0.25M, EDTA0.001M, K2HPO40.02M, KH2PO40.11M , MgCl2 0.01M)。在链霉菌中用得较多的是P 液(主要成分蔗糖0.3M, MgCl20.01M, CaCl20.25M及少量磷酸盐和无机离子) 。真菌中广为使用的
是0.7M NaCl或0.6M MgSO4溶液，高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，易与菌丝碎片分开。
3、原生质体融合
原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要高渗透压。
能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达100%。真菌再生率一般在20-80%。链霉菌再生率最高可达50%。
4、原生质体再生
为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。
涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。
另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。
5、筛选优良性状融合重组子
原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。
重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。
直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子；
间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。
从实际效果来看，直接法虽然方便，但由于选择条件的限制，对某些重组子的生长有影响。虽然间接法操作上要多一步，但不会因营养关系限制某些重组子的再生。特别是对一些有表型延迟现象的遗传标记，宜用间接法。若原生质体融合的两亲株带有抗药性遗传标记，可以用类似的方法筛选重组子。
原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生多种多样的基因组合，从而得到多种类型的重组子，而且参与融合的亲株数不限于两个，可以多至三、四个。这些都是常规杂交育种不可能达到的。
以上获得的还仅仅是融合重组子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定它是否是符合育种要求的优良菌株。
五、基因工程育种
基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA 分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA 分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
图： 基因工程的主要过程
目标基因可以从酶切的供体细胞染色体碎片中获得，或首先提取目标产物的mRNA ，然后将其反转录合成cDNA 而获得，或从目标蛋白的氨基酸顺序推测出基因的碱基顺序，人工合成DNA 片段。
将目标基因的两端和载体DNA 的两端用特定的核酸内切酶酶切后，让它们连接成环状的重组DNA 。因为这是在细胞外进行的基因重组过程，所以，有人将基因工程又称为体外重组DNA 技术。
以质粒为载体的重组体DNA 可以通过转化进入受体细胞，而用噬菌体为载体的重组DNA 可以通过转导或转染进入受体细胞。
重组DNA 在受体细胞中将自主复制扩增。多拷贝的重组DNA 将有利于积累更多的目标产物。
基因工程的操作有着非常强的方向性，但是，最终获得的并非是目标重组体的纯培养物，因为还有许多其它的细胞存在，如：目标基因可能没有被重组、重组的目标基因可能是反向的、重组DNA 无法稳定存在于受体细胞中等。所以，筛选仍然是基因工程育种工作中的重要内容。因为在载体DNA 中可以较容易地设置多种特定遗传标记(如药物抗性标记) ，因此筛选工作的目标性和有效性很高，是其它育种工作所无法比拟的。
1.1.3.3 菌种筛选方法
所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。
菌种筛选方案
在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，应精确测定每个菌株的生产指标。
筛选方案：
第三轮、第四轮…(操作同上)
初筛和复筛工作可以连续进行多轮，直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。
筛选获得的优良菌株还将进一步做工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。
抗性筛选
抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10–6频率的突变体存在，就容易筛选出来。 抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。
1. 一次性筛选法
一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。 抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。
耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。
耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。 而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。
耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。
2. 阶梯性筛选法
药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。
因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。
(1)梯度平板法(Gradient plate) 先将10ml 左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml 含适当浓度的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。
梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。如异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产吡哆醇的高产菌株。
阶梯性筛选法也有一定的缺点，它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。
(2) 纸片扩散法
纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。
推理选育 (Rational Selection)
抗生素产生菌的推理选育是建立在抗生素生物合成机制已知或较清楚的基础上按需要定向选育的一种方法。近几年研究较多, 应用较广, 成效亦较为显著。就一些抗生素而言, 经过多年的研究, 其代谢机理已较清楚。实践证明, 推理选育在抗生素育种上的应用其效果远比传统的随机筛选优越得多, 只需适量筛选, 即可达到所期望的目的。
培养基的调整
一个突变株由于基因突变，失去生理特性的平衡，同时也因此降低了与原来环境条件的适应能力。由于这种环境因素的选择作用，不适应的突变株优良性状不能表达，甚至被淘汰。
在实际选育中，当选育到一个优良变株时，要改变环境条件，即调整培养基配方和培养条件，使变株处于一个适应的环境中得到充分表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，这就是表达型＝基因型＋环境的作用。
基于上述道理，对诱变1～2代后的优良菌株，要进行培养基和培养条件的调整，使它在短时间内的群体遗传结构占优势，从而表现出更高的生产性能，发酵单位达到最佳水平。
培养基调整方法：正交设计和相应面方法
1.1.4 防止菌种衰退的措施
菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。常见的菌种衰退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色的改变。在生理上常指菌种发酵力的降低，或抗噬菌体能力降低。对通过诱变育种而获得的高产变异株则常表现出恢复野生型性状等。
但菌种的真正退化必须与由于环境原因变化而引起菌落形态和生理上的变异区别开来。如培养基中微量元素缺乏会导致孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变。此外，温度、pH 值、不同碳氮源都会导致菌种变化。但只要一旦恢复正常条件，这些现象就会消失。杂菌污染也会造成菌种退化的假象。因此，必须正确判断是否退化，才能找出正确的解决办法。一般菌种退化是从量变到质变逐渐发生的，同时也是整个群体中产量降低及其相联系的种种特性的变化，而不是指单个细胞的变化。
引起菌种退化的原因：
1) 核基因突变：菌种退化的主要原因是有关基因的负突变，这些负突变都是自发形成的。在发酵生产中常用营养缺陷型突变株，如缺陷型发生回复突变就会使产量水平下降。
2) 连续传代：连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。
3) 其它因素：温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变。例如在菌种保藏中基因突变率就随温度降低而减少。
菌种的复壮
菌种发生衰退，并不是所有菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的、具有更强生命力的菌体。因此，可采用单细胞菌体分离的措施淘汰已退化菌体，获得具有原来性状的菌株。也可以改变培养条件，达到复壮的目的。
纯种分离的方法常用的有三种：稀释分离法、平板划线法和组织分离法。稀释分离法是通过不断的稀释手段使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，这样分散的菌种就被固定在原处而形成菌落。平板划线法是用划线的方法将混杂的微生物在平板表面分散开来，最后以单个菌体细胞生长繁殖，形成单个菌落，达到分离，得到纯种。
1.2 种子扩大培养
1.2.1 种子扩大培养的任务
将保存于砂土管、冷冻干燥管、斜面中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程，称为种子扩大培养，这些纯种培养物称为种子。
工业发酵用的微生物菌种必须经过扩大培养，增加细胞数量，同时培养出强壮、健康、活性高的细胞，才能满足大规模工业化生产的需要。菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。
1.2.2 工业微生物的培养类型
工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
静置培养法，即将接有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基中静置培养，在转接到种子罐的培养过程中也无需通风。
通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。
在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养和固体培养两大类型，其中每一类型又有表面培养与深层培养之分。 对于好氧微生物，一般先用克氏瓶或茄子瓶进行扩大，再转接到曲盘扩大培养，或接种到装有液体培养基的三角瓶中在摇床上振荡培养。
主要培养方法及特点
1．种子扩大培养阶段
1) 液体培养法：包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。摇瓶通气量大小与摇瓶机型式、转数、振程(或偏心距) 、三角瓶容量、装料量有关。
2) 表面培养法：包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。
3) 固体培养法：包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。
2．大规模生产阶段
(1)表面培养：
表面培养是一种好氧静置培养方法。针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液(气固界面向培养基内传递，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度也越快。氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。
(2)固体培养
固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
固体培养具有以下优点：
1) 原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。
2) 防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。
3) 通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。
(3)液体深层培养
用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。
特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。
深层培养基本操作的3个控制点：
1) 灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。
2) 温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。
3) 通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH 而使加入的酸和碱均匀分散等。
(4)载体培养
载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。
特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。
载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又能允许空气流通。
1.2.3 影响种子质量的主要因素
菌种扩大培养的关键就是搞好种子罐的扩大培养，影响种子罐培养的主要因素包括营养条件、培养条件、染菌的控制、种子罐的级数和接种量控制等等。
培养基：对于某一菌种和具体设备条件来说，最适宜的培养基成分配比完全应该进行多因素的优选，通过对比试验去确定，从而最大地发挥菌种的特性，提高产量。
2) 种龄与接种量：种子罐中培养的菌种开始移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间称为种龄。通常以菌体处于生长旺盛期（对数生长期）为合适。移入的种子液体积与接种后培养液体积的比例即为接种量。接种量取决于菌种在发酵罐中生长繁殖速度，接种量的大小直接影响发酵周期。一般地，细菌0.5～1% ，酵母菌10～15%。
温度：温度直接影响微生物生长和合成酶。
4) pH 值：由于环境中pH 值不同，微生物原生质膜（具有胶体性质）所带的电荷也不同，从而影响微生物对营养物质的吸收、酶的合成及其活性、代谢途径和细胞膜的通透性的变化。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH 值。在种子扩培过程中。控制pH 值，不但可以保证微生物种子的很好生长，而且可以防止杂菌污染。
5) 通气和搅拌：通气可以供给大量的氧，而搅拌则能使通气的效果更好。
6) 泡沫：泡沫的持久存在影响微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排出；影响设备的利用率；易招致染菌。
7) 染菌的控制：必须加强接种室的消毒管理工作，定期检查消毒效果，严格无菌操作技术。
8) 种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数。种子罐级数一般根据菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖速度以及采用发酵罐体积而定。
种子质量要求
1) 纯：具体检验方法有(1)显微镜观察；(2)斜面接入种子液进行无菌试验 ，观察有无异常菌落出现；(3)有些要检查有无噬菌体
2) 活力旺盛：镜检观察菌体形态，是否粗壮、整齐、处于分裂期
3) 足够的菌体浓度：浊度测定（A640）