第20卷第4期暨南大学学报(医学版) Vol. 20No. 4 1999年8月 Journal of Jinan University (Medicine Edition ) Aug. 1999
一种简易的细胞克隆方法
郑佩娥
(暨南大学医学院病理解剖学教研室, 广东广州510632)
关键词: 细胞系; 克隆; 培养基
中图分类号: R32912 文献标识码: A 文章编号: 1000-9965(1999) 04-0135-02 由单一个细胞经过繁衍后所形成的细胞群称克隆细胞群[1]。因此不论用什么方法克隆细胞, 都必须保证所分离出来作为克隆化的细胞确为一个而不是两个或更多。关于细胞克隆的方法, 一般用连续克隆化3次的方法[2], 但此法较麻烦, 得出的克隆群也不多(5W0-38) 种既准确且简单易行, 克隆率又高的方法, 现介绍如下。
1 材料与方法
(1) 材料:RP25(GI O 公司产
) ,20%胎牛血清,96孔板(C ORNI NG 产) 。
(2) 方法:(未克隆前时的同一细胞株) 至半汇合状态, 更换一次培养液, 再培养24h , 以3000r/min 离心; 再经直径0122μm 滤孔的滤膜过滤;2) 应用液:取一份适应性培养基加2份培养液;3) 取一瓶处于对数生长期的细胞, 按常规消化、离心、计数;4) 稀释:将细胞稀释成每100μL 约含50个细胞, 打匀;5) 点种:用20μL 移液枪吸取细胞悬液先点几个孔, 每孔约2μL , 其液滴如芝麻大小, 然后在倒置显微镜下观察, 如每孔1～2个细胞, 说明细胞浓度合适, 则可一次点完96孔板。若不然, 则可使液滴增大或缩小, 或者再加细胞, 或者再加培养液稀释;6) 记录:在倒置显微镜下观察96孔板, 将只有单个细胞的序号记录下来, 然后仅给单个细胞孔加培养液200μL , 置C O 2培养箱培养。
2 结果与体会
一般情况, 单个细胞(肿瘤细胞) 在培养箱培养两周即可长满小孔, 在这期间要换液1～2次, 然后可传代。最近我们又克隆了肝癌细胞株, 肾透明细胞癌(RCC925) , 体会到本技术有几大优点:(1) 简便, 不用反复的离心、计数, 一般离心一次即可, 主要通过控制液滴的大小来达到每孔单个细胞。而经典的方法是将细胞悬液反复稀释调配成10个细胞/m L , 然后每孔加入0. 1m L , 静置5min , 在倒置显微镜下经两人共同确认孔内仅有1个细胞时才进行培养[2]。(2) 准确, 因液滴只有芝麻大小, 又处于孔的中央, 所以在倒置显微镜下, 孔中有几个细胞即一目了然, 所以可以一步到位。(3) 适应于任何细胞, 对于一些较透明的细胞, 如肾的透明细胞癌细胞, 当其未贴壁时才能断定是否单个细胞。(4) 成功率高, 在克隆SW0-38细胞株时, 一块96孔板即有20几个孔是单细胞, 最后克隆成功者达6株, 而且其中有两株的生物特性与形态迥异, 一株是高转移细胞克隆, 活体形态学上呈桑椹状生长(见图1) ; 另一株是低转移细胞克隆, 活体形态学上呈单层镶嵌状生长(图2) . 收稿日期: 1999-03-14
作者简介: 郑佩娥(1957～) , 女, 广东饶平人, 实验师1
136暨南大学学报(医学版) 1999年 图1 为高转移细胞克隆, 活体
形态学上呈桑椹状生长 图2
活体形 参考文献:
[1] 鄂 征1组织培养技术11北京1131～1341
[2] 张海伟, (高低转移潜能亚系的建立及其形态学比较[J]1暨南大
) , , (2) :1
第20卷第4期暨南大学学报(医学版) Vol. 20No. 4 1999年8月 Journal of Jinan University (Medicine Edition ) Aug. 1999
一种简易的细胞克隆方法
郑佩娥
(暨南大学医学院病理解剖学教研室, 广东广州510632)
关键词: 细胞系; 克隆; 培养基
中图分类号: R32912 文献标识码: A 文章编号: 1000-9965(1999) 04-0135-02 由单一个细胞经过繁衍后所形成的细胞群称克隆细胞群[1]。因此不论用什么方法克隆细胞, 都必须保证所分离出来作为克隆化的细胞确为一个而不是两个或更多。关于细胞克隆的方法, 一般用连续克隆化3次的方法[2], 但此法较麻烦, 得出的克隆群也不多(5W0-38) 种既准确且简单易行, 克隆率又高的方法, 现介绍如下。
1 材料与方法
(1) 材料:RP25(GI O 公司产
) ,20%胎牛血清,96孔板(C ORNI NG 产) 。
(2) 方法:(未克隆前时的同一细胞株) 至半汇合状态, 更换一次培养液, 再培养24h , 以3000r/min 离心; 再经直径0122μm 滤孔的滤膜过滤;2) 应用液:取一份适应性培养基加2份培养液;3) 取一瓶处于对数生长期的细胞, 按常规消化、离心、计数;4) 稀释:将细胞稀释成每100μL 约含50个细胞, 打匀;5) 点种:用20μL 移液枪吸取细胞悬液先点几个孔, 每孔约2μL , 其液滴如芝麻大小, 然后在倒置显微镜下观察, 如每孔1～2个细胞, 说明细胞浓度合适, 则可一次点完96孔板。若不然, 则可使液滴增大或缩小, 或者再加细胞, 或者再加培养液稀释;6) 记录:在倒置显微镜下观察96孔板, 将只有单个细胞的序号记录下来, 然后仅给单个细胞孔加培养液200μL , 置C O 2培养箱培养。
2 结果与体会
一般情况, 单个细胞(肿瘤细胞) 在培养箱培养两周即可长满小孔, 在这期间要换液1～2次, 然后可传代。最近我们又克隆了肝癌细胞株, 肾透明细胞癌(RCC925) , 体会到本技术有几大优点:(1) 简便, 不用反复的离心、计数, 一般离心一次即可, 主要通过控制液滴的大小来达到每孔单个细胞。而经典的方法是将细胞悬液反复稀释调配成10个细胞/m L , 然后每孔加入0. 1m L , 静置5min , 在倒置显微镜下经两人共同确认孔内仅有1个细胞时才进行培养[2]。(2) 准确, 因液滴只有芝麻大小, 又处于孔的中央, 所以在倒置显微镜下, 孔中有几个细胞即一目了然, 所以可以一步到位。(3) 适应于任何细胞, 对于一些较透明的细胞, 如肾的透明细胞癌细胞, 当其未贴壁时才能断定是否单个细胞。(4) 成功率高, 在克隆SW0-38细胞株时, 一块96孔板即有20几个孔是单细胞, 最后克隆成功者达6株, 而且其中有两株的生物特性与形态迥异, 一株是高转移细胞克隆, 活体形态学上呈桑椹状生长(见图1) ; 另一株是低转移细胞克隆, 活体形态学上呈单层镶嵌状生长(图2) . 收稿日期: 1999-03-14
作者简介: 郑佩娥(1957～) , 女, 广东饶平人, 实验师1
136暨南大学学报(医学版) 1999年 图1 为高转移细胞克隆, 活体
形态学上呈桑椹状生长 图2
活体形 参考文献:
[1] 鄂 征1组织培养技术11北京1131～1341
[2] 张海伟, (高低转移潜能亚系的建立及其形态学比较[J]1暨南大
) , , (2) :1