生堡塞墅处型盘盔！Ｑ塑生！旦星垫鲞筮！翅￡丛！』坠ｅ§！瑾：丛型！Ｑ唑：ｙ！！：２１：型！：§
・６６１・
・新技术与新方法・
一种改良大鼠肝细胞分离和原代培养技术
王伟雅周济宏
【摘要】
张峰平晓春李幼生黎介寿
Ⅲ型胶原预铺培养板，改良
目的探讨并改进大鼠肝细胞分离和堵养技术。方法
原位胶原酶阴步灌流法分离肝细胞，适宜密度接种．含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基培养；观察细胞产量、活率、贴壁和生长情况评价方法的可行性。结果肝细胞分离时间明显缩短；胶原酶用量减少１／３；每鼠可获得（１．８１±０．６５）Ｘ１０８个肝细胞；活率为（８７．４６±６．９０）％；细胞接种４
ｈ
即可贴壁，可存活２～３周。结论该法操作简便、经济，细胞产量和存活率高，贴壁和生长良好，可满足各种实验需求。
【关键词】肝细胞；胶原酶；细胞培养
Ａ
ｍｏｄｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓＷＡＮＧＷｅｉ—ｙａ，ＺＨＯＵＪｉ—
ｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＦｅｎｇ，ｅｔａ１．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＣｌｉｎｉｃａｌＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃａｌ
Ｃｏｌｌｅｇｅ
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ｒｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｎａｎｊｉｎｇ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＵＹｏｕ—ｓｈｅｎｇ
２１０００２．Ｃｈｉｎａ
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ｃｕｌｔｕｒｅ
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ；Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ；Ｃｅｌｌ
体外培养肝细胞用于药理学、毒理学、生物化学以及生物人工肝等领域的研究具有许多优点¨Ｊ。但肝细胞属于高分化细胞，所需培养条件较高，成功率低，是制约该技术广泛应用的瓶颈口Ｊ。虽然国内外在此方面的研究已有６０多年的历史，但Ｈ前采用的方法仍存在费时、费力、存活率和贴壁率低等缺点。在本实验中，我们作了针对性的改进，获得了较理想效果。
材料和方法
１．材料：Ｓｐｒａｇｕｅ．Ｄａｗｌｅｙ大鼠，３６只，５—６周龄，体质量１５０～１８０ｇ，雌雄不限，标准饮食喂养。ｃＯ：培养箱（ＨＥＲＡ
ｃｅｌｌ
型胶原（美国Ｓｉｇｍａ公司），ＩＶ型胶原酶（美国Ｇｉｂｃｏ公司），乙二醇双（２一氨基乙基醚）四乙酸（ＥＧＴＡ，Ａｍｒｅｓ—ｃｏ），Ｉ型ＤＮＡ酶（ＤＮａｓｅ
Ｉ，美国Ｓｉｇｍａ公司）；无
ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＧＴＡ，ｐＨ
Ｃａ“、Ｍｇ“的Ｄ—Ｈａｎｋｓ液（含０．５
７．２—７．４），高压灭菌；ＩＶ型胶原酶灌注液（Ｈａｎｋｓ液，
钔．０５％的Ⅳ型胶原酶、０．００５％ＤＮａｓｅ
０．０１
Ｉ，ｐＨ７．２—
７．４），用前现配，抽滤除菌；１Ｘ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，
ｍｏＬ／Ｌ），高压灭菌。
２．实验准备：将Ⅲ型胶原用０．１ｍｏＶＬ的醋酸溶解成１∥Ｌ的贮存液，抽滤除菌（一２０℃下保存），用前以ＰＢＳ稀释至０．１ｓ／Ｌ使用液。按５０Ｉ＿Ｌｌ／ｅｍ２底面积涂布培养板底，置于３７℃培养箱中孵育２ｈ以上。吸出多余胶原液（回收，４℃下保存，重复使用），加入ＰＢＳ备用。
３．肝细胞分离：按文献［３，４］描述的方法并做适当改进分离肝细胞。先将１００
８０
ｍｌ
１
１５０）；倒置相差显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，
ＣＫＸ４１）；６孔细胞培养板（ＴＰＰ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；无菌头皮针、２００日尼龙网筛和手术器械；ＲＰＭＩ１６４０培养基（美国Ｇｉｂｃｏ公司），胎牛血清（ＩＣＰ，ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ），Ⅲ
ＤＯ！：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０．２００９．０５．０４２基金项目：国家内然科学基金资助项目（３０６７２０６０）
作者单位：２１０００２南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院普通外科研究所
通信作者：李幼生
ｍｌ，３７℃培养箱中浸泡过夜。次日吸除浸泡液，干燥
Ｄ—Ｈａｎｋｓ液和６０—
ｒＩＩｌ胶原酶液在水浴箱中预温至３７℃。腹腔注射氯
胺酮（１００ｍｇ／ｋｇ）麻醉，腹腔注射肝素钠（５Ｕ／ｇ）抗凝。备胸腹部皮肤，碘伏消毒。正中切口开腹，游离门静
万方数据
・６６２・
主堡塞熊处登苤查！Ｑ塑生！旦筮堑鲞笙ｉ翅￡！ｉ！』曼翌坠坚：丛业！Ｑ鲤：！尘：堑：羔！：！
脉，深面预置１根结扎线。剪去头皮针头使断面成斜坡状，轻轻挑起门静脉干，距肝ｆ－ｊ１．５—２．０ｃｍ处横行剪开前壁，向近心端插入导管并固定。开右胸显露并结扎下腔静脉胸段。离断下腔静脉腹腔段，经导管以
ｌＯ一２０
ｍｌ／ｍｉｎ的速度匀速灌注Ｄ—Ｈａｎｋｓ液。肝脏变
苍白、流出液变清时开始灌注胶原酶液，流速为８～
１０
ｍｌ／ｍｉｎ，待肝脏呈土黄色、包膜下呈龟背状裂隙时
停止灌流。摘除肝脏，立即置于４０ｒＩｌｌ冰浴的ＰＢＳ中。在超净台内将肝脏和洗液转人无菌平皿，用无齿镊反复夹持破碎肝组织，边央边漂洗，直至无太多肝细胞残留为止，丢弃结缔组织。２００目尼龙网筛过滤细胞悬液并转至５０ｒｎｌ离心管。５０
ｘ
ｇ低速离心３ｍｉｎ，去除
上层悬液，细胞沉淀同法再洗涤２次，获取较纯肝细胞。吸净上清，加入３０～４０ｍｌ完全ＲＭＰＩ１６４０培养基（含１０％胎牛血清、青霉素１００Ｕ／ｍｌ、链霉素
１００
ｍｇ／Ｌ），制成细胞悬液。
４．细胞计数和存活率判定：吸取少量细胞悬液，适
当稀释，与０．４％台盼蓝染液按９：ｌ体积混匀，在２
ｍｉｎ
内于１０×物镜下计数一个大方格内的死细胞数（蓝染者）和总细胞数；再计数全部４个大方格内的细胞总数，据公式计算出活细胞率、细胞密度和肝细胞总数（产量）。
５．细胞接种和原代培养：稀释细胞悬液，按照３×１０４—１０×１０４爪／ｃｍ２底面积的密度接种，每孔接种液量为２ｍｌ。轻轻摇匀后置于３７℃细胞培养箱（５％ＣＯ：，９５％空气，１００％湿度）中培养。２４ｈ后首次更换培养基，以后每２ｄ更换１次。
６．细胞贴壁和生长观察：分别在接种后４、２４
ｈ、３、
５
ｄ、ｌ、２和３周用倒置相差显微镜）１１５ｌ察肝细胞贴擘和生长情况、形态变化和有无污染。
７．统计学方法：数据以均数±标准差（亘±ｓ）表示。
ＳＰＳＳ
１３．０统计软件单样本ｔ检验方法计算细胞产量和
存活率。
结
果
１．大鼠肝细胞产量和存活率：每鼠肝脏可获得（１．８１±０．６５）×１０８个肝细胞。肝细胞存活率为（８７．４６±６．９０）％。
２．肝细胞的纯度：５０×ｇ的相对离心力低速离心、洗涤３次，可获得较纯肝细胞。少量混杂成分多为红细胞、组织或细胞碎片，偶尔会混有肝星状细胞。
３．肝细胞贴壁和生长情况：接种后４ｈ绝大多数肝细胞即已贴擘。２４ｈ后几乎所有活细胞都已贴壁．细胞贴附伸展变扁平，呈圆形、椭圆形或多边形，胞核较大，胞质含有较多颗粒。３ｄ时细胞密度增大、双核
万方数据
肝细胞增多。５ｄ时新生细胞和细胞数量进一步增多。１周时可见较多新生肝细胞生长并融合成片，核分裂像多见，同时可见少量脱肇死亡细胞。２周时细胞生长旺盛，可见大量新生细胞相互融合，色泽鲜亮。３周时新牛细胞减少而死亡崩解细胞明显增多，细胞边界模糊，可见大营细胞碎片（以７×１０４／ｃｍ２的密度接种）。
讨
论
肝细胞属贴附生长型细胞，国外研究多先用胶原包被培养板以促其贴壁，一般２～４ｈ即可贴壁伸展。胶原尚可保持肝细胞的正常功能并延长其生存时间＂Ｊ。离体肝细胞在悬液中可存活４—６ｈ，尽快分离接种是保证其存活的关键。我们用无齿镊反复夹持分离，只需５ｍｉｎ左右，可明显缩短分离时间，保证肝细胞的存活率。胶原酶价格昂贵，文献中酶液用量一般为１００—１５０ｍｌ。我们用６０～８０ｍｌ胶原酶液进行灌流，同样町充分离散肝细胞。技巧是在灌流时用手指压迫下腔静脉切口上方使灌流液尽量充满肝脏，然后松开手指排出液体，反复进行数次。其优点是可延长胶原酶与肝脏间质的作用时间，可节省约１／３的胶原酶。
贴附生长型细胞在培养时受接触抑制和密度抑制调节，因此接种密度对于细胞的生长、增殖较为重要。国外报道的接种密度多介于３×１０４—１３×１０４个细胞／ｃｍ２底面积之间。我们发现密度介于６×１０４—８×１０４个细胞／ｃｍ２时细胞贴壁和生长较理想；不同实验要求的接种密度也有所差异，需作长期培养时应选用较低密度以利于细胞增殖，而短期实验可增大密度至１０×１０４个细胞／ｃｍ２左右使细胞直接贴满板底，即可很快用于实验。总之，经改良后的方法省时省力、经济、肝细胞产量和存活率高、贴壁和生长良好，可满足各种实验需求；胶原铺板、尽快分离接种、适宜接种密度是影响肝细胞贴壁生长和增殖的主要因素。
参考文献
［１］Ｗｉｃｋ
Ｍ，ＫｏｅｂｅＨＧ，ＳｃｈｉｌｄｂｅｒｇＦＷ．Ｎｅｗ
ｗａｙｓ
ｉｎ
ｈｅｐａｔｃｃｙｔｅ
ｅｕｌ—
ｔｕｒｅｓ：Ｃｅｌｌ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ａｈｅｘ，１９９７，１４：５１—５６．
［２］殷穆！彬．ｆ１淑、！，刘ｆＩｆ｛＃．Ｈｒ细胞分离与培养的研究进展．哈尔滨医科大学学报，２００２，３６：４９４－４９６．
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Ｃｒｉｓｐ
ＤＭ．ＳＯｒｍａｎ
ＡＥ，Ｂｅｉｍｅ
ＪＭ．ｅｔａ１．Ａｍｕｈｉｃｈａｎｎｅｌ
ｐｅｆｉｆｕｓｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ
ｆｏｒｔｈｅ
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ
ｏｆ
ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ
ａｎｄ
ｇｌｕｃｏ．＂
ｇｅｎｅｓｉｓｉｎｉｓｏｌａｔｅｄ
ｒａｔ
ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＥｕｒＪ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
９８２，ｌ
２３：３７７—
３８１．
［４］ＤａｖｅＳ．Ｍａｔｈｕｒ
Ｍ，Ｂｈａｔｎａｇａｒ
Ｖ．Ｈｅｐａｔｏｃ”ｅｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ—
ｔｉｏｎｉｎ
ｓｙｎｇｅｎｉｃｒａｔｓ．Ｔｒｏｐ
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ０１．２０００，２１：１９４・１９６．
［５］
唐钾敏，詹奋姣，李航森．等．人胎肝细胞分离与培养技术的研究．中华实验外科杂志。２００１，１８：４３８－４３９．
（收穑日期：２００８４）９・２３）
生堡塞墅处型盘盔！Ｑ塑生！旦星垫鲞筮！翅￡丛！』坠ｅ§！瑾：丛型！Ｑ唑：ｙ！！：２１：型！：§
・６６１・
・新技术与新方法・
一种改良大鼠肝细胞分离和原代培养技术
王伟雅周济宏
【摘要】
张峰平晓春李幼生黎介寿
Ⅲ型胶原预铺培养板，改良
目的探讨并改进大鼠肝细胞分离和堵养技术。方法
原位胶原酶阴步灌流法分离肝细胞，适宜密度接种．含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基培养；观察细胞产量、活率、贴壁和生长情况评价方法的可行性。结果肝细胞分离时间明显缩短；胶原酶用量减少１／３；每鼠可获得（１．８１±０．６５）Ｘ１０８个肝细胞；活率为（８７．４６±６．９０）％；细胞接种４
ｈ
即可贴壁，可存活２～３周。结论该法操作简便、经济，细胞产量和存活率高，贴壁和生长良好，可满足各种实验需求。
【关键词】肝细胞；胶原酶；细胞培养
Ａ
ｍｏｄｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓＷＡＮＧＷｅｉ—ｙａ，ＺＨＯＵＪｉ—
ｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＦｅｎｇ，ｅｔａ１．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＣｌｉｎｉｃａｌＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃａｌ
Ｃｏｌｌｅｇｅ
ｏｆＮａｎ－
ｒｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｎａｎｊｉｎｇ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＵＹｏｕ—ｓｈｅｎｇ
２１０００２．Ｃｈｉｎａ
【Ａｂｓｔｒａｃｔｌ
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ａ
Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅａｎｄｍｏｄｉｆｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｏｆ
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ｃｕｌｔｕｒｅ
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ；Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ；Ｃｅｌｌ
体外培养肝细胞用于药理学、毒理学、生物化学以及生物人工肝等领域的研究具有许多优点¨Ｊ。但肝细胞属于高分化细胞，所需培养条件较高，成功率低，是制约该技术广泛应用的瓶颈口Ｊ。虽然国内外在此方面的研究已有６０多年的历史，但Ｈ前采用的方法仍存在费时、费力、存活率和贴壁率低等缺点。在本实验中，我们作了针对性的改进，获得了较理想效果。
材料和方法
１．材料：Ｓｐｒａｇｕｅ．Ｄａｗｌｅｙ大鼠，３６只，５—６周龄，体质量１５０～１８０ｇ，雌雄不限，标准饮食喂养。ｃＯ：培养箱（ＨＥＲＡ
ｃｅｌｌ
型胶原（美国Ｓｉｇｍａ公司），ＩＶ型胶原酶（美国Ｇｉｂｃｏ公司），乙二醇双（２一氨基乙基醚）四乙酸（ＥＧＴＡ，Ａｍｒｅｓ—ｃｏ），Ｉ型ＤＮＡ酶（ＤＮａｓｅ
Ｉ，美国Ｓｉｇｍａ公司）；无
ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＧＴＡ，ｐＨ
Ｃａ“、Ｍｇ“的Ｄ—Ｈａｎｋｓ液（含０．５
７．２—７．４），高压灭菌；ＩＶ型胶原酶灌注液（Ｈａｎｋｓ液，
钔．０５％的Ⅳ型胶原酶、０．００５％ＤＮａｓｅ
０．０１
Ｉ，ｐＨ７．２—
７．４），用前现配，抽滤除菌；１Ｘ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，
ｍｏＬ／Ｌ），高压灭菌。
２．实验准备：将Ⅲ型胶原用０．１ｍｏＶＬ的醋酸溶解成１∥Ｌ的贮存液，抽滤除菌（一２０℃下保存），用前以ＰＢＳ稀释至０．１ｓ／Ｌ使用液。按５０Ｉ＿Ｌｌ／ｅｍ２底面积涂布培养板底，置于３７℃培养箱中孵育２ｈ以上。吸出多余胶原液（回收，４℃下保存，重复使用），加入ＰＢＳ备用。
３．肝细胞分离：按文献［３，４］描述的方法并做适当改进分离肝细胞。先将１００
８０
ｍｌ
１
１５０）；倒置相差显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，
ＣＫＸ４１）；６孔细胞培养板（ＴＰＰ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；无菌头皮针、２００日尼龙网筛和手术器械；ＲＰＭＩ１６４０培养基（美国Ｇｉｂｃｏ公司），胎牛血清（ＩＣＰ，ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ），Ⅲ
ＤＯ！：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０．２００９．０５．０４２基金项目：国家内然科学基金资助项目（３０６７２０６０）
作者单位：２１０００２南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院普通外科研究所
通信作者：李幼生
ｍｌ，３７℃培养箱中浸泡过夜。次日吸除浸泡液，干燥
Ｄ—Ｈａｎｋｓ液和６０—
ｒＩＩｌ胶原酶液在水浴箱中预温至３７℃。腹腔注射氯
胺酮（１００ｍｇ／ｋｇ）麻醉，腹腔注射肝素钠（５Ｕ／ｇ）抗凝。备胸腹部皮肤，碘伏消毒。正中切口开腹，游离门静
万方数据
・６６２・
主堡塞熊处登苤查！Ｑ塑生！旦筮堑鲞笙ｉ翅￡！ｉ！』曼翌坠坚：丛业！Ｑ鲤：！尘：堑：羔！：！
脉，深面预置１根结扎线。剪去头皮针头使断面成斜坡状，轻轻挑起门静脉干，距肝ｆ－ｊ１．５—２．０ｃｍ处横行剪开前壁，向近心端插入导管并固定。开右胸显露并结扎下腔静脉胸段。离断下腔静脉腹腔段，经导管以
ｌＯ一２０
ｍｌ／ｍｉｎ的速度匀速灌注Ｄ—Ｈａｎｋｓ液。肝脏变
苍白、流出液变清时开始灌注胶原酶液，流速为８～
１０
ｍｌ／ｍｉｎ，待肝脏呈土黄色、包膜下呈龟背状裂隙时
停止灌流。摘除肝脏，立即置于４０ｒＩｌｌ冰浴的ＰＢＳ中。在超净台内将肝脏和洗液转人无菌平皿，用无齿镊反复夹持破碎肝组织，边央边漂洗，直至无太多肝细胞残留为止，丢弃结缔组织。２００目尼龙网筛过滤细胞悬液并转至５０ｒｎｌ离心管。５０
ｘ
ｇ低速离心３ｍｉｎ，去除
上层悬液，细胞沉淀同法再洗涤２次，获取较纯肝细胞。吸净上清，加入３０～４０ｍｌ完全ＲＭＰＩ１６４０培养基（含１０％胎牛血清、青霉素１００Ｕ／ｍｌ、链霉素
１００
ｍｇ／Ｌ），制成细胞悬液。
４．细胞计数和存活率判定：吸取少量细胞悬液，适
当稀释，与０．４％台盼蓝染液按９：ｌ体积混匀，在２
ｍｉｎ
内于１０×物镜下计数一个大方格内的死细胞数（蓝染者）和总细胞数；再计数全部４个大方格内的细胞总数，据公式计算出活细胞率、细胞密度和肝细胞总数（产量）。
５．细胞接种和原代培养：稀释细胞悬液，按照３×１０４—１０×１０４爪／ｃｍ２底面积的密度接种，每孔接种液量为２ｍｌ。轻轻摇匀后置于３７℃细胞培养箱（５％ＣＯ：，９５％空气，１００％湿度）中培养。２４ｈ后首次更换培养基，以后每２ｄ更换１次。
６．细胞贴壁和生长观察：分别在接种后４、２４
ｈ、３、
５
ｄ、ｌ、２和３周用倒置相差显微镜）１１５ｌ察肝细胞贴擘和生长情况、形态变化和有无污染。
７．统计学方法：数据以均数±标准差（亘±ｓ）表示。
ＳＰＳＳ
１３．０统计软件单样本ｔ检验方法计算细胞产量和
存活率。
结
果
１．大鼠肝细胞产量和存活率：每鼠肝脏可获得（１．８１±０．６５）×１０８个肝细胞。肝细胞存活率为（８７．４６±６．９０）％。
２．肝细胞的纯度：５０×ｇ的相对离心力低速离心、洗涤３次，可获得较纯肝细胞。少量混杂成分多为红细胞、组织或细胞碎片，偶尔会混有肝星状细胞。
３．肝细胞贴壁和生长情况：接种后４ｈ绝大多数肝细胞即已贴擘。２４ｈ后几乎所有活细胞都已贴壁．细胞贴附伸展变扁平，呈圆形、椭圆形或多边形，胞核较大，胞质含有较多颗粒。３ｄ时细胞密度增大、双核
万方数据
肝细胞增多。５ｄ时新生细胞和细胞数量进一步增多。１周时可见较多新生肝细胞生长并融合成片，核分裂像多见，同时可见少量脱肇死亡细胞。２周时细胞生长旺盛，可见大量新生细胞相互融合，色泽鲜亮。３周时新牛细胞减少而死亡崩解细胞明显增多，细胞边界模糊，可见大营细胞碎片（以７×１０４／ｃｍ２的密度接种）。
讨
论
肝细胞属贴附生长型细胞，国外研究多先用胶原包被培养板以促其贴壁，一般２～４ｈ即可贴壁伸展。胶原尚可保持肝细胞的正常功能并延长其生存时间＂Ｊ。离体肝细胞在悬液中可存活４—６ｈ，尽快分离接种是保证其存活的关键。我们用无齿镊反复夹持分离，只需５ｍｉｎ左右，可明显缩短分离时间，保证肝细胞的存活率。胶原酶价格昂贵，文献中酶液用量一般为１００—１５０ｍｌ。我们用６０～８０ｍｌ胶原酶液进行灌流，同样町充分离散肝细胞。技巧是在灌流时用手指压迫下腔静脉切口上方使灌流液尽量充满肝脏，然后松开手指排出液体，反复进行数次。其优点是可延长胶原酶与肝脏间质的作用时间，可节省约１／３的胶原酶。
贴附生长型细胞在培养时受接触抑制和密度抑制调节，因此接种密度对于细胞的生长、增殖较为重要。国外报道的接种密度多介于３×１０４—１３×１０４个细胞／ｃｍ２底面积之间。我们发现密度介于６×１０４—８×１０４个细胞／ｃｍ２时细胞贴壁和生长较理想；不同实验要求的接种密度也有所差异，需作长期培养时应选用较低密度以利于细胞增殖，而短期实验可增大密度至１０×１０４个细胞／ｃｍ２左右使细胞直接贴满板底，即可很快用于实验。总之，经改良后的方法省时省力、经济、肝细胞产量和存活率高、贴壁和生长良好，可满足各种实验需求；胶原铺板、尽快分离接种、适宜接种密度是影响肝细胞贴壁生长和增殖的主要因素。
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