第30卷 第6期
1998年11月
A CTA B I OCH I M I CA et B I O PH YS I CA S I N I CA
V o l . 30,N o. 6
N ov . , 1998
研究简报
辣根过氧化物酶在一种新型有机介质中的催化反应
蒋太交 吉鑫松 袁中一3
(中国科学院上海生物化学研究所, 上海200031)
摘要 选择合适的酶反应介质体系, 是酶应用于有机合成的一个重要环节。利用适宜分子量的聚乙二醇(PEG ) 可以将辣根过氧化物酶(HR P ) 分散在甲苯中, 摸索了HR P 在聚乙二醇(PEG ) 2甲苯互溶体系反应的适宜条件, 即甲苯的比例、含水量、底物浓度等对酶活性影响, 结果发现PEG 含量越低, 含水量越高, 酶的活力越PEG pH 值、高; 酶在此体系中的最适pH 值为7. 0, 最适过氧化氢浓度为20mmo l L , 愈创木酚的浓度为0. 1mo l L 。在含水量、二氧六环、甲苯为主体反应介质体系中HR P 的活力, 结果发现乙醇PEG 含量相同条件下, 对比研究了以乙醇、2PEG 、二氧六环2PEG 中测不出酶活力, 观察到酶明显失活。而在甲苯2PEG 的反应介质体系中, 酶呈现很高活力且比HR P 在甲苯中的活力提高了10倍左右。
关键词 反应介质; 聚乙二醇(PEG ) ; 辣根过氧化物酶(HR 的应用大受限制[1, 2]。为此, 方法[3][4, ]或高聚物[6]的复合物以
外, 选择和优化酶的反应介质是另一个十分重要的途径。研究表明酶在有机相中的催化作用与反应介质有着密切联系。亲水性较强的有机溶剂对酶结构破坏大。处于疏水性较强的有机溶剂中, 酶则很难溶解, 内部传质受到限制。而反相胶束体系中的表面活性剂毒性大而且难以除去。为此, 我们设计了一个聚乙二醇(PEG ) 2甲苯互溶体系, 并验证了甲苯2PEG 体系中各种因素对辣根过氧化物酶反应的影响。
1. 1 反应介质体系的组成及酶活测定
PEG 1000纯化参照文献[10]的方法, 先将30g PEG 溶解在40℃的240m l 丙酮中, 然后容器浸
[9]
[4]
[1, 7, 8]
25℃进行, 所用底物H 2O 2和愈创木酚都以PEG 2甲苯为溶剂配制。先把5～10Λl 20g L HR P 溶液加入甲苯2PEG 体系中, 摇匀。然后加愈创木酚, 最后加H 2O 2引发反应。酶的活力以相对值表示。
1. 2 几种PEG 对反应体系形成的影响
在25℃下, 分别将一定量的PEG 加入到甲苯中, 发现PEG 600、PEG 1000和PEG 2000可以与甲苯形成均一的体系, 而分子量3000或以上的PEG 在常温下很难溶解于甲苯中。酶溶液不能够均匀分散在PEG 2000与甲苯体系中。而在同样条件下, 酶在PEG 600与甲苯体系中的活性很低。只有在PEG 1000与甲苯体系中, 酶能够充分分散且具有良好的反应特性。因此, 下面的研究都是以PEG 1000为材料的。1. 3 底物浓度的影响
入冰浴使PEG 沉淀下来。再往其中加240m l 乙醚并用砂芯漏斗过滤去溶液, 收集的沉淀用240～300m l 乙醚洗, 最后真空抽干和贮藏在干燥器中。制备PEG 2甲苯体系时, 取一定量的PEG 溶解在甲苯
在PEG 2甲苯体系中研究了辣根过氧化物酶的活力与底物的关系。图1表示辣根过氧化物酶活力与愈创木酚、过氧化氢浓度之间的关系。在过氧化氢为20mm o l L 时, 随着愈创木酚浓度增加, 酶活力也趋增大。当愈创木酚浓度超过0. 1m o l L 时, 酶活力随愈创木酚浓度增加而增大的趋势有所下降, 结果见图1。图1也表示了在愈创木酚浓度为0. 1m o l L 时, 酶活力与过氧化氢浓度的关系。酶
中, 配成每毫升甲苯中含有1g 纯化干燥的PEG 。
根据需要, 再将该溶液用甲苯稀释成不同PEG 含收稿日期:1998—03—12 接受日期:1998—05—253联系人:Fax , [1**********]7; e 2m ail , zhongyi @sunm . shc 2
nc . ac . cn
活力随过氧化氢浓度的增加而增加。当过氧化氢浓
度大于20mm o l L 后, 酶活力随过氧化氢浓度的增加而下降。这表明酶活力受到高浓度过氧化氢的抑制。本文发现过氧化氢的浓度为20mm o l L 时, 酶在PEG 2甲苯体系中的活力最高
。
F ig . 3 Effect of w ater amoun t of PEG to luene system on
the activity of HR P
从图可知pH 值对酶活力的影响呈钟罩型曲线。酶的最适pH 是7. 0, 与水溶液中的最适pH 相同
。
F ig . 1 D ependence of HR P activity on the concen trati on of
guaiaco l and H 2O 2
1. 4 聚乙二醇的影响
图2表示辣根过氧化物酶的活力与PEG 含量之间的关系, 在甲苯2PEG 均一反应体系中, 随着PEG 含量的降低而酶活力上升, 但PEG 0. 1g m l 时, 同时当固定PEG , 随着PEG , 这排除了酶活力下降是因为水与PEG 的相对比值下降而引起的
。
F ig . 4 Effect of pH on HR P catalyzed reacti on in PEG
to luene
1. 7 酶在PEG -甲苯体系中的相对活力
以上结果表明, 选择合适的PEG 可以将酶分散在非极性有机溶剂甲苯中。在适宜的条件下, HR P 呈现较好的反应特性。我们发现在相同含水量和等浓度的PEG 条件下, HR P 在乙醇2PEG 、二氧六环2PEG 中测不出酶的活力。而在甲苯2PEG 反应介质体系中, 酶呈现很高活力且比HR P 在甲苯中的活力提高了10倍左右。
由此可见, 适宜分子量的PEG 可以与甲苯形成均一的介质, 酶很容易分散在该系统中。当PEG
F ig . 2 Influence of the concen trati on of PEG on the appar 2
en t activity of HR P
1. 5 含水量的影响
图3表示酶活力与体系中水含量之间的关系。由于所用的试剂是经过脱水干燥的, 因此可以认为体系中的水含量是外加的水量。从图可知, 当PEG 含量一定时, 水含量越高, 酶的活力也越高。水含量大于3. 5%时, 体系形成悬浊液且最终分层。1. 6 pH 值对酶活力的影响
含量减少, 水含量增加, HR P 在该体系中的活力上升。在该体系中pH 和底物浓度对酶活力也有明显影响。结论表明, pH 7. 0和20mm o l L 过氧化氢时酶活力最高。我们发现该反应体系具有如下优点:(1) 酶能够溶解在该体系中而且反应活性高, 比HR P 在甲苯中的活力提高了10倍左右; (2) 含水量低, 甚至可少于0. 5%。在如此低含水量下, 许多其他常用的有机相反应介质(如二氧六环等) 中根本测不到酶活; (3) 下游处理方便, 甲苯可蒸馏, PEG 则可水洗除去。操作简单方便。
图4表示pH 值对酶活力的影响。这些pH 值为加入到体系中的N a 2H PO 42柠檬酸缓冲液的pH
。
参考文献
ty acids . B iotechnology and B ioeng ineering . 1995, 45:187—195
6 O tam iri M , A dlercreutz P , M attiasson B . Comp lex fo rm ati on
betw een chymo tryp sin and ethyl cellulo se as a m eans to so lubi 2lize the enzym e in active fo rm in to luene . B iocataly sis , 1992, 6:291—305
7 Bell G, H alling P J , M oo re B D. B i ocatalyst behavi our in low
w ater system s . T rend s B iotechnol , 1995, 13:468—4738 Gup ta M N .
Enzym e functi on in o rganic so lvents .
E u r J
B ioche m , 1992, 203:25—32
1 Do rdick J S . Enzym atic catalysis in monophasic o rganic so l 2
vents . E nzym e M icrob T echnol , 1989, 11:194—211
2 Go to M , M iyata M , Kam iya N et al . N ovel surfactant 2coated
enzym es i m mobilized in po ly (ethylene glyco l ) m icrocap sules .
B iotechnology T echniques , 1995, 9(2) :81—84
3 Ko sk inen A M P , K libanov A M . E nzym atic R eactions in O r 2
g anicM ed ia , L odon :B lack ie A cadem ic and P rofessi onal , 1996,
26—38
4 Go to M , Sum ura H , A be K . N ovel p reparati on m ethod fo r sur 2
factant 2coated enzym es using w o em ulsi on .
T echniques , 1995, 9(2) :101—104
B iotechnology
9 P razeres D M F , Garcia F A P , Cabral J M S . A n ultrafiltrati on
m em brane bi o reacto r fo r the li po lysis of o live o il in reversed m i 2cellar m edia . 761—770
10 D ueruix A and Giege R . C ry stalliz ation of N ucleic A cid s and
P roteins , I RL :O xfo rd , 1992, 75
B iotechnology and B ioeng ineering ,
1993, 41:
5 Basheer S , M ogi K I , N akaji m a M . Surfactant 2modified li pase
fo r the catalysis of the interesterificati on of triglycerides and fat 2
A Novel Reaction M ed i a for Horserad Perox HRP )
Ca ta lysis i n J I AN G T ai , J I X Zhong 2Y i 3
(S hang hai of B , the A cad e my of S ciences , S hang hai 200031, Ch ina )
. ABSTRACT It rtan t to select favo rab le reacti on m edia fo r u se of enzym es in o rgan ic syn thesis In the p resence of PEG w ith a certain m o lecu lar w eigh t , to luene w as ab le to disso lve ho rseradish p erox i 2dase and the latter m ain tained a h igh activity . T he HR P reacti on conditi on s , such as rati o of PEG to luene , w ater con ten t , pH , and sub strate concen trati on w ere investigated . It w as found that the activity of HR P increased w hen PEG concen trati on w as low and w ater con ten t w as h igh .
In such a system , the enzym e
functi oned best at pH 7. 0, the concen trati on of H 2O 2and guaiaco l being 20mm o l L and 0. 1m o l L resp ec 2tively . U nder the sam e conditi on , no activity w as detected in the PEG ethano l and PEG di oxane sys 2. How ever in PEG tem s to luene system , HR P m ain tained a h igher activity and the activity w as ten 2fo ld m o re than that in to luene alone .
KEY WORD S R eacti on m edia ; po ly (ethyl glyco l ) (PEG ) ; ho rseradish p erox idase (HR P )
R eceived :M arch 12, 1998 A ccep ted :M ay 25, 1998
3Co rresponding autho r :Fax , [1**********]357; e 2m ail , zhongyi @sunm . shcnc . ac . cn
第30卷 第6期
1998年11月
A CTA B I OCH I M I CA et B I O PH YS I CA S I N I CA
V o l . 30,N o. 6
N ov . , 1998
研究简报
辣根过氧化物酶在一种新型有机介质中的催化反应
蒋太交 吉鑫松 袁中一3
(中国科学院上海生物化学研究所, 上海200031)
摘要 选择合适的酶反应介质体系, 是酶应用于有机合成的一个重要环节。利用适宜分子量的聚乙二醇(PEG ) 可以将辣根过氧化物酶(HR P ) 分散在甲苯中, 摸索了HR P 在聚乙二醇(PEG ) 2甲苯互溶体系反应的适宜条件, 即甲苯的比例、含水量、底物浓度等对酶活性影响, 结果发现PEG 含量越低, 含水量越高, 酶的活力越PEG pH 值、高; 酶在此体系中的最适pH 值为7. 0, 最适过氧化氢浓度为20mmo l L , 愈创木酚的浓度为0. 1mo l L 。在含水量、二氧六环、甲苯为主体反应介质体系中HR P 的活力, 结果发现乙醇PEG 含量相同条件下, 对比研究了以乙醇、2PEG 、二氧六环2PEG 中测不出酶活力, 观察到酶明显失活。而在甲苯2PEG 的反应介质体系中, 酶呈现很高活力且比HR P 在甲苯中的活力提高了10倍左右。
关键词 反应介质; 聚乙二醇(PEG ) ; 辣根过氧化物酶(HR 的应用大受限制[1, 2]。为此, 方法[3][4, ]或高聚物[6]的复合物以
外, 选择和优化酶的反应介质是另一个十分重要的途径。研究表明酶在有机相中的催化作用与反应介质有着密切联系。亲水性较强的有机溶剂对酶结构破坏大。处于疏水性较强的有机溶剂中, 酶则很难溶解, 内部传质受到限制。而反相胶束体系中的表面活性剂毒性大而且难以除去。为此, 我们设计了一个聚乙二醇(PEG ) 2甲苯互溶体系, 并验证了甲苯2PEG 体系中各种因素对辣根过氧化物酶反应的影响。
1. 1 反应介质体系的组成及酶活测定
PEG 1000纯化参照文献[10]的方法, 先将30g PEG 溶解在40℃的240m l 丙酮中, 然后容器浸
[9]
[4]
[1, 7, 8]
25℃进行, 所用底物H 2O 2和愈创木酚都以PEG 2甲苯为溶剂配制。先把5～10Λl 20g L HR P 溶液加入甲苯2PEG 体系中, 摇匀。然后加愈创木酚, 最后加H 2O 2引发反应。酶的活力以相对值表示。
1. 2 几种PEG 对反应体系形成的影响
在25℃下, 分别将一定量的PEG 加入到甲苯中, 发现PEG 600、PEG 1000和PEG 2000可以与甲苯形成均一的体系, 而分子量3000或以上的PEG 在常温下很难溶解于甲苯中。酶溶液不能够均匀分散在PEG 2000与甲苯体系中。而在同样条件下, 酶在PEG 600与甲苯体系中的活性很低。只有在PEG 1000与甲苯体系中, 酶能够充分分散且具有良好的反应特性。因此, 下面的研究都是以PEG 1000为材料的。1. 3 底物浓度的影响
入冰浴使PEG 沉淀下来。再往其中加240m l 乙醚并用砂芯漏斗过滤去溶液, 收集的沉淀用240～300m l 乙醚洗, 最后真空抽干和贮藏在干燥器中。制备PEG 2甲苯体系时, 取一定量的PEG 溶解在甲苯
在PEG 2甲苯体系中研究了辣根过氧化物酶的活力与底物的关系。图1表示辣根过氧化物酶活力与愈创木酚、过氧化氢浓度之间的关系。在过氧化氢为20mm o l L 时, 随着愈创木酚浓度增加, 酶活力也趋增大。当愈创木酚浓度超过0. 1m o l L 时, 酶活力随愈创木酚浓度增加而增大的趋势有所下降, 结果见图1。图1也表示了在愈创木酚浓度为0. 1m o l L 时, 酶活力与过氧化氢浓度的关系。酶
中, 配成每毫升甲苯中含有1g 纯化干燥的PEG 。
根据需要, 再将该溶液用甲苯稀释成不同PEG 含收稿日期:1998—03—12 接受日期:1998—05—253联系人:Fax , [1**********]7; e 2m ail , zhongyi @sunm . shc 2
nc . ac . cn
活力随过氧化氢浓度的增加而增加。当过氧化氢浓
度大于20mm o l L 后, 酶活力随过氧化氢浓度的增加而下降。这表明酶活力受到高浓度过氧化氢的抑制。本文发现过氧化氢的浓度为20mm o l L 时, 酶在PEG 2甲苯体系中的活力最高
。
F ig . 3 Effect of w ater amoun t of PEG to luene system on
the activity of HR P
从图可知pH 值对酶活力的影响呈钟罩型曲线。酶的最适pH 是7. 0, 与水溶液中的最适pH 相同
。
F ig . 1 D ependence of HR P activity on the concen trati on of
guaiaco l and H 2O 2
1. 4 聚乙二醇的影响
图2表示辣根过氧化物酶的活力与PEG 含量之间的关系, 在甲苯2PEG 均一反应体系中, 随着PEG 含量的降低而酶活力上升, 但PEG 0. 1g m l 时, 同时当固定PEG , 随着PEG , 这排除了酶活力下降是因为水与PEG 的相对比值下降而引起的
。
F ig . 4 Effect of pH on HR P catalyzed reacti on in PEG
to luene
1. 7 酶在PEG -甲苯体系中的相对活力
以上结果表明, 选择合适的PEG 可以将酶分散在非极性有机溶剂甲苯中。在适宜的条件下, HR P 呈现较好的反应特性。我们发现在相同含水量和等浓度的PEG 条件下, HR P 在乙醇2PEG 、二氧六环2PEG 中测不出酶的活力。而在甲苯2PEG 反应介质体系中, 酶呈现很高活力且比HR P 在甲苯中的活力提高了10倍左右。
由此可见, 适宜分子量的PEG 可以与甲苯形成均一的介质, 酶很容易分散在该系统中。当PEG
F ig . 2 Influence of the concen trati on of PEG on the appar 2
en t activity of HR P
1. 5 含水量的影响
图3表示酶活力与体系中水含量之间的关系。由于所用的试剂是经过脱水干燥的, 因此可以认为体系中的水含量是外加的水量。从图可知, 当PEG 含量一定时, 水含量越高, 酶的活力也越高。水含量大于3. 5%时, 体系形成悬浊液且最终分层。1. 6 pH 值对酶活力的影响
含量减少, 水含量增加, HR P 在该体系中的活力上升。在该体系中pH 和底物浓度对酶活力也有明显影响。结论表明, pH 7. 0和20mm o l L 过氧化氢时酶活力最高。我们发现该反应体系具有如下优点:(1) 酶能够溶解在该体系中而且反应活性高, 比HR P 在甲苯中的活力提高了10倍左右; (2) 含水量低, 甚至可少于0. 5%。在如此低含水量下, 许多其他常用的有机相反应介质(如二氧六环等) 中根本测不到酶活; (3) 下游处理方便, 甲苯可蒸馏, PEG 则可水洗除去。操作简单方便。
图4表示pH 值对酶活力的影响。这些pH 值为加入到体系中的N a 2H PO 42柠檬酸缓冲液的pH
。
参考文献
ty acids . B iotechnology and B ioeng ineering . 1995, 45:187—195
6 O tam iri M , A dlercreutz P , M attiasson B . Comp lex fo rm ati on
betw een chymo tryp sin and ethyl cellulo se as a m eans to so lubi 2lize the enzym e in active fo rm in to luene . B iocataly sis , 1992, 6:291—305
7 Bell G, H alling P J , M oo re B D. B i ocatalyst behavi our in low
w ater system s . T rend s B iotechnol , 1995, 13:468—4738 Gup ta M N .
Enzym e functi on in o rganic so lvents .
E u r J
B ioche m , 1992, 203:25—32
1 Do rdick J S . Enzym atic catalysis in monophasic o rganic so l 2
vents . E nzym e M icrob T echnol , 1989, 11:194—211
2 Go to M , M iyata M , Kam iya N et al . N ovel surfactant 2coated
enzym es i m mobilized in po ly (ethylene glyco l ) m icrocap sules .
B iotechnology T echniques , 1995, 9(2) :81—84
3 Ko sk inen A M P , K libanov A M . E nzym atic R eactions in O r 2
g anicM ed ia , L odon :B lack ie A cadem ic and P rofessi onal , 1996,
26—38
4 Go to M , Sum ura H , A be K . N ovel p reparati on m ethod fo r sur 2
factant 2coated enzym es using w o em ulsi on .
T echniques , 1995, 9(2) :101—104
B iotechnology
9 P razeres D M F , Garcia F A P , Cabral J M S . A n ultrafiltrati on
m em brane bi o reacto r fo r the li po lysis of o live o il in reversed m i 2cellar m edia . 761—770
10 D ueruix A and Giege R . C ry stalliz ation of N ucleic A cid s and
P roteins , I RL :O xfo rd , 1992, 75
B iotechnology and B ioeng ineering ,
1993, 41:
5 Basheer S , M ogi K I , N akaji m a M . Surfactant 2modified li pase
fo r the catalysis of the interesterificati on of triglycerides and fat 2
A Novel Reaction M ed i a for Horserad Perox HRP )
Ca ta lysis i n J I AN G T ai , J I X Zhong 2Y i 3
(S hang hai of B , the A cad e my of S ciences , S hang hai 200031, Ch ina )
. ABSTRACT It rtan t to select favo rab le reacti on m edia fo r u se of enzym es in o rgan ic syn thesis In the p resence of PEG w ith a certain m o lecu lar w eigh t , to luene w as ab le to disso lve ho rseradish p erox i 2dase and the latter m ain tained a h igh activity . T he HR P reacti on conditi on s , such as rati o of PEG to luene , w ater con ten t , pH , and sub strate concen trati on w ere investigated . It w as found that the activity of HR P increased w hen PEG concen trati on w as low and w ater con ten t w as h igh .
In such a system , the enzym e
functi oned best at pH 7. 0, the concen trati on of H 2O 2and guaiaco l being 20mm o l L and 0. 1m o l L resp ec 2tively . U nder the sam e conditi on , no activity w as detected in the PEG ethano l and PEG di oxane sys 2. How ever in PEG tem s to luene system , HR P m ain tained a h igher activity and the activity w as ten 2fo ld m o re than that in to luene alone .
KEY WORD S R eacti on m edia ; po ly (ethyl glyco l ) (PEG ) ; ho rseradish p erox idase (HR P )
R eceived :M arch 12, 1998 A ccep ted :M ay 25, 1998
3Co rresponding autho r :Fax , [1**********]357; e 2m ail , zhongyi @sunm . shcnc . ac . cn