颗粒性急性B淋巴细胞白血病形态学及流式散点图特点 颗粒性急性B淋巴细胞白血病形态学及流式散点图特点
张 斌1， 蔡艳霞2， 张素贞2， 佟长青3， 房胜春1， 周素涛1， 赵海军4
（1. 河北北方学院附属第一医院检验科， 河北 张家口 075000；2. 河北北方学院附属第一医院儿科，河北 张家口 075000；3. 河北北方学院附属第一医院血液科， 河北 张家口 075000；4. 河北省三河市医院检验科， 河北 三河 065200）
摘要：目的分析颗粒性急性B淋巴细胞白血病（G-ALL）形态学及流式散点图特点，提高对此类疾病的诊断水平。方法对确诊的1例少见G-ALL患者的形态学及流式散点图进行分析，总结其特点。结果G-ALL在形态学上多数具有髓系白血病细胞的特点，但过氧化物酶染色呈阴性，且此类细胞均高表达CD34。结论在诊断G-ALL方面，形态学具有明显的局限性，如需明确确诊必须依靠免疫学分型。该类原始淋巴细胞既有典型B淋巴细胞的免疫标志又有髓系原始细胞的形态学特点，因此单纯依靠细胞形态学无法或者难以明确诊断，这也是形态学容易误诊的最主要的原因。
关键词：颗粒性 B淋巴细胞白血病；形态学；流式散点图
颗粒性急性B淋巴细胞白血病（the granular of B-acute lymphocytic leukemia，G-ALL）是急性淋巴细胞白血病的一种特殊细胞形态，胞浆中可见到较多的颗粒，属于克隆性增生性疾病，是相对少见的急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）形态亚型[1]。我们在2015年诊断1例形态学高度相似急性髓系白血病，胞质呈灰兰色且易见细小颗粒，结合免疫组织化学及流式细胞技术免疫表型分析确诊为G-ALL，现报告该病例并结合文献讨论。
1 材料和方法
1.1 研究对象
患者男，67岁。主诉无力﹑气短﹑食欲不振就诊血液内科。体检：贫血貌，胸骨压痛明显，全身皮肤黏膜无黄染及出血点。右颈部可触及一肿大淋巴结，约（1×1.0）cm，质硬，无压痛，活动度差，余浅表淋巴结未触及。实验室检查：白细胞（white blood cell，WBC）13.93×109/L，血小板（platelet，PLT）2.0×109/ L，红细胞（red blood cell，RBC）2.41×1012/ L，血红蛋白（hemoglobin，Hb）84 g/L，淋巴细胞16.2%，单核细胞73.6%，中性分叶核粒细胞9.1%。WBC镜检分类结果：原始粒细胞60.0%，中性分叶核粒细胞 26.0%，成熟淋巴细胞 14.0%。
1.2 仪器和试剂
采用FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）及CELLquest软件分析不同抗原表达情况。抗CD3﹑抗CD2﹑抗CD5﹑抗CD7﹑抗CD19﹑抗CD20﹑抗CD22﹑抗CD9﹑抗CD23﹑抗CD71﹑抗CD14﹑抗CD13﹑抗CD33﹑抗CD34﹑抗CD38﹑抗人类白细胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）﹑抗髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）﹑抗CD79a﹑抗CD64﹑抗CD11b﹑抗CD10﹑抗CD25﹑抗Kappa及抗Lambda单克隆抗体均为美国Becton Dickson公司产品。BX53型普通光学显微镜为日本OLYMPUS公司产品。过氧化物酶（peroxidase，POX）染色试剂及瑞氏吉姆萨染色试剂购于珠海贝索生物技术有限公司。
1.3 骨髓细胞及外周血细胞形态检测
取新鲜骨髓液及外周血涂片，采用瑞姬染液（贝索公司）常温染色20 min，进行镜检分类。
1.4 免疫分型
治疗前采集患者骨髓1.5～2.0 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用4色免疫荧光法标记，检测CD45-多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCp）﹑CD19-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）﹑CD22-PE﹑CD20-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）﹑CD34 -FITC﹑CD38-PE﹑CD10-FITC﹑TdT-FITC﹑CD7-FITC﹑CD79a-PE﹑CD13-PE﹑CD33-PE﹑CD64-PE﹑CD14-FITC﹑MPO-FITC荧光强度的表达。
2 结果
2.1 外周血涂片
原始粒细胞占60%，此类细胞胞浆中可见细小颗粒；中性分叶核粒细胞占26%，成熟淋巴细胞占14%，PLT罕见，未见有核RBC。见图1。
图1 G-ALL外周血涂片（瑞氏染色 ×1 000）
注：箭头所示为原始淋巴细胞胞质中颗粒
2.2 骨髓涂片
骨髓增生明显活跃。细胞分类：原始细胞占88.5%，此类细胞多数胞体不规则，胞体大小不等，胞质较中等呈灰蓝色，染色中等嗜碱，易见伪足样突起，胞浆中多数可见细小颗粒，染色质疏松，核不规则有扭曲折叠，多数细胞可见明显核仁。计数200个有核细胞未见有核RBC，全片未见巨核细胞，PLT罕见。见图2。
图2 G-ALL骨髓涂片（瑞氏染色 ×1 000）
注：箭头所示为原始淋巴细胞胞质中颗粒
2.3 细胞组织化学染色（POX）
骨髓涂片POX染色为阴性。见图3。
图3 G-ALL骨髓涂片（POX染色×1 000）
注：箭头所指细胞为POX阳性细胞
2.4 骨髓基因筛查
BCR/ABL（P210）融合基因阳性。免疫分型结果散点图见图4。
2.5 骨髓免疫分型
异常细胞占90.25%，CD45-PerCp荧光强度呈不均一表达，SSC荧光强度呈中等强度表达，表达CD19（88.43%）﹑CD22（20.39%）﹑CD20（60.48%）﹑CD34（90.3%）﹑CD38（61.48%）﹑CD10（87.06%）﹑HLADR（86.58%）﹑CD9（48.87%）﹑CD79a（64.31%），不表达CD2﹑CD3﹑CD5﹑CD7﹑CD13﹑CD33﹑CD64﹑CD14﹑CD23﹑CD61﹑MPO。
2.6 治疗及转归
COP方案（环磷酰胺﹑长春新碱和强的松）化疗，患者化疗期间血象三系减低，其中WBC 为0.9×109/L﹑PLT为0～2.0×109/L﹑Hb为59～67 g/L，中间输注悬浮RBC及新鲜PLT未见明显疗效，化疗最后1 d合并感染，经1周抗感染及更换更高级别抗菌药物治疗未见缓解，同时合并心力衰竭，家属放弃治疗，出院预后较差，与文献报道[1]相符。
图4 免疫分型结果散点图
3 讨论
G-ALL是一种少见的ALL亚型，STEIN等[2]最早报道这一特殊形态的ALL，并于1983年将其命名为G-ALL，视为ALL的一个亚型。诊断标准为：5%以上的原始淋巴细胞中存在直径＞0.5 μm的1个或多个嗜天青颗粒或包涵体者。这种颗粒性质不明，可能起源于线粒体或溶酶体颗粒，也可能是发育异常的细胞器生成﹑融合或退化的结果[3]。也有部分患者的颗粒或棒状（AUER）小体通过电镜及免疫组织化学证实是免疫球蛋白聚集而成[4]。我们日常工作中在外周血涂片检查或骨髓细胞学检查中发现大量原始及幼稚细胞且胞质中易见明显颗粒，多数考虑急性髓系白血病，特别是原始细胞多数胞体不规则异形性明显，胞体大小不等，胞质较丰富呈灰蓝色，染色中等嗜碱，易见伪足样突起，染色质疏松，核不规则﹑有扭曲折叠，多数细胞可见明显核仁，胞质中有1个或多个嗜天青颗粒或包涵体。通过该病例发现，细胞质中有无可见颗粒并非只是髓系原始细胞的特点，而原始淋巴细胞胞浆中也不是绝对无颗粒存在。形态学在诊断G-ALL上具有明显的局限性，而真正确诊急性白血病必须最少结合组织化学染色及免疫学分型结果，特别是免疫学分型提供了有较强系列特异性及细胞发育阶段性的抗原表达，能够弥补形态学诊断的缺陷，增加诊断的准确性[5-6]。因白血病细胞形态具有不确定性，因此建议对于形态学发现或类似以上情况不要急于做出形态学方面的明确诊断，一定要参考免疫学分型提供的白血病细胞更详细的自身抗体特点，能反映细胞发育﹑分化的异常和混乱性[7]，才能明确诊断。即使没有条件进行流式细胞分析也应建议进一步检查，不应作出太明确的诊断，以免误诊。
通过对该病例流式散点图结果的分析，本研究发现CD45-PerCp荧光强度表达强度均显示不均一，且其荧光强度由中等强度到阴性表达，证明该类病理细胞的成熟程度不统一，且病理细胞的本质也不尽相同；SSC荧光强度呈较弱表达但强于典型淋巴细胞说明此类细胞胞质中颗粒细小而且较少，与形态学可见细小颗粒相对应；幼稚病理细胞CD34-FITC﹑CD38-PE﹑CD79a-PE荧光强度均为强表达说明该类细胞为较早期的原始细胞，同时高表达免疫标志CD10，提示该病例淋巴细胞起源于生发中心。本研究认为该类原始淋巴细胞既具有典型B淋巴细胞的免疫标志，又有髓系细胞的形态学特点，是该类疾病单纯依靠细胞形态学无法或者难以明确诊断的主要原因，也应该是形态学容易误诊的最主要原因。
综上所述，明确诊断G-ALL至少应有形态学及免疫组织化学染色2项检查相佐证。特别是对于形态学不典型，组织化学染色又没有特别明显提示诊断意义的病例，基层医疗机构形态学工作者应该拓宽思路，其形态学报告应该尽可能的对细胞形态学特点加以详细描述，同时作出形态学描述另加建议免疫分型的报告，以免误诊或作出不够精准的报告，这也可以为今后我们对该类细胞的认识提供数据资料。
参考文献：
[1] 田欣，李筱梅，赵敏，等. 颗粒性急性淋巴细胞白血病误诊为急性嗜碱粒细胞白血病一例[J]. 中华检验医学杂志，2011，34（5）：467-468.
[2] STEIN P，PEIPER S，BUTLER D，et al. Granular acute lymphoblastic leukemia[J]. Am J Clin Pathol，1983，79（4）：426-430.
[3] 王立维，高广智，张继红. 颗粒性急性淋巴细胞白血病实验室检查与分析[J]. 实用检验医师杂志，2011，3（1）：31-33.
[4] JUNEJA H S，RAJARAMAN S，ALPERIN J B，et al. Auer rod-like inclusions in prolymphocytic leukemia[J]. Acta Haematol，1987，77（2）：115-119.
[5] 沈元元，翟志敏，李庆，等. 急性混合细胞白血病38例临床研究[J]. 白血病·淋巴瘤，2008，17（5）：361-363.
[6] 黄静沁，许闪闪，李智，等. 白血病诊断综合分析的重要意义[J]. 检验医学，2014，29（11）：1158-1163.
[7] 范立权，陈伟琴，王剑飚，等. 12例急性双系列白血病细胞形态学与免疫表型分析[J]. 检验医学，2015，30（5）：446-449.
文章编号：1673-8640（2017）02-0118-04
中图分类号：：R446.1
文献标志码：：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.02.011
（收稿日期：2015-11-24）
（本文编辑：范基农）
作者简介：张 斌，男，1976年生，学士，副主任技师，主要从事血液学检验工作。
颗粒性急性B淋巴细胞白血病形态学及流式散点图特点 颗粒性急性B淋巴细胞白血病形态学及流式散点图特点
张 斌1， 蔡艳霞2， 张素贞2， 佟长青3， 房胜春1， 周素涛1， 赵海军4
（1. 河北北方学院附属第一医院检验科， 河北 张家口 075000；2. 河北北方学院附属第一医院儿科，河北 张家口 075000；3. 河北北方学院附属第一医院血液科， 河北 张家口 075000；4. 河北省三河市医院检验科， 河北 三河 065200）
摘要：目的分析颗粒性急性B淋巴细胞白血病（G-ALL）形态学及流式散点图特点，提高对此类疾病的诊断水平。方法对确诊的1例少见G-ALL患者的形态学及流式散点图进行分析，总结其特点。结果G-ALL在形态学上多数具有髓系白血病细胞的特点，但过氧化物酶染色呈阴性，且此类细胞均高表达CD34。结论在诊断G-ALL方面，形态学具有明显的局限性，如需明确确诊必须依靠免疫学分型。该类原始淋巴细胞既有典型B淋巴细胞的免疫标志又有髓系原始细胞的形态学特点，因此单纯依靠细胞形态学无法或者难以明确诊断，这也是形态学容易误诊的最主要的原因。
关键词：颗粒性 B淋巴细胞白血病；形态学；流式散点图
颗粒性急性B淋巴细胞白血病（the granular of B-acute lymphocytic leukemia，G-ALL）是急性淋巴细胞白血病的一种特殊细胞形态，胞浆中可见到较多的颗粒，属于克隆性增生性疾病，是相对少见的急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）形态亚型[1]。我们在2015年诊断1例形态学高度相似急性髓系白血病，胞质呈灰兰色且易见细小颗粒，结合免疫组织化学及流式细胞技术免疫表型分析确诊为G-ALL，现报告该病例并结合文献讨论。
1 材料和方法
1.1 研究对象
患者男，67岁。主诉无力﹑气短﹑食欲不振就诊血液内科。体检：贫血貌，胸骨压痛明显，全身皮肤黏膜无黄染及出血点。右颈部可触及一肿大淋巴结，约（1×1.0）cm，质硬，无压痛，活动度差，余浅表淋巴结未触及。实验室检查：白细胞（white blood cell，WBC）13.93×109/L，血小板（platelet，PLT）2.0×109/ L，红细胞（red blood cell，RBC）2.41×1012/ L，血红蛋白（hemoglobin，Hb）84 g/L，淋巴细胞16.2%，单核细胞73.6%，中性分叶核粒细胞9.1%。WBC镜检分类结果：原始粒细胞60.0%，中性分叶核粒细胞 26.0%，成熟淋巴细胞 14.0%。
1.2 仪器和试剂
采用FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）及CELLquest软件分析不同抗原表达情况。抗CD3﹑抗CD2﹑抗CD5﹑抗CD7﹑抗CD19﹑抗CD20﹑抗CD22﹑抗CD9﹑抗CD23﹑抗CD71﹑抗CD14﹑抗CD13﹑抗CD33﹑抗CD34﹑抗CD38﹑抗人类白细胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）﹑抗髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）﹑抗CD79a﹑抗CD64﹑抗CD11b﹑抗CD10﹑抗CD25﹑抗Kappa及抗Lambda单克隆抗体均为美国Becton Dickson公司产品。BX53型普通光学显微镜为日本OLYMPUS公司产品。过氧化物酶（peroxidase，POX）染色试剂及瑞氏吉姆萨染色试剂购于珠海贝索生物技术有限公司。
1.3 骨髓细胞及外周血细胞形态检测
取新鲜骨髓液及外周血涂片，采用瑞姬染液（贝索公司）常温染色20 min，进行镜检分类。
1.4 免疫分型
治疗前采集患者骨髓1.5～2.0 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用4色免疫荧光法标记，检测CD45-多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCp）﹑CD19-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）﹑CD22-PE﹑CD20-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）﹑CD34 -FITC﹑CD38-PE﹑CD10-FITC﹑TdT-FITC﹑CD7-FITC﹑CD79a-PE﹑CD13-PE﹑CD33-PE﹑CD64-PE﹑CD14-FITC﹑MPO-FITC荧光强度的表达。
2 结果
2.1 外周血涂片
原始粒细胞占60%，此类细胞胞浆中可见细小颗粒；中性分叶核粒细胞占26%，成熟淋巴细胞占14%，PLT罕见，未见有核RBC。见图1。
图1 G-ALL外周血涂片（瑞氏染色 ×1 000）
注：箭头所示为原始淋巴细胞胞质中颗粒
2.2 骨髓涂片
骨髓增生明显活跃。细胞分类：原始细胞占88.5%，此类细胞多数胞体不规则，胞体大小不等，胞质较中等呈灰蓝色，染色中等嗜碱，易见伪足样突起，胞浆中多数可见细小颗粒，染色质疏松，核不规则有扭曲折叠，多数细胞可见明显核仁。计数200个有核细胞未见有核RBC，全片未见巨核细胞，PLT罕见。见图2。
图2 G-ALL骨髓涂片（瑞氏染色 ×1 000）
注：箭头所示为原始淋巴细胞胞质中颗粒
2.3 细胞组织化学染色（POX）
骨髓涂片POX染色为阴性。见图3。
图3 G-ALL骨髓涂片（POX染色×1 000）
注：箭头所指细胞为POX阳性细胞
2.4 骨髓基因筛查
BCR/ABL（P210）融合基因阳性。免疫分型结果散点图见图4。
2.5 骨髓免疫分型
异常细胞占90.25%，CD45-PerCp荧光强度呈不均一表达，SSC荧光强度呈中等强度表达，表达CD19（88.43%）﹑CD22（20.39%）﹑CD20（60.48%）﹑CD34（90.3%）﹑CD38（61.48%）﹑CD10（87.06%）﹑HLADR（86.58%）﹑CD9（48.87%）﹑CD79a（64.31%），不表达CD2﹑CD3﹑CD5﹑CD7﹑CD13﹑CD33﹑CD64﹑CD14﹑CD23﹑CD61﹑MPO。
2.6 治疗及转归
COP方案（环磷酰胺﹑长春新碱和强的松）化疗，患者化疗期间血象三系减低，其中WBC 为0.9×109/L﹑PLT为0～2.0×109/L﹑Hb为59～67 g/L，中间输注悬浮RBC及新鲜PLT未见明显疗效，化疗最后1 d合并感染，经1周抗感染及更换更高级别抗菌药物治疗未见缓解，同时合并心力衰竭，家属放弃治疗，出院预后较差，与文献报道[1]相符。
图4 免疫分型结果散点图
3 讨论
G-ALL是一种少见的ALL亚型，STEIN等[2]最早报道这一特殊形态的ALL，并于1983年将其命名为G-ALL，视为ALL的一个亚型。诊断标准为：5%以上的原始淋巴细胞中存在直径＞0.5 μm的1个或多个嗜天青颗粒或包涵体者。这种颗粒性质不明，可能起源于线粒体或溶酶体颗粒，也可能是发育异常的细胞器生成﹑融合或退化的结果[3]。也有部分患者的颗粒或棒状（AUER）小体通过电镜及免疫组织化学证实是免疫球蛋白聚集而成[4]。我们日常工作中在外周血涂片检查或骨髓细胞学检查中发现大量原始及幼稚细胞且胞质中易见明显颗粒，多数考虑急性髓系白血病，特别是原始细胞多数胞体不规则异形性明显，胞体大小不等，胞质较丰富呈灰蓝色，染色中等嗜碱，易见伪足样突起，染色质疏松，核不规则﹑有扭曲折叠，多数细胞可见明显核仁，胞质中有1个或多个嗜天青颗粒或包涵体。通过该病例发现，细胞质中有无可见颗粒并非只是髓系原始细胞的特点，而原始淋巴细胞胞浆中也不是绝对无颗粒存在。形态学在诊断G-ALL上具有明显的局限性，而真正确诊急性白血病必须最少结合组织化学染色及免疫学分型结果，特别是免疫学分型提供了有较强系列特异性及细胞发育阶段性的抗原表达，能够弥补形态学诊断的缺陷，增加诊断的准确性[5-6]。因白血病细胞形态具有不确定性，因此建议对于形态学发现或类似以上情况不要急于做出形态学方面的明确诊断，一定要参考免疫学分型提供的白血病细胞更详细的自身抗体特点，能反映细胞发育﹑分化的异常和混乱性[7]，才能明确诊断。即使没有条件进行流式细胞分析也应建议进一步检查，不应作出太明确的诊断，以免误诊。
通过对该病例流式散点图结果的分析，本研究发现CD45-PerCp荧光强度表达强度均显示不均一，且其荧光强度由中等强度到阴性表达，证明该类病理细胞的成熟程度不统一，且病理细胞的本质也不尽相同；SSC荧光强度呈较弱表达但强于典型淋巴细胞说明此类细胞胞质中颗粒细小而且较少，与形态学可见细小颗粒相对应；幼稚病理细胞CD34-FITC﹑CD38-PE﹑CD79a-PE荧光强度均为强表达说明该类细胞为较早期的原始细胞，同时高表达免疫标志CD10，提示该病例淋巴细胞起源于生发中心。本研究认为该类原始淋巴细胞既具有典型B淋巴细胞的免疫标志，又有髓系细胞的形态学特点，是该类疾病单纯依靠细胞形态学无法或者难以明确诊断的主要原因，也应该是形态学容易误诊的最主要原因。
综上所述，明确诊断G-ALL至少应有形态学及免疫组织化学染色2项检查相佐证。特别是对于形态学不典型，组织化学染色又没有特别明显提示诊断意义的病例，基层医疗机构形态学工作者应该拓宽思路，其形态学报告应该尽可能的对细胞形态学特点加以详细描述，同时作出形态学描述另加建议免疫分型的报告，以免误诊或作出不够精准的报告，这也可以为今后我们对该类细胞的认识提供数据资料。
参考文献：
[1] 田欣，李筱梅，赵敏，等. 颗粒性急性淋巴细胞白血病误诊为急性嗜碱粒细胞白血病一例[J]. 中华检验医学杂志，2011，34（5）：467-468.
[2] STEIN P，PEIPER S，BUTLER D，et al. Granular acute lymphoblastic leukemia[J]. Am J Clin Pathol，1983，79（4）：426-430.
[3] 王立维，高广智，张继红. 颗粒性急性淋巴细胞白血病实验室检查与分析[J]. 实用检验医师杂志，2011，3（1）：31-33.
[4] JUNEJA H S，RAJARAMAN S，ALPERIN J B，et al. Auer rod-like inclusions in prolymphocytic leukemia[J]. Acta Haematol，1987，77（2）：115-119.
[5] 沈元元，翟志敏，李庆，等. 急性混合细胞白血病38例临床研究[J]. 白血病·淋巴瘤，2008，17（5）：361-363.
[6] 黄静沁，许闪闪，李智，等. 白血病诊断综合分析的重要意义[J]. 检验医学，2014，29（11）：1158-1163.
[7] 范立权，陈伟琴，王剑飚，等. 12例急性双系列白血病细胞形态学与免疫表型分析[J]. 检验医学，2015，30（5）：446-449.
文章编号：1673-8640（2017）02-0118-04
中图分类号：：R446.1
文献标志码：：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.02.011
（收稿日期：2015-11-24）
（本文编辑：范基农）
作者简介：张 斌，男，1976年生，学士，副主任技师，主要从事血液学检验工作。