无机优先污染物与DNA 之间作用的传感研究
摘要
本文通过研究，采用石墨烯-ZnS 量子点这种新型纳米材料修饰玻碳电极，由于其具有大的比表面积、高的载流子迁移率、良好的导电导热性、优异的机械柔性和化学稳定性，从而可以促进DNA 与电极之间的电子转移；以循环方波伏安法为测定方法，以HAc-NaAc 缓冲溶液为电解质溶液，考察了GO-ZnS/GCE复合电极在含有污染物Cr 6+的DNA 溶液中的电化学响应，实验结果表明：Cr 6+的加入降低了DNA 在0.7V 、1.0V 左右的氧化峰，该峰分别是腺嘌呤与鸟嘌呤的氧化峰，发现Cr 6+浓度在1.0×10-8mol/L~1.0×10-2mol/L时，峰降低的幅度ΔI与Cr 6+的浓度对数呈良好的线性关系，线性方程为：y=4.95045x+0.5025LgCCr 6+，线性相关系数为0.99875，该电极具有较好的稳定性与重现性。
关键词：石墨烯-ZnS 量子点；循环方波伏安法；DNA ；Cr 6+
SENSING STUDY INTERACTIONS BETWEEN INORGANIC
PRIORITY POLLUTANTS AND DNA
ABSTRACT
This paper studies the use of graphene-ZnS quantum dots This new nano-modified glassy carbon electrode material, because of its large surface area, high carrier mobility, good electrical and thermal conductivity, excellent mechanical flexibility and chemical stability resistance, which can facilitate electron transfer between DNA and the electrode; to cycle square wave voltammetry method for the determination to HAc-NaAc buffer solution as the electrolyte solution was investigated GO-ZnS/GCE composite electrode containing contaminants of Cr6 + the electrochemical response of the DNA solution, the experiment results show that: Cr6 + to decrease in the DNA in the 0.7V, 1.0V oxidation peak around the peak of the oxidation peaks of adenine and guanine, the concentration of Cr6 + was found at 1.0 × 10 - 8mol / L ~ 1.0 × 10-2mol / L, the peak amplitude ΔI with lower concentrations of Cr6 + logarithmic relationship was linear, linear equation: y = 4.95045x +0.5025 LgCCr6 +, the linear correlation coefficient of 0.99875, the electrode having a good stability and reproducibility.
Key words: graphene-ZnS quantum dots; cyclic square wave voltammetry; DNA;
Cr 6+
目 录
1 绪论……………………………….. ………………………………………………….……1
1.1课题研究的背景 ……………………. …………………………………………....…1
1.2 六价铬的检测方法方法…………………. …………………………………………. 1
1.2.1 分光光度法…………….. ………….. …………………………………………. 1
1.2.2 原子吸收法……………………………………………………………………. 1
1.2.3 液相色谱法…………………………….. ……………………………………. 1
1.2.4 试纸法………………………………………….. ……………………………. 1
1.3 DNA 电化学生物传感器介绍 ………………………………. ………………………3
1.4 DNA 电化学生物传感器应用 …………………….. …. ……………………………3
1.4.1 DNA 生物传感器检测病原基因….…. ………….. ……………………………3
1.4.2 DNA 生物传感器检测有机物………………………………………………..3
1.4.3 DNA 生物传感器对蛋白质的检测……………………………………....…. 4 1.4.3 DNA 生物传感器用于抗癌药物的开发、分析………….. …….. ……....…. 4
1.5 电化学方法的选择………………………. …………………………………………. .4
1.5.1 循环伏安法(CV)………………………….….………………………………4
1.5.2 循环方波伏安法(SWV+Cyclic)………………..………………..…………..5
1.5.3 交流阻抗（EIS ）………….. ……………………………………………….…. 5
1.6 石墨烯-量子点在本实验中的应用及其制备法…………………........………………….5
1.6.1 石墨烯-量子点的制备…………………….….………………………………4
1.6.2 石墨烯-量子点的应用与景…………...……..…………………………..…………..7
1.7论文研究的目的和主要内容 ……………. ………………………………………...9 2 实验部分………………………. …………………………………………………………10
2.1主要试剂………………………. ……………………………………........................10
2.2主要仪器………………………. ……………………………………........................10
2.3实验溶液的配制………………. …………………………………….......................10
2.3.1 0.1mol/L的pH=7的PBS 溶液的配制…………. …………….......................10
2.3.2 2.5mg/mL的DNA 溶液的配制……………………………….......................10
2.3.3 0.2mol/LpH=3.7-5.7的醋酸缓冲溶液的配制……………………...............10
2.3.4 0.1mol/L的NaOH 溶液的配制…………………………….........................10
2.3.5 0.1mol/L的H 2SO 4溶液的配制……………………………………................10
2.3.6 Cr 6+离子溶液系列浓度的配制……………………………….......................10
2.3.7 Starter3C 型实验室pH 计的校准……………………………........................10
2.4实验过程…………………………………………………………………...................10
2.4.1 石墨烯-ZnS 量子点的制备……………………………….. …….............12
2.4.2 电极的预处理………………….…………………….. …..............................12
2.4.3 石墨烯量子点的附着……………..…………....…………….….................12
2.4.4 玻碳电极的电化学预处理…………………….….. …………………..........12
2.4.5 循环方波伏安法（SWV+Cyclic）对含DNA 溶液的响应测定..................... ....12
2.5实验条件的优化…………………………. …………………………........................13
2.5.1 纳米材料的选择……………………….. …………………………….............13
2.5.2 预处理介质的选择………………….. …………………..............................13
2.5.3电解质溶液的选择……………....…………………….. ……….….................13
2.5.4 HAc-NaAc 缓冲溶液最佳pH 的选择……………. ………………..........13
2.5.5 方波振幅的选择……................................................................................. ....13
2.5.6 方波频率的选择…….................................................................................. ....14
2.5.7 Cr 6+浓度的测定……................................................................................... ....15
3 结果与讨论……………………………….........................................................................13
3.1 不同纳米材料修饰对电极的电化学行为的影响……...……………..........................16
3.2 不同预处理介质对电极的电化学行为的影响…………….. …….........................17
3.3 不同电解质溶液对电极的电化学行为的影响……………...........................................18
3.4 HAc-NaAc. 缓冲溶液pH 对电极的电化学行为的影响……...................................18
3.5不同方波频率、方波振幅对电极的电化学行为的影响…….....................19
3.6 不同Cr 6+溶液浓度对电极电化学行为的影响..........................................................20
3.7重现性的测定………………………………….... …………………......................21
3.8回收率的测定……………………………. ………….............................................22
4 结论………………………………………………..........................................................24
参考文献………………………………………………..........................................................25
致谢……………………………………………………..........................................................27
1 绪论
1.1 课题研究的背景
铬在自然界中分布非常广泛，无论是土壤、大气还是生物体内都含有铬元素
[1]。随着我国经济的发展，军事、机械、化工、建筑及其其他行业对铬需求的不断增加，使得铬在使用与生产的过程中，也逐渐被排放到自然环境中，造成铬在自然界中不断累积，尤其是土壤中的铬含量越来越多，不断累积的铬，对土壤环境以及土壤中存在的各种微生物和动植物都会产生了一定程度的危害[2]。铬及其其他重金属的一大特征就是不能够在特定的条件时间下可以被微生物等降解为无危害的小分子，铬在自然环境中也不能通过自身降解，恰恰相反，它们会富集在动植物或微生物的体内，对生物体的正常生理活动造成不同程度的影响，不仅如此，它们在自然界中还可能会转化成为危害性更大的重金属有机化合物。
铬属于人体必需的微量元素。对于生物体有不可或缺的作用：它可以辅助胰岛素吸收葡萄藕塘、预防动脉粥样硬化、促进蛋白质代谢和生长发育等。但如果一次性摄入铬的量过多，则会造成铬中毒。铬中毒一般都是由六价铬引起。对生物体而言，因为一次性摄入的量有区别，加之摄入途径不一，所以具体的临床反应也有差异。铬对人体可以造成非常大的损害，其作用主要表现在：可以引起皮肤的溃烂和过敏、破坏呼吸道、对人的眼睛也可造成一定程度的的损伤、如果经口摄入，将会对胃肠道的损伤、除此之外铬还有一定的致癌作用等[3]。
1.2 六价铬的检测方法
铬对人类危害的影响已经越来越大，所以亟待一种快捷、简便、廉价、准确可行的检测手段，目前对六价铬的检测方法主要有以下几种：
1.2.1 分光光度法
分光光度法测定水中的铬(Ⅵ) 包括流动注射光度法、荧光光度法和催化动力学光度法等，该法的测定原理主要是利用铬(VI)的氧化性，使其中加入的某种试剂显色或褪色，在特定的波长下，根据铬 (VI)浓度与吸光度呈一定的线性关系测定铬(VI)含量[4-6]。据报告，该法的测定范围大概在0～0.6μg/L，如果实验中通
过加入适当的掩蔽剂、增敏剂、乳化剂、控制反应条件等，可使灵敏度更高，这样得到的检出限将更低。但就整体而言，该方法重现性较差，选择性不强，而且很难实现在线、及时的检测。
1.2.2 原子吸收法
原子吸收光谱法(AAS)测定铬，原子吸收法测定物质只能以元素分类，所以它只能测定总铬含量，而无法确定其价态。通过先测定标准溶液制定标准曲线，得到线性方程，然后确定待测液的吸光度，通过线性方程就可以计算出铬(VI)的量。目前原子吸收法测定铬最常用的方法，主要包括石墨炉原子吸收光谱法(ETAAS) 和火焰原子吸收光谱法(rAAS)。它的检测限可以达到出限为0.72μg/L[7]，法测定水中微量铬(VI)具有快速、灵敏等优点，但是该法的前处理步骤复杂，除此之外，该方法检测成本较高。
1.2.3 液相色谱法
液相色谱指以液体作为流动相，依据待测即待分离的物质在固定相与流动相之间分配系数不一致，如果待测物质在液相中传递，它将会在流动相与固定相之间达到平衡，由于不同样品不同含量的待测物质在固定相中的保留时间有所不同，在固定相中流出时间不一致，据此可对样品进行分离与检测。金[8]使用液相色谱法对水中的铬离子进行检测，以C18柱作为色谱柱，以二苯卡巴肼溶液作为流动相，以543nm 作为吸收波长，进行测定。通过液相色谱法，检测限为
0.002mg/L，该方法测定铬快速稳定，并且准确率高，线性良好。总的来说该方法分析灵敏性好、应用范围广，但是它的价格比较昂贵，一般只能用作实验室检测。
1.2.4 试纸法
该方法原理参照二苯碳酰二肼分光光度法，显色原理见下式：
试纸法是一种非常便捷的检测手段，该法可检测100 mg/L以下铬离子浓度，如果检测中发现样品浓度高于该值，可对样品进行一定的处理，如可将它按一定的比例稀释浓度之后再做检测[9]。这种法的优点是测定速度快、检测方便。但在
光照条件下不稳定，而且检测限较低，并且检测的精确度不高。
1.3 DNA电化学生物传感器介绍
本文将介绍一种全新的方法-DNA 电化学生物传感器法检测溶液中的六价铬离子。六价铬离子与DNA 相互作用，破坏DNA 结构，然后通过电化学信号表达作用结果，发现电化学信号的响应与污染物的浓度对数之间存在着某种线性关系，以此来确定污染物的浓度。
生物传感器的基本作用机理是通过生物的催化和免疫，在生物领域中被广泛应用。尤其近十年来，生物技术与生物分子学发展速度越来越快，人们开发了通过DNA 与污染物相互作用，产生响应，制作了DNA 生物传感器。这种传感器能用于无机污染物、有机污染物、蛋白质、核酸序列等的检测与研究，该生物传感器将会在环境污染监测起到非常重要的作用，也是目前的发展趋势所向[10]。
1.4 DNA生物传感器的应用
1.4.1 DNA生物传感器检测病原基因
人类之所以会产生疾病，其主要原因之一就是因为病毒与细菌的感染。DNA 生物传感器发展越来越迅速，它不仅可以进行基因疾病的诊断，还可用于研究DNA 与病源基因的研究；除此之外，还可用于DNA 作用机理的分析，通过研究分析，可以进行特定药物的设计合成，将做到真正的对症下药[11]。Lin [12]等通过共价结合的方法，将DNA 探针修饰在玻碳电极上，此DNA 与互补链进行杂交，这一过程将引起溶液中亚甲基蓝指示剂产生响应，电流峰值将产生明显改变，依据这一原理，可以对慢性骨髓性白血病病毒基因进行诊断，线性范围为
1.25×10-7mol/L~6.25×10-7mol/L。检测限为5.9 × 10-8mol/L。
1.4.2 DNA生物传感器检测有机污染物
目前世界上存在数量最多的物质就是有机物，它们也是被微生物最难以降解的物种之一，有机物对人类的危害众所周知，造成的环境问题也日益凸显。针对环境中有毒有害的有机分子，DNA 生物传感器可以提供一种快速、简便、准确的方法，甚至可以进行实时监控 [13]。Wang [14]将DNA 固定在玻碳电极表面，作为工作电极，通过污染物与DNA 相互作用，可以检测出环境中有害的物质，该方法利用键合作用，将芳香胺与双链DNA 固定在一起，设计了一种新型的电化学生物传感器，该传感器可用于芳香胺类化物的检测，检测限达到1×10-7mol/L。
DNA 生物传感器以其专一性、分析速度快、检测结果准确、可实行实时在线监测等优势为生命科学的研究开创了一片新的领域，为生物分子的研究提供了一种全新的方法。截至目前，DNA 生物传感器已被广泛应用在动、植物、蛋白质、食品、药品、水、病毒、各类污染物的检测中，尤其是在检测无机、有机污染物、核酸、蛋白质等方面已取得显著成效。随着生物信息学、计算机技术与基因技术、仿真技术的不断发展以及人们对生物体、DNA 不断认识与研究，以及某些技术的不断创新，DNA 生物传感器将逐步趋向自动化、商品化。
1.4.3 DNA生物传感器对蛋白质的检测
在以核酸适体作为探针进行特异性识别蛋白质的检测等方面，DNA 生物传感器的应用越来越广泛，DNA 生物传感器的出现为蛋白质的分析检测与研究提供了一种切实可行且高效的方法。在对蛋白质的检测过程中，利用核酸适体对蛋白质进行在线检测，，该方法可实现蛋白质在活细胞上的测定。除此之外，还有关于利用荧光共振能量转移凝血酶方面的研究。Fan [15] 建立了一种采用磁球分离、金胶标记的金属免疫分析法，该法可测定免疫球蛋白G 。实验数据显示，DNA 生物传感器在蛋白质的分析研究方面具有非常好的前景，且该种方法在实验中的优势表现的非常明显，它将为医学临床、疾病诊断、药物设计方面提供非常有利的支持。
1.4.4 DNA生物传感器用于抗癌药物的开发、分析
抗癌药物作用机理主要包括以下五个方面：影响核酸的合成、影响蛋白质的合成、直接破坏DNA 结构、嵌入DNA 中干扰模板作用、影响体内激素平衡。其中数直接作用于DNA 的药物居多。因此，想要开发新的抗癌药物[10]必须要认识、了解核酸，DNA 生物传感器为抗癌药物的设计、开发、作用机理、药物分析方面提供了一种快速、准确、可行的分析方法，它的应用日益受到人们重视。以特定序列的DNA 作为传感器的探针，加入一定量的指示剂，用该传感器检测DNA 与抗癌药物相互作用产生的信号，通过电化学的方法来表征这种信号，为抗癌药物的研发提供了一种切实有效的方法。
作为核糖核酸的重要组成部分，腺嘌呤与鸟嘌呤在细胞代谢调节、能量供应与酶促催化及神经递质信号传递等很多方面都有重要体现。腺嘌呤与鸟嘌呤有电化学活性，容易发生氧化还原反应，在含有DNA 的溶液中加入重金属六价铬离
子溶液，施加一定的电压之后，它会破坏DNA 的结构，由于DNA 双螺旋外侧的脱氧核糖的作用，阻碍了内侧的碱基发生电化学反应，导致A(腺嘌呤) 与G(鸟嘌呤) 的电化学信号下降，且不同浓度的污染物对DNA 结构造成的破坏不一样，据此，我们可以根据鸟嘌呤与腺嘌呤电化学信号的改变可以确定污染物与的浓度。
1.5 电化学方法的选择
1.5.1 循环伏安法（CV ）
基本原理：给工作电极上施加一个等腰三角形脉冲电压得到的曲线包括全部分电压扫向阴极时产生的还原峰，此时发生的反应为电极上某种具有活性的物质被还原，其中也包括了当后半部分电压扫向阳极时在阴极上产生的氧化峰，此时电极上被还原产物又重新被氧化。因此，完成一个循环脉冲扫描，电极上将发生一次氧化反应和一次还原反应，所以该法被称为循环伏安法。利用循环伏安法扫描出的图谱被称为CV 图。利用循环伏安法还可检测物质的可逆性，若某种物质可逆性差，则其CV 图对称性差，即它的氧化峰与还原峰峰高不一致。一般在循环伏安法中，玻碳电极、金电极和石墨电极等多作为工作电极。
应用：循环伏安法在电化学研究方面应用极为广泛，可用于电极反应的机理、电化学-化学耦联反应、动力学参数和性质的研究。其中最主要的两种用途分别为：a. 电极反应机理的判断：循环伏安法一般被用来作定性分析，也可以用来做定量分析，通过电极活性面积、交换电流密度、电极表面吸附物的覆盖度及交换电流密度等参数可判定电极表面微观反应过程及反应机理；b. 电极可逆性的判断：由于循环伏安法的图谱扫向是分支为阴极与阳极两个方向，我们只需观察CV 图的氧化峰与还原峰的对称情况，就可以判断物质在电极表面的可逆性，如果反应时不可逆的，则CV 图不对称。。
1.5.2循环方波伏安法(SWV+Cyclic)
基本原理：在快速扫描的阶梯电压上叠加较大振幅的方波电压，记录方波正半周末期与方波负半周末期的电流的差值，良好的消除了充电电流，又能在很短的时间记录出电流-电势伏安图，它的灵敏度稍高于脉冲极谱法。
1.5.3 交流阻抗（EIS ）
对电极系统施加不同频率的小振幅正弦波扰动信号，由电极系统的响应与扰动信号之间的关系得到的电极阻抗，模拟电极的等效电路，进一步分析电极系统
所包含的动力学过程及其机理，由等效电路中有关元件的参数值估算电极系统的扩散传质、电极双电层电容、电荷转移等参数。
1.6 石墨烯-量子点在本实验中的应用及其制备方法
本课题拟制备一种新型DNA 电化学生物传感器来检测水中的微量六价铬离子，通过查阅文献和相关资料，发现在电极上负载石墨烯-量子点对电极进行修饰，会促进DNA 与电极之间的电子转移，使实验效果明显改善。
当半导体材料的尺寸小于其激子波尔半径时，电子和空穴的运动受到限制，呈现量子化的特点，这样的纳米结构称为量子点[16]。量子点是零维纳米材料，三维尺寸都在100nm 以下，由于其内部的电子被束缚在一个很小的空间内，所以量子点表现出一些独特的性质，如它的生物相容性好、具有表面效应、小尺寸效应等，所以它被广泛用于荧光探针与能量转换方面。选择石墨烯-量子点复合纳米材料，是因为石墨烯-量子点复合材料作为一种功能材料，综合了石墨烯材料与量子点的优势，这种复合材料在室温下导电、导热性好生物相容性、力学强度大。因此它才会被用于电极的修饰[17]。
1.6.1 石墨烯-量子点的制备
从整体而言石墨烯-量子点的合成思路分为两大类[18-19]：自上而下的方法和自下而上的方法。自上而下方法是通过物理或化学法将大尺寸的石墨烯片进行―裁剪‖，使其成为成小尺寸的石墨烯量子点的方法。主要包括水热法、溶剂热法、电化学法、化学剥离碳纤维法、微波辅助法等。这类方法步骤相对简单、产率较高，也是目前应用最多的一类方法。自下而上的方法则是以小分子为前体，通过一步或多步化学反应制得，这类方法可以准确控制石墨烯-量子点的尺寸与形状，但步骤繁琐而且操作过程复杂。还有一些特殊的方法用于石墨烯量子点的合成，例如钌催化富勒烯C 60开笼法。
水热法
这种方法主要有四个步骤：①首先将氧化石墨烯(GO)热还原为石墨烯片(GSs)；②再在浓硫酸和浓硝酸组成的混酸中氧化GSs ，这一步不仅可以得到更小片的GSs ，而且在GSs 的边缘和平面上引入含氧官能团(C=O，COOH ，OH 和C-O-C) 以使GSs 更易溶于水；③然后将氧化后的GSs 在碱性条件(pH=8)下进行水热处理；④将水热后的滤液透析提纯后就制得GQDs 。
◆ 溶剂热法
溶剂热法是制备GQDs 中较为常用的一种方法。水热法则是以水作为溶剂，该种方法以有机物作为溶剂。具体实验制备过程如下：首先以改进的Hummers 法[20]制备的GO 为起始原料，用N ，N-二甲基甲酰胺(DMF)分散制得得GO ，使GO/DMF浓度为27 mg/mL(在其他浓度5-50 mg/mL亦可用于制备GQDs ，这一比率的选择主要取决于GO 的氧化程度) ，并将其超声分散30分钟(120 W，100 Hz)形成均一的悬浮液。然后将GO/DMF悬浮液转移至聚四氟乙烯内衬的反应釜内
(30mL)，在200℃加热8 h。待反应过后，反应釜冷却至室温，反应釜内衬里的悬浮液包含棕色悬浮液和黑色沉淀，除去黑色沉淀后的棕色悬浮液即为GQDs 的DMF 分散液。通过旋转蒸发除去溶剂可以得到GQDs 固体样品，产率约为1.6％。
◆ 电化学法
电化学法处理石墨晶体是制备荧光碳点是一种简便和有效的方法。首先通过氧等离子体处理大片石墨烯薄膜以增加其亲水性，然后再通过多次电化学循环伏安(CV)切割制备得到GQDs 。具体而言，以石墨烯薄膜作为工作电极，Ag/AgCl作参比电极，铂丝作对电极，电位窗口设置为±3V ，在0.1 M磷酸盐缓冲液(PBS)中连续CV 扫描，将得到的悬浮液过滤后通过纤维素酯膜袋透析后就得到水溶性的发绿色荧光的GQDs 。这种方法制备的GQDs 呈均一的单分散态，直径约3～5μm，厚度约1~2 nm(即三个石墨烯层) 。这种方法的优点是制备的GQDs 尺寸比较窄。
◆ 化学剥离碳纤维发
该法是通过化学处理，逐层剥离碳源，从而制得GQDs 。通常情况下，碳源的选择是树脂基碳纤维，利用酸处理碳源，将纤维中堆垛的石墨剥离，这样便可制得大量不同粒径分布的GQDs 。该法制备的GQDs 尺寸分布在1～4 nm，由1～3层石墨烯组成，结晶度高，并且边缘结构大多数成锯齿状。化学剥离碳纤维法的主要优点是实验过程简单，操作易行，实验条件要求低，而且作为初始原料的碳纤维价格相对便宜。
◆ 微波辅助法
微波辐照通过给反应介质提供快速、均匀的加热条件，从而使产率和纯度大大提高、反应时间也大大缩短。利用微波辅助快速一步合成量子产率为11.7％的
黄绿色荧光的GQDs(gGQDs)，经过硼氢化钠还原后变为蓝色荧光GQDs(bGQDs)，其量子产率高达22.9％。首先通过改进Hummers 法制备了氧化石墨烯，然后将其分散在硝酸和硫酸组成的混酸中，再在微波炉中微波辐照3小时，然后将混合物超声后用氢氧化钠调pH 至8，最后进一步分离透析后就制备了发黄绿色荧光的gGQDs 。透析之前，如果将得到的滤液进一步用硼氢化钠还原在室温下还原就可以得到蓝色荧光的bGQDs 。
1.6.2 石墨烯量子点得应用与前景
作为一种新型功能材料，石墨烯-量子点综合了石墨烯材料导电导热能力强、力学强度大、比表面积大与量子点的生物兼容性好等优势，在传感器的制作、太阳能电池方面、光电材料等领域有非常好的发挥前景。
1、太阳能电池。zhou [21]等成功地利用单元叠加的方法，制作出了一种新型的层状石墨烯-QDs 电子迁移体系。通过实验发现，光电流较之前有了非常明显的提高，主要是因为该石墨烯-量子点纳米材料具有非常优异的收集与转移电子的能力，这种层状的纳米材料将会广泛应用于太阳能电池捕光器件方面。
2、生物成像。Liu [22]等首先合成黄色焚光石墨稀量子，不经过任何表征修饰处理，直接将它用来标记在干细胞上，干细胞的选择以此采用胰腺祖细胞、神经球细胞和心脏祖细胞，将它们与石墨炼量子点一起孵育，在焚光共聚焦显微镜下观察呈像，因为石墨烯-量子点的修饰，可清洗观察到三种干细胞的形态。
3、传感器。Zhao [23]等发现了一种制备石墨烯/Cdse NPs多层膜的简单方法，由于这种膜的电子迁移能力非常强，所以它将会被广泛应用于生物、化学等领域。通过构建功能化石墨烯与带正电的CASe NPs光敏膜，发现这种膜的光敏性能非常好，对光的响应能力极为敏感，通过石墨烯-量子点的组合性能，该光敏膜在光电化学生物传感器方面将会有非常好的应用前景。
石墨烯-量子点复合纳米材料很好的结合了两种材料各自的优势，其具有优异的光电热转化性能，在电子转移效率和抑制载流子再复合方面发挥出了它独特的性质。虽然现阶段对石墨烯-量子点复合纳米材料的研究还在初步期，但是随着科学的发展与技术的提升，相信对石墨烯-量子点复合材料的研究将会越来越多，其生物、化学、光伏等领域的应用前景将非常好。
1.7 论文研究的目的与主要研究的内容
通过查阅大量文献资料，并结合本实验室的条件，准备构建制作一种新型、简便、准确可靠的DNA 生物电极，将它应用于环境检测方面。本论文拟开展如下研究工作：
（1）通过溶剂热法制备石墨烯-ZnS 量子点，并将它修饰在工作电极-玻碳电极的表面，它的修饰将会大大提高电极的工作效率。
（2）采用循环方波伏安法对含有DNA 的溶液进行测定，通过计算比较在有无污染物的情况下，电化学响应信号的改变，及其污染物浓度改变时，响应信号的改变，找出其中对应的线性关系，分析DNA 与污染物作用的机理。
（3）采用控制变量法，用循环方波伏安法对含有DNA 的溶液进行测定，找出支持最佳电解液、最佳pH 值、最佳方波振幅、最佳方波频率等，完成实验条件的优化，在最佳实验条件下，对标准溶液进行测定，作出标准曲线，确定线性关系和线性相关系数的大小。
2 实验部分
2.1 主要试剂
鲱鱼精DNA(分析纯；Sigma D-315)、 氧化石墨烯（自制）、
Na 2S (分析纯) 、Zn(Ac)2 （分析纯）、K 2Cr 2O 7、NaH 2PO 4. 2H2O 、Na 2HPO 4. 12H 2O 、HAc 、NaAc(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 、抛光粉：Al 2O 3。
2.2 主要仪器
超声波清洗器（KQ3200B 型，上海司乐仪器有限公司）、实验室PH 计（PHSJ-3F 型，上海雷磁仪器厂）、电子天平（BS124S 型，北京赛多利斯仪器系列有限公司）、微量进样器（10µL ，上海医用激光仪器厂）、电化学工作站（CHI660A 型 Gaoss Union ）、吸量管（1mL 2根，10mL 1根）、217型双盐桥参比电极（甘汞电极，金属为Hg ，难溶盐为Hg 2Cl 2(s)，易溶盐溶液为KCl 溶液，电极可表示为Cl -/ Hg 2Cl 2(s)/Hg，上海康宁电光技术有限公司）、辅助电极：铂金CHI115电极、工作电极：玻碳电极
2.3 实验溶液的配制
2.3.1 0.1mol/LpH=7的PBS 溶液的配制
（1）0.1mol/L的Na 2HPO 4溶液的配制
精确称量Na 2HPO 4. 12H 2O 晶体17.907g ，在50mL 的烧杯中溶解，然后转移至500mL 的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀静置备用。
（2）0.2mol/L的NaH 2PO 4溶液的配制
精确称量NaH 2PO 4. 2H 2O 晶体7.8000g ，在50mL 的烧杯中溶解，然后转移至500mL 的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀静置备用。
（3）pH=7的PBS 溶液的配制
取干净的烧杯，在其中加入20mLNaH 2PO 4溶液，然后在其中逐渐滴加Na 2HPO 4溶液，用PHSJ-3F 型pH 计调节至pH=7为止。
2.3.2 2.5mg/mL的DNA 溶液的配制
精确称量鲱鱼精-DNA 固体0.2500g ，在50mL 的烧杯中溶解，然后经过超
声仪超声溶解至溶液呈澄清状，再转移至100mL 的容量瓶中，稀释至刻度，放入冰箱备用。
2.3.3 0.2mol/LpH=3.7-5.7的醋酸缓冲溶液的配制
（1）0.2mol/L的HAc 溶液的配制
于100mL 的烧杯中加入20mL 去离子水，精确量取5.7140mL 冰乙酸，沿烧杯壁缓慢倒入，边倒边用玻璃棒搅拌，之后将溶液转移至500mL 容量瓶，稀释至刻度，摇匀静置备用。
（2）0.2mol/L的NaAc 溶液的配制
精确称量NaAc 固体（分析纯）8.2030g ，在100mL 的烧杯中加入30mL 去离子水溶解，再转移至50mL 的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀静置备用。
（3）不同pH 醋酸缓冲溶液的配制
取干净的烧杯，在其中加入20mLHAc 溶液，然后在其中逐渐滴加NaAc 溶液，用PHSJ-3F 型pH 计调节至pH=3.7、3.9、4.1、4.5、4.9、5.3、5.7，分别保存，待用。
2.3.4 0.1mol/L的NaOH 溶液的配制
精确称量NaOH 固体（分析纯）0.4000g ，在100mL 的烧杯中加入20mL 去离子水溶解，再转移至100mL 的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀静置备用。
2.3.5 0.1mol/L的H 2SO 4溶液的配制
于100mL 的烧杯中加入20mL 去离子水，精确量取1.5000mL 冰乙酸，沿烧杯壁缓慢倒入，边倒边用玻璃棒搅拌，之后将溶液转移至500mL 容量瓶，稀释至刻度，摇匀静置备用。
2.3.6 Cr6+离子溶液系列浓度的配制
准确称取分析纯K 2Cr 2O 72.9418g ，配制成100mL 的溶液，得到1×10-1mol/L的六价铬离子溶液，之后依次稀释成1×10-2mol/L；1×10-3mol/L；1×10-4mol/L；1×10-5mol/L；1×10-6mol/L；1×10-7mol/L的梯度溶液。2.3.2 缓冲溶液的配制
2.3.7 Starter3C型实验室pH 计的校准
把E-201-C pH复合电极浸入pH=6.86和pH=4.01（25ºC ）的磷酸盐溶液中，按下―校准‖键，标定完成；关机后仍然有效，不要再进行校准。
2.4 实验过程
2.4.1 石墨烯-ZnS 量子点的制备
本实验采用溶剂热法制备石墨烯-ZnS 量子点：将50mg 的GO （氧化石墨烯）加入100mL 浓度为0.1mg/mL的乙酸锌的溶液中，用氨水调节pH 值至9左右，然后再滴加0.1mg/mL硫化钠溶液，140℃下水热反应10h ，制备了石墨烯一硫化锌(GO-Zns)纳米复合材料。
2.4.2电极的预处理
以直径为2mm 玻碳电极作为工作电极，在麂皮上依次放0.5和0. 05μm的Al 2O 3作为抛光粉，在此麂皮上抛光电极表面约5min ，然后分别用无水乙醇和去离子水超声清洗10min 取出后用去离子水淋洗干净，用高纯氮气吹干待用。
2.4.3 石墨烯量子点的附着
通过微量注射器将石墨烯-ZnS 量子点溶液滴加到电极表面，用热风机吹干待用。
2.4.4 波碳电极的电化学预处理
在电解池中加10m0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法扫描电极至稳定状态，对电极进行活化(方法：循环伏安法(CV、One vertex/multi)，参数设置：初始点位：0.5V ，顶点电位：-0.1V ，采样间隔：0.001V ，扫描速度：0.05V/s，循环次数：5，静置时间：5.0s ，自动滤波，灵敏度：10μA/V)，记为GCE(ox)。
2.4.5 循环方波伏安法（SWV+Cyclic）对含DNA 的响应测定
在一个新的电解池中加入9mLPBS+1mLDNA混合液，用循环/方波伏安法(SWV+Cyclic)( 参数选择：初始电位：0.2V ，顶点电位：1.5V ，终止点位0.2V ，方波振幅：0.04V ，电位增量：0.004v ，方波频率：10.0Hz ，静置时间：2.0s ，自动滤波，灵敏度：100μA/v) 测定只含有DNA 时电极的响应峰高。
取出电极，再在一个新的电解池中加入8mLPBS+1mLDNA+1mLCr6+溶液，选用循环方波伏安法(参数设置与不加污染物一样) 检测有污染物存在时电极对DNA 的响应峰高。
2.5 实验条件的优化
2.5.1 纳米材料的选择
以玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极；对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，分别将空白的玻碳电极、附载了氧化
石墨烯(GO) 的玻碳电极和附载了GO-ZnS 纳米材料的玻碳电极作为工作电极进行电化学预处理，然后用循环方波伏安法测定它们对只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应。
根据实验数据绘制不同附载纳米材料下响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的附载纳米材料。
2.5.2 预处理介质的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。首先将玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载GO-ZnS 纳米材料，用热风机烘干，在电解池中依次以0.1mol/L的NaOH 溶液、0.1mol/L的H 2SO 4溶液、pH=7.0的PBS 溶液作为预处理介质，用循环伏安法进行扫描电极至稳定，再用循环方波伏安法测定它们对只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应。
根据实验数据绘制不同预处理介质下响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的预处理介质。
2.5.3 电解质溶液的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载石墨烯-ZnS 量子点，用热风机烘干，在电解池中取0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法对电极进行氧化活化处理，另取一个电解池，分别以pH=7的PBS 缓冲溶液、pH=5.0的HAc-NaAc 缓冲溶液、H 2SO 4作为电解液，用循环方波伏安法分别测定只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应。
根据实验数据绘制不同电解液下响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的支持电解液。
2.5.4 HAc-NaAc缓冲溶液最佳pH 的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载石墨烯-ZnS 量子点，用热风机烘干，在电解池中取0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法对电极进行氧化活化处理，另取一个电解池，分别以pH=3.7、3.9、4.1、4.5、4.9、
5.3、5.7的HAc-NaAc 缓冲溶液作为电解液，用循环方波伏安法分别测定只含有
电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应。
根据实验数据绘制不同pH 下HAc-NaAc 缓冲溶液电解液下响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的电解液pH 。
2.5.5 方波振幅的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载GO-ZnS 纳米材料，用热风机烘干，在电解池中取0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法对电极进行氧化活化处理，另取一个电解池，以pH=4.1的HAc-NaAc 缓冲溶液作为电解液，用循环方波伏安法分别测定只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应，循环方波伏安法参数设置中，方波振幅的设置依次采用0.01V 、0.03V 、0.04V 、0.05V 、0.10V 、0.15V 。
根据实验数据绘制不同方波振幅下循环方波伏安法对DNA 响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的方波振幅。
2.5.6 方波频率的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载石墨烯-ZnS 量子点，用热风机烘干，在电解池中取0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法对电极进行氧化活化处理，另取一个电解池，以pH=4.1的HAc-NaAc 缓冲溶液作为电解液，用循环方波伏安法分别测定只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应，循环方波伏安法参数设置中，方波频率的设置依次采用3Hz 、4Hz 、5Hz 、6Hz 、7Hz 、9Hz 。
根据实验数据绘制不同方波频率下循环方波伏安法对DNA 响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的方波频率。
2.5.7 Cr6+浓度的测定
（1）通过上述实验找出的最佳条件，依次在上述最佳条件下采用三电极体系测定含有电解液+DNA与电解液+DNA+污染物Cr 6+溶液，得到两个电流响应值，计算两次相应的差值ΔI。
（2）Cr 6+溶液的浓度依次取1×10-1mol/L；1×10-2mol/L；1×10-3mol/L；1×10-4mol/L；1×10-5mol/L；1×10-6mol/L；1×10-7mol/L。重复步骤（1）。测定得
到不同Cr 6+浓度值下，峰电流与电位关系曲线。
（3）根据实验数据绘制在Cr 6+溶液不同浓度下峰电流随浓度的变化曲线，以Cr 6+溶液浓度对数为横坐标，响应峰电流ΔI为纵坐标，绘制标准曲线。
3 结果与讨论
3.1 不同纳米材料修饰对电极的电化学行为的影响
DNA ，又称为脱氧核糖核酸。作为生命遗传物质，其由四种具有电化学
活性的嘌呤碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤) 和嘧啶碱基(胞嘧啶、胸腺嘧啶) 组成。由于氧化嘌呤碱基所需的过电位较低，所以在研究DNA 与污染物作用时，通常选取DNA 上的嘌呤氧化信号作为研究对象。但是，直接用裸玻碳电极去检测溶液中的DNA ，其电化学信号非常微弱，而通过在电极表面修饰纳米材料GO(氧化石墨烯) 或者GO-ZnS （氧化石墨烯- ZnS量子点），并测定循环方波曲线，可明显观察到DNA 碱基鸟嘌呤与腺嘌呤的氧化峰。它们分别出现在0.75V 和1.2V 左右，它与已报道的DNA 出峰位置有偏差，这是因为pH 对它产生了影响，在不同pH 的缓冲溶液中，由于质子参与反应，从而影响DNA 碱基的出峰位置。另外，不同电极修饰材料对固定在电极表面的DNA 鸟嘌呤与腺嘌呤的出峰位置也有显著的影响[24]。由于DNA 腺嘌呤的电化学响应提高显著，因此后续实验选定腺嘌呤的氧化峰作为本文的研究对象。
图3.1a 是工作电极-玻碳电极经过循环伏安法电化学与处理的CV 曲线图，从图3.1b 可以观察到，与GCE 、GCE/GO相比较， GO-ZnS/ GCE对DNA 电化学响应的增强最为显著。其原因一是由于纳米复合材料大的比表面积有利于DNA 在电极表面的吸附；二是石墨烯、硫化锌的协同效应促进了DNA 在电极表面的电子传递。DNA 在GCE/GO-ZnS上信号的增强说明GO-ZnS 纳米复合材料能作为一种有效的电极修饰材料用于DNA 电化学生物传感器的构建。
图3.1c 中abcd 四条曲线分别表示以GO-ZnS/GCE、GO/GCE、ZnS/GCE、GCE 为测定对象，以铁氰化钾-亚铁氰化钾作为电解液，测定其交流阻抗图谱。对
交流阻抗图谱来说，斜率越大，表示它的扩散速度越快，即传质速率、对流效应越强，从图中我们可以看出：a 线，即以GO-ZnS 修饰过的玻碳电极斜率最大，这也
印证了前面的实验结果，所以，我们选择以GO-ZnS 纳米材料修饰玻碳电极。
2.01.51.0
电流
(μA )
0.50.0-0.5-1.0-1.5-2.0
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
图3.1a 循环伏安法对玻碳电极扫描CV 图
Fig. 3.1a Cyclic voltammetry on a glassy carbon electrode scanning CV Figure
电压 (V)
ΔI (μA )
电极修饰状态
图3.1b 不同纳米材料修饰电极响应结果对比图
Fig. 3.1b Different nanomaterials modified electrode response results comparison chart
图3.1c 不同纳米材料修饰电极的EIS 图(a：GO-ZnS 、b ：GO 、c ：ZnS 、d ：GCE) Fig. 3.1c EIS diagram of different nanomaterials modified electrode (a: GO-ZnS, b: GO, c: ZnS, d:
GCE)
3.2 不同预处理介质对电极的电化学行为的影响
我们通常采用恒电流氧化、循环伏安法扫描、恒电位氧化法等对电极进行电氧化预处理，有的时候还会在对电极进行一定的氧化处理之后再将它进行阴极还原处理，或者继续通过循环伏安法对它进行扫描至电极稳定。对电极进行电氧化
处理主要是想使电极达到最佳实验效果并且使得实验的重现性提高。对电极进行处理的电解液一般有酸性、碱性、中性三种。恒电位阳极氧化法是指以玻碳电极为工作电极，给它施加一个恒定的正电位，对电极作用一段时间，这一处理将对电极起到活化的目的；循环伏安法是指在一定电位下对电极进行循环扫描。本文我们选择循环伏安法预处理，分别以NaOH 、H 2SO 4、PBS 预处理介质，通过实验结果分析何种预处理介质下响应的ΔI是最大的。
在修饰玻碳电极过程中，电极氧化预处理介质在电氧化预处理中起着极为重要的影响，它会对电极表面的粗糙度、电极表面的含氧量、电极表面的物理结构等均会造成一定程度的影响，因而对电极的电化学测定过程也会带来影响。不同的预处理介质对电极的测定影响也差别各异。一般情况下会选择H 2SO 4、磷酸缓冲溶液和NaOH 作为预处理介质。经过氧化预处理，电极表面的含氧量均将会大幅提升。从图3.2可以看出：经过NaOH 做介质的响应结果要好于H 2SO 4和磷酸缓冲溶液做介质的响应，因为经过H 2SO 4氧化预处理的电极表面粗糙度比NaOH 中氧化处理的电极表面粗糙度大，在以碱性溶液作为介质时，玻碳电极只是表面发生了氧化，在酸性溶液中处理时，除了电极表面被氧化其深层也发生了氧化。通过实验数据我们可以看出，以0.1mol/L的NaOH 作为预处理介质时，电化学响应的ΔI是最大的。
ΔI (μA )
预处理介质
图3.2 不同预处理介质下电极响应结果对比柱形图
Fig. 3.2 Pretreated with different electrode response results contrast media Column
3.3 不同电解质溶液对电极的电化学行为的影响
支持电解质的组成也是影响峰电流的一个重要因素，它为体系的氧化还原反应提供一定的介质环境，电极表面所有的反应均是在该溶液中发生，它能够有效
的促进被测物在电极表面的氧化还原进程。通常情况下，支持电解质溶液的浓度越大，其电化学响应峰电流也越大，当电解质溶液浓度达到一定程度，峰电流将趋于平稳，但是这一现象并非绝对，有些情况下，对于某些特殊物质，支持电解质越小，其电化学响应峰电流反而越大，这时候就要选用浓度比较低的电解质溶液作为介质，以此来提高测定的灵敏度。支持电解质不同影响DNA 响应电流大小，同时也改变其峰电位。从图3.4我们可以看出：在相同的电极处理条件及被测物浓度下，分别于H 2S04、HAc-NaAc 、PBS 溶液中测定其响应信号，实验结果表明在以HAc-NaAc 作为电解质溶液的情况下，DNA 响应ΔI均最大。
ΔI (μA )
电解质溶液
图3.3 不同电解质溶液下电极响应结果对比柱形图
Fig. 3.3 Electrolyte solution under different electrode response bar graph comparing results
3.4 HAc-NaAc缓冲溶液pH 对电极的电化学行为的影响
为了研究pH 对GO-ZnS/GCE对DNA 电化学行为的影响，我们采用不同pH 的
HAc-NaAc 缓冲溶液来测定传感器的腺嘌呤信号，研究峰电位与峰电流ΔI的变化
情况，结果如图所示。
从图3.4我们可以看出：随着pH 从3.7增大到5.7，DNA 腺嘌呤的氧化峰电位逐渐负移。另外，由图可知，随着pH 的增大，腺嘌呤的氧化峰电流ΔI值先增加后减小。当pH 为4.1时，峰电流ΔI达到最大值。
由此我们可以得出，DNA 在HAc-NaAc 中的电化学反应为质子参与反应。pH 不仅影响腺嘌呤的氧化峰电位，同时对鸟嘌呤氧化峰电流也有显著影响。经过分析得出，在pH4.1处鸟嘌呤的氧化峰电流最大。因此，后续实验选定pH 4.1的HAc-NaAc 缓冲液作为支持电解质。
ΔI (μA )
pH
图3.4 不同缓冲溶液pH 下电极响应结果对比图
Fig. 3.4 Buffer solution under different pH electrode response results comparison chart
3.5 不同方波频率、方波振幅对电极的电化学行为的影响
循环方波伏安法灵敏度较高，响应快，而扫描电位范围、方波频率、方波振幅等均会影响响应方波峰电流的大小，因此，我们在这里探讨一下方波频率和方波振幅对实验结果的影响。
从图3.5a 我们可以发现：随着方波频率增大，响应峰电流ΔI在3Hz 到7Hz 之间先增大后减小，峰电位负移，但半峰宽也增大，并且当频率大于6Hz 时，峰形变差，对测定不利，所以本法选择频率为5Hz 。
从图3.5b 我们可以看出：当扫描振幅在0.01mV ～0.15 mV间变化时，
DNA 在0.75 V左右的氧化峰峰电流ΔI随扫描振幅的增加先增大后减小，但半峰宽也随之增加，峰形有波动，不够稳定，即峰的分辨率随振幅的增加而减小，兼顾检测的灵敏度和分辨率，选择测定的扫描振幅为0.04 mV。
ΔI (μA )
方波频率 (Hz)
图3.5a 不同方波频率下电极响应结果对比图
Fig. 3.5a Different square-wave frequency electrode response results comparison chart
ΔI (μA )
方波振幅 (V)
图3.5b 不同方波振幅下电极响应结果对比图
Fig. 3.5b Square wave amplitude under different electrode response results comparison chart
3.6 不同Cr 6+溶液浓度对电极电化学行为的影响
I (μA )
电压 (V)
图3.6a DNA电化学生物传感器测定Cr 6+电流-电压响应曲线
Fig. 3.6a DNA electrochemical biosensor measurement Cr6+ current - voltage response curve
ΔI (μA )
Lg(C(Cr6+))
图3.6b DNA电化学生物传感器腺嘌呤氧化峰电流ΔI与Cr 6+-浓度对数关系 Fig. 3.6b DNA electrochemical biosensor adenine oxidation peak current ΔI and Cr6+
concentration logarithmic relationship
图3.6a 为采用经过实验得出的各最佳条件、参数下不同浓度的Cr 6+溶液在含有DNA 的电极上的循环方波伏安图。图3.6b 为标准曲线图，从图中我们可以看出当Cr 6+离子浓度在1×10-2mol/L-1×10-8 mol/L时，Cr 6+离子浓度与DNA 对电极的电化学相应峰电流ΔI呈良好的线性关系，线性方程为y=4.95045x+0.5025LgCCr6+，线性相关系数为R=0.99777。
3.7 重现性的测定
采用GO-ZnS 负载在玻碳电极表面，以0.1mol/L的NaOH 溶液作为预处理介质，以0.1mol/L的pH=4.1的HAC-NaAc 溶液作为电解质溶液，在方波振幅为0.04V 、方波频率为5Hz 的条件下，以浓度为1×10-4mol/L的Cr 6+溶液为待测液，做重现性的测定。
表1 重现性的测定
序号 ΔI (μA) 序号 ΔI (μA) 标准偏差(%)
1 2.97033 7 2.94566
2 2.93065 8 2.96687
3 2.98325 9 2.98853
1.82
4 2.99562 10 2.97743
5 2.97156 11 2.98142
6 2.99323 12 2.97634
从表1中可以看出，电极的重现性良好，可用来对Cr 6+进行检测。
3.8 回收率的测定
表2 回收率的测定
从表2中可以看出，回收率较高。
4 结论
开展本课题采用溶解热法合成石墨烯-ZnS 量子点(GO-ZnS)，将GO-ZnS 溶液通过微量注射器注射到裸玻碳电极表面，用热风机烘干，采用循环方波伏安法研究Cr 6+溶液在电极上的电化学行为，分别测电极在含有DNA 与DNA+污染物时的相应峰电流ΔI。通过最终的实验结果，对实验条件进行优化，找出最佳的纳米材料修饰物、最佳预处理介质、最佳支持电解质、最佳pH 值、最佳方波振幅、最佳方波频率，实验结果表明：
（1）通过比较裸电极、附着了石墨烯(GO)、石墨烯-ZnS 量子点(GO-ZnS)的玻碳电极作为工作电极，用污染物测定其电化学行为。得出结论：在电电极上修饰GO-ZnS 时，响应电流峰值ΔI最大，所以选择GO-ZnS 去修饰波碳电极。 （2）研究了不同预处理介质溶液对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：以0.1mol/L的NaOH 溶液作为预处理介质时，电极的响应最好。
（3）研究了在不同电解质溶液对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：以0.1mol/LHAc-NaAc时，电极的响应最好。
（4）研究了不同HAc-NaAc 溶液pH 对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：溶液的pH 对峰电位与峰电流均有影响，说明它参与了质子反应，在pH=4.1的HAc-NaAc 溶液下，电极的响应最好。
（5）研究了不同方波振幅对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：方波振幅为0.04V 时，电极的响应最好。
（6）研究了不同方波频率对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：方波频率为5Hz 时，电极的响应最好。
（7）研究了不同浓度的Cr 6+溶液对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：在Cr 6+溶液浓度在1×10-2mol/L-1×10-8 mol/L时，Cr 6+溶液浓度与含有DNA+电解液和DNA+ Cr 6++电解液响应峰电流ΔI呈良好的线性关系，线性方程为y=4.95045x+0.5025LgCCr6+，线性相关系数为R=0.99777。 。
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无机优先污染物与DNA 之间作用的传感研究
致 谢
时光飞逝，光阴如梭，不知不觉中我已经在美丽的长沙理工大学度过了我人生中最美好的四年时光。在这四年里，我逐渐成长，在大家的帮助下，学习了很多，也收获了很多。在论文将要完成之际，我的心中涌出了无尽的感激……
首先要深深地感谢我的导师李丹和我的分析化学老师张玲老师。科研上，是你们将我领入科研的殿堂，让我逐渐学会如何发现问题、分析问题和解决问题，你们严谨的科学态度、不断求索的科学精神以及创新活跃的科学思维都深深的感染了我。感谢你们对我实验的严格要求和悉心指导，让我逐渐形成严谨的科研态度，取得了一定的科研成果。生活中，感谢你们对我的无私关怀和无尽包容，给了我很多方面的帮助，让我能够从一次次的困境中走出来。感激的地方太多太衷心感谢李以为报，衷心祝愿恩师身体健康、万事如意！
另外，我还要感谢徐运妹学姐，是你手把手教会我文献查阅、仪器操作、实验设计，也是你无私的帮我解决实验中遇到问题、修改论文。谢谢学姐一直以来对我的包容和帮助，祝愿学姐前程似锦。
感谢我的好友：安振宇、李文杞、刘维、何世日，跟你们在同一个实验室我很开心，在我迷茫的时候开导我，在我骄傲的时候提醒我，是你们让我感受了友情的温暖，也让我更加相信友情。谢谢你们陪我一起成长，让我一路走来从不觉得孤单，在以后的日子里我也会好好珍惜我们间的这份感情。
最后，对所有关心和帮助我的老师及同学表示衷心的感谢和诚挚的问候，祝大家身体健康，万事如意！
第 26 页 共 26 页
无机优先污染物与DNA 之间作用的传感研究
摘要
本文通过研究，采用石墨烯-ZnS 量子点这种新型纳米材料修饰玻碳电极，由于其具有大的比表面积、高的载流子迁移率、良好的导电导热性、优异的机械柔性和化学稳定性，从而可以促进DNA 与电极之间的电子转移；以循环方波伏安法为测定方法，以HAc-NaAc 缓冲溶液为电解质溶液，考察了GO-ZnS/GCE复合电极在含有污染物Cr 6+的DNA 溶液中的电化学响应，实验结果表明：Cr 6+的加入降低了DNA 在0.7V 、1.0V 左右的氧化峰，该峰分别是腺嘌呤与鸟嘌呤的氧化峰，发现Cr 6+浓度在1.0×10-8mol/L~1.0×10-2mol/L时，峰降低的幅度ΔI与Cr 6+的浓度对数呈良好的线性关系，线性方程为：y=4.95045x+0.5025LgCCr 6+，线性相关系数为0.99875，该电极具有较好的稳定性与重现性。
关键词：石墨烯-ZnS 量子点；循环方波伏安法；DNA ；Cr 6+
SENSING STUDY INTERACTIONS BETWEEN INORGANIC
PRIORITY POLLUTANTS AND DNA
ABSTRACT
This paper studies the use of graphene-ZnS quantum dots This new nano-modified glassy carbon electrode material, because of its large surface area, high carrier mobility, good electrical and thermal conductivity, excellent mechanical flexibility and chemical stability resistance, which can facilitate electron transfer between DNA and the electrode; to cycle square wave voltammetry method for the determination to HAc-NaAc buffer solution as the electrolyte solution was investigated GO-ZnS/GCE composite electrode containing contaminants of Cr6 + the electrochemical response of the DNA solution, the experiment results show that: Cr6 + to decrease in the DNA in the 0.7V, 1.0V oxidation peak around the peak of the oxidation peaks of adenine and guanine, the concentration of Cr6 + was found at 1.0 × 10 - 8mol / L ~ 1.0 × 10-2mol / L, the peak amplitude ΔI with lower concentrations of Cr6 + logarithmic relationship was linear, linear equation: y = 4.95045x +0.5025 LgCCr6 +, the linear correlation coefficient of 0.99875, the electrode having a good stability and reproducibility.
Key words: graphene-ZnS quantum dots; cyclic square wave voltammetry; DNA;
Cr 6+
目 录
1 绪论……………………………….. ………………………………………………….……1
1.1课题研究的背景 ……………………. …………………………………………....…1
1.2 六价铬的检测方法方法…………………. …………………………………………. 1
1.2.1 分光光度法…………….. ………….. …………………………………………. 1
1.2.2 原子吸收法……………………………………………………………………. 1
1.2.3 液相色谱法…………………………….. ……………………………………. 1
1.2.4 试纸法………………………………………….. ……………………………. 1
1.3 DNA 电化学生物传感器介绍 ………………………………. ………………………3
1.4 DNA 电化学生物传感器应用 …………………….. …. ……………………………3
1.4.1 DNA 生物传感器检测病原基因….…. ………….. ……………………………3
1.4.2 DNA 生物传感器检测有机物………………………………………………..3
1.4.3 DNA 生物传感器对蛋白质的检测……………………………………....…. 4 1.4.3 DNA 生物传感器用于抗癌药物的开发、分析………….. …….. ……....…. 4
1.5 电化学方法的选择………………………. …………………………………………. .4
1.5.1 循环伏安法(CV)………………………….….………………………………4
1.5.2 循环方波伏安法(SWV+Cyclic)………………..………………..…………..5
1.5.3 交流阻抗（EIS ）………….. ……………………………………………….…. 5
1.6 石墨烯-量子点在本实验中的应用及其制备法…………………........………………….5
1.6.1 石墨烯-量子点的制备…………………….….………………………………4
1.6.2 石墨烯-量子点的应用与景…………...……..…………………………..…………..7
1.7论文研究的目的和主要内容 ……………. ………………………………………...9 2 实验部分………………………. …………………………………………………………10
2.1主要试剂………………………. ……………………………………........................10
2.2主要仪器………………………. ……………………………………........................10
2.3实验溶液的配制………………. …………………………………….......................10
2.3.1 0.1mol/L的pH=7的PBS 溶液的配制…………. …………….......................10
2.3.2 2.5mg/mL的DNA 溶液的配制……………………………….......................10
2.3.3 0.2mol/LpH=3.7-5.7的醋酸缓冲溶液的配制……………………...............10
2.3.4 0.1mol/L的NaOH 溶液的配制…………………………….........................10
2.3.5 0.1mol/L的H 2SO 4溶液的配制……………………………………................10
2.3.6 Cr 6+离子溶液系列浓度的配制……………………………….......................10
2.3.7 Starter3C 型实验室pH 计的校准……………………………........................10
2.4实验过程…………………………………………………………………...................10
2.4.1 石墨烯-ZnS 量子点的制备……………………………….. …….............12
2.4.2 电极的预处理………………….…………………….. …..............................12
2.4.3 石墨烯量子点的附着……………..…………....…………….….................12
2.4.4 玻碳电极的电化学预处理…………………….….. …………………..........12
2.4.5 循环方波伏安法（SWV+Cyclic）对含DNA 溶液的响应测定..................... ....12
2.5实验条件的优化…………………………. …………………………........................13
2.5.1 纳米材料的选择……………………….. …………………………….............13
2.5.2 预处理介质的选择………………….. …………………..............................13
2.5.3电解质溶液的选择……………....…………………….. ……….….................13
2.5.4 HAc-NaAc 缓冲溶液最佳pH 的选择……………. ………………..........13
2.5.5 方波振幅的选择……................................................................................. ....13
2.5.6 方波频率的选择…….................................................................................. ....14
2.5.7 Cr 6+浓度的测定……................................................................................... ....15
3 结果与讨论……………………………….........................................................................13
3.1 不同纳米材料修饰对电极的电化学行为的影响……...……………..........................16
3.2 不同预处理介质对电极的电化学行为的影响…………….. …….........................17
3.3 不同电解质溶液对电极的电化学行为的影响……………...........................................18
3.4 HAc-NaAc. 缓冲溶液pH 对电极的电化学行为的影响……...................................18
3.5不同方波频率、方波振幅对电极的电化学行为的影响…….....................19
3.6 不同Cr 6+溶液浓度对电极电化学行为的影响..........................................................20
3.7重现性的测定………………………………….... …………………......................21
3.8回收率的测定……………………………. ………….............................................22
4 结论………………………………………………..........................................................24
参考文献………………………………………………..........................................................25
致谢……………………………………………………..........................................................27
1 绪论
1.1 课题研究的背景
铬在自然界中分布非常广泛，无论是土壤、大气还是生物体内都含有铬元素
[1]。随着我国经济的发展，军事、机械、化工、建筑及其其他行业对铬需求的不断增加，使得铬在使用与生产的过程中，也逐渐被排放到自然环境中，造成铬在自然界中不断累积，尤其是土壤中的铬含量越来越多，不断累积的铬，对土壤环境以及土壤中存在的各种微生物和动植物都会产生了一定程度的危害[2]。铬及其其他重金属的一大特征就是不能够在特定的条件时间下可以被微生物等降解为无危害的小分子，铬在自然环境中也不能通过自身降解，恰恰相反，它们会富集在动植物或微生物的体内，对生物体的正常生理活动造成不同程度的影响，不仅如此，它们在自然界中还可能会转化成为危害性更大的重金属有机化合物。
铬属于人体必需的微量元素。对于生物体有不可或缺的作用：它可以辅助胰岛素吸收葡萄藕塘、预防动脉粥样硬化、促进蛋白质代谢和生长发育等。但如果一次性摄入铬的量过多，则会造成铬中毒。铬中毒一般都是由六价铬引起。对生物体而言，因为一次性摄入的量有区别，加之摄入途径不一，所以具体的临床反应也有差异。铬对人体可以造成非常大的损害，其作用主要表现在：可以引起皮肤的溃烂和过敏、破坏呼吸道、对人的眼睛也可造成一定程度的的损伤、如果经口摄入，将会对胃肠道的损伤、除此之外铬还有一定的致癌作用等[3]。
1.2 六价铬的检测方法
铬对人类危害的影响已经越来越大，所以亟待一种快捷、简便、廉价、准确可行的检测手段，目前对六价铬的检测方法主要有以下几种：
1.2.1 分光光度法
分光光度法测定水中的铬(Ⅵ) 包括流动注射光度法、荧光光度法和催化动力学光度法等，该法的测定原理主要是利用铬(VI)的氧化性，使其中加入的某种试剂显色或褪色，在特定的波长下，根据铬 (VI)浓度与吸光度呈一定的线性关系测定铬(VI)含量[4-6]。据报告，该法的测定范围大概在0～0.6μg/L，如果实验中通
过加入适当的掩蔽剂、增敏剂、乳化剂、控制反应条件等，可使灵敏度更高，这样得到的检出限将更低。但就整体而言，该方法重现性较差，选择性不强，而且很难实现在线、及时的检测。
1.2.2 原子吸收法
原子吸收光谱法(AAS)测定铬，原子吸收法测定物质只能以元素分类，所以它只能测定总铬含量，而无法确定其价态。通过先测定标准溶液制定标准曲线，得到线性方程，然后确定待测液的吸光度，通过线性方程就可以计算出铬(VI)的量。目前原子吸收法测定铬最常用的方法，主要包括石墨炉原子吸收光谱法(ETAAS) 和火焰原子吸收光谱法(rAAS)。它的检测限可以达到出限为0.72μg/L[7]，法测定水中微量铬(VI)具有快速、灵敏等优点，但是该法的前处理步骤复杂，除此之外，该方法检测成本较高。
1.2.3 液相色谱法
液相色谱指以液体作为流动相，依据待测即待分离的物质在固定相与流动相之间分配系数不一致，如果待测物质在液相中传递，它将会在流动相与固定相之间达到平衡，由于不同样品不同含量的待测物质在固定相中的保留时间有所不同，在固定相中流出时间不一致，据此可对样品进行分离与检测。金[8]使用液相色谱法对水中的铬离子进行检测，以C18柱作为色谱柱，以二苯卡巴肼溶液作为流动相，以543nm 作为吸收波长，进行测定。通过液相色谱法，检测限为
0.002mg/L，该方法测定铬快速稳定，并且准确率高，线性良好。总的来说该方法分析灵敏性好、应用范围广，但是它的价格比较昂贵，一般只能用作实验室检测。
1.2.4 试纸法
该方法原理参照二苯碳酰二肼分光光度法，显色原理见下式：
试纸法是一种非常便捷的检测手段，该法可检测100 mg/L以下铬离子浓度，如果检测中发现样品浓度高于该值，可对样品进行一定的处理，如可将它按一定的比例稀释浓度之后再做检测[9]。这种法的优点是测定速度快、检测方便。但在
光照条件下不稳定，而且检测限较低，并且检测的精确度不高。
1.3 DNA电化学生物传感器介绍
本文将介绍一种全新的方法-DNA 电化学生物传感器法检测溶液中的六价铬离子。六价铬离子与DNA 相互作用，破坏DNA 结构，然后通过电化学信号表达作用结果，发现电化学信号的响应与污染物的浓度对数之间存在着某种线性关系，以此来确定污染物的浓度。
生物传感器的基本作用机理是通过生物的催化和免疫，在生物领域中被广泛应用。尤其近十年来，生物技术与生物分子学发展速度越来越快，人们开发了通过DNA 与污染物相互作用，产生响应，制作了DNA 生物传感器。这种传感器能用于无机污染物、有机污染物、蛋白质、核酸序列等的检测与研究，该生物传感器将会在环境污染监测起到非常重要的作用，也是目前的发展趋势所向[10]。
1.4 DNA生物传感器的应用
1.4.1 DNA生物传感器检测病原基因
人类之所以会产生疾病，其主要原因之一就是因为病毒与细菌的感染。DNA 生物传感器发展越来越迅速，它不仅可以进行基因疾病的诊断，还可用于研究DNA 与病源基因的研究；除此之外，还可用于DNA 作用机理的分析，通过研究分析，可以进行特定药物的设计合成，将做到真正的对症下药[11]。Lin [12]等通过共价结合的方法，将DNA 探针修饰在玻碳电极上，此DNA 与互补链进行杂交，这一过程将引起溶液中亚甲基蓝指示剂产生响应，电流峰值将产生明显改变，依据这一原理，可以对慢性骨髓性白血病病毒基因进行诊断，线性范围为
1.25×10-7mol/L~6.25×10-7mol/L。检测限为5.9 × 10-8mol/L。
1.4.2 DNA生物传感器检测有机污染物
目前世界上存在数量最多的物质就是有机物，它们也是被微生物最难以降解的物种之一，有机物对人类的危害众所周知，造成的环境问题也日益凸显。针对环境中有毒有害的有机分子，DNA 生物传感器可以提供一种快速、简便、准确的方法，甚至可以进行实时监控 [13]。Wang [14]将DNA 固定在玻碳电极表面，作为工作电极，通过污染物与DNA 相互作用，可以检测出环境中有害的物质，该方法利用键合作用，将芳香胺与双链DNA 固定在一起，设计了一种新型的电化学生物传感器，该传感器可用于芳香胺类化物的检测，检测限达到1×10-7mol/L。
DNA 生物传感器以其专一性、分析速度快、检测结果准确、可实行实时在线监测等优势为生命科学的研究开创了一片新的领域，为生物分子的研究提供了一种全新的方法。截至目前，DNA 生物传感器已被广泛应用在动、植物、蛋白质、食品、药品、水、病毒、各类污染物的检测中，尤其是在检测无机、有机污染物、核酸、蛋白质等方面已取得显著成效。随着生物信息学、计算机技术与基因技术、仿真技术的不断发展以及人们对生物体、DNA 不断认识与研究，以及某些技术的不断创新，DNA 生物传感器将逐步趋向自动化、商品化。
1.4.3 DNA生物传感器对蛋白质的检测
在以核酸适体作为探针进行特异性识别蛋白质的检测等方面，DNA 生物传感器的应用越来越广泛，DNA 生物传感器的出现为蛋白质的分析检测与研究提供了一种切实可行且高效的方法。在对蛋白质的检测过程中，利用核酸适体对蛋白质进行在线检测，，该方法可实现蛋白质在活细胞上的测定。除此之外，还有关于利用荧光共振能量转移凝血酶方面的研究。Fan [15] 建立了一种采用磁球分离、金胶标记的金属免疫分析法，该法可测定免疫球蛋白G 。实验数据显示，DNA 生物传感器在蛋白质的分析研究方面具有非常好的前景，且该种方法在实验中的优势表现的非常明显，它将为医学临床、疾病诊断、药物设计方面提供非常有利的支持。
1.4.4 DNA生物传感器用于抗癌药物的开发、分析
抗癌药物作用机理主要包括以下五个方面：影响核酸的合成、影响蛋白质的合成、直接破坏DNA 结构、嵌入DNA 中干扰模板作用、影响体内激素平衡。其中数直接作用于DNA 的药物居多。因此，想要开发新的抗癌药物[10]必须要认识、了解核酸，DNA 生物传感器为抗癌药物的设计、开发、作用机理、药物分析方面提供了一种快速、准确、可行的分析方法，它的应用日益受到人们重视。以特定序列的DNA 作为传感器的探针，加入一定量的指示剂，用该传感器检测DNA 与抗癌药物相互作用产生的信号，通过电化学的方法来表征这种信号，为抗癌药物的研发提供了一种切实有效的方法。
作为核糖核酸的重要组成部分，腺嘌呤与鸟嘌呤在细胞代谢调节、能量供应与酶促催化及神经递质信号传递等很多方面都有重要体现。腺嘌呤与鸟嘌呤有电化学活性，容易发生氧化还原反应，在含有DNA 的溶液中加入重金属六价铬离
子溶液，施加一定的电压之后，它会破坏DNA 的结构，由于DNA 双螺旋外侧的脱氧核糖的作用，阻碍了内侧的碱基发生电化学反应，导致A(腺嘌呤) 与G(鸟嘌呤) 的电化学信号下降，且不同浓度的污染物对DNA 结构造成的破坏不一样，据此，我们可以根据鸟嘌呤与腺嘌呤电化学信号的改变可以确定污染物与的浓度。
1.5 电化学方法的选择
1.5.1 循环伏安法（CV ）
基本原理：给工作电极上施加一个等腰三角形脉冲电压得到的曲线包括全部分电压扫向阴极时产生的还原峰，此时发生的反应为电极上某种具有活性的物质被还原，其中也包括了当后半部分电压扫向阳极时在阴极上产生的氧化峰，此时电极上被还原产物又重新被氧化。因此，完成一个循环脉冲扫描，电极上将发生一次氧化反应和一次还原反应，所以该法被称为循环伏安法。利用循环伏安法扫描出的图谱被称为CV 图。利用循环伏安法还可检测物质的可逆性，若某种物质可逆性差，则其CV 图对称性差，即它的氧化峰与还原峰峰高不一致。一般在循环伏安法中，玻碳电极、金电极和石墨电极等多作为工作电极。
应用：循环伏安法在电化学研究方面应用极为广泛，可用于电极反应的机理、电化学-化学耦联反应、动力学参数和性质的研究。其中最主要的两种用途分别为：a. 电极反应机理的判断：循环伏安法一般被用来作定性分析，也可以用来做定量分析，通过电极活性面积、交换电流密度、电极表面吸附物的覆盖度及交换电流密度等参数可判定电极表面微观反应过程及反应机理；b. 电极可逆性的判断：由于循环伏安法的图谱扫向是分支为阴极与阳极两个方向，我们只需观察CV 图的氧化峰与还原峰的对称情况，就可以判断物质在电极表面的可逆性，如果反应时不可逆的，则CV 图不对称。。
1.5.2循环方波伏安法(SWV+Cyclic)
基本原理：在快速扫描的阶梯电压上叠加较大振幅的方波电压，记录方波正半周末期与方波负半周末期的电流的差值，良好的消除了充电电流，又能在很短的时间记录出电流-电势伏安图，它的灵敏度稍高于脉冲极谱法。
1.5.3 交流阻抗（EIS ）
对电极系统施加不同频率的小振幅正弦波扰动信号，由电极系统的响应与扰动信号之间的关系得到的电极阻抗，模拟电极的等效电路，进一步分析电极系统
所包含的动力学过程及其机理，由等效电路中有关元件的参数值估算电极系统的扩散传质、电极双电层电容、电荷转移等参数。
1.6 石墨烯-量子点在本实验中的应用及其制备方法
本课题拟制备一种新型DNA 电化学生物传感器来检测水中的微量六价铬离子，通过查阅文献和相关资料，发现在电极上负载石墨烯-量子点对电极进行修饰，会促进DNA 与电极之间的电子转移，使实验效果明显改善。
当半导体材料的尺寸小于其激子波尔半径时，电子和空穴的运动受到限制，呈现量子化的特点，这样的纳米结构称为量子点[16]。量子点是零维纳米材料，三维尺寸都在100nm 以下，由于其内部的电子被束缚在一个很小的空间内，所以量子点表现出一些独特的性质，如它的生物相容性好、具有表面效应、小尺寸效应等，所以它被广泛用于荧光探针与能量转换方面。选择石墨烯-量子点复合纳米材料，是因为石墨烯-量子点复合材料作为一种功能材料，综合了石墨烯材料与量子点的优势，这种复合材料在室温下导电、导热性好生物相容性、力学强度大。因此它才会被用于电极的修饰[17]。
1.6.1 石墨烯-量子点的制备
从整体而言石墨烯-量子点的合成思路分为两大类[18-19]：自上而下的方法和自下而上的方法。自上而下方法是通过物理或化学法将大尺寸的石墨烯片进行―裁剪‖，使其成为成小尺寸的石墨烯量子点的方法。主要包括水热法、溶剂热法、电化学法、化学剥离碳纤维法、微波辅助法等。这类方法步骤相对简单、产率较高，也是目前应用最多的一类方法。自下而上的方法则是以小分子为前体，通过一步或多步化学反应制得，这类方法可以准确控制石墨烯-量子点的尺寸与形状，但步骤繁琐而且操作过程复杂。还有一些特殊的方法用于石墨烯量子点的合成，例如钌催化富勒烯C 60开笼法。
水热法
这种方法主要有四个步骤：①首先将氧化石墨烯(GO)热还原为石墨烯片(GSs)；②再在浓硫酸和浓硝酸组成的混酸中氧化GSs ，这一步不仅可以得到更小片的GSs ，而且在GSs 的边缘和平面上引入含氧官能团(C=O，COOH ，OH 和C-O-C) 以使GSs 更易溶于水；③然后将氧化后的GSs 在碱性条件(pH=8)下进行水热处理；④将水热后的滤液透析提纯后就制得GQDs 。
◆ 溶剂热法
溶剂热法是制备GQDs 中较为常用的一种方法。水热法则是以水作为溶剂，该种方法以有机物作为溶剂。具体实验制备过程如下：首先以改进的Hummers 法[20]制备的GO 为起始原料，用N ，N-二甲基甲酰胺(DMF)分散制得得GO ，使GO/DMF浓度为27 mg/mL(在其他浓度5-50 mg/mL亦可用于制备GQDs ，这一比率的选择主要取决于GO 的氧化程度) ，并将其超声分散30分钟(120 W，100 Hz)形成均一的悬浮液。然后将GO/DMF悬浮液转移至聚四氟乙烯内衬的反应釜内
(30mL)，在200℃加热8 h。待反应过后，反应釜冷却至室温，反应釜内衬里的悬浮液包含棕色悬浮液和黑色沉淀，除去黑色沉淀后的棕色悬浮液即为GQDs 的DMF 分散液。通过旋转蒸发除去溶剂可以得到GQDs 固体样品，产率约为1.6％。
◆ 电化学法
电化学法处理石墨晶体是制备荧光碳点是一种简便和有效的方法。首先通过氧等离子体处理大片石墨烯薄膜以增加其亲水性，然后再通过多次电化学循环伏安(CV)切割制备得到GQDs 。具体而言，以石墨烯薄膜作为工作电极，Ag/AgCl作参比电极，铂丝作对电极，电位窗口设置为±3V ，在0.1 M磷酸盐缓冲液(PBS)中连续CV 扫描，将得到的悬浮液过滤后通过纤维素酯膜袋透析后就得到水溶性的发绿色荧光的GQDs 。这种方法制备的GQDs 呈均一的单分散态，直径约3～5μm，厚度约1~2 nm(即三个石墨烯层) 。这种方法的优点是制备的GQDs 尺寸比较窄。
◆ 化学剥离碳纤维发
该法是通过化学处理，逐层剥离碳源，从而制得GQDs 。通常情况下，碳源的选择是树脂基碳纤维，利用酸处理碳源，将纤维中堆垛的石墨剥离，这样便可制得大量不同粒径分布的GQDs 。该法制备的GQDs 尺寸分布在1～4 nm，由1～3层石墨烯组成，结晶度高，并且边缘结构大多数成锯齿状。化学剥离碳纤维法的主要优点是实验过程简单，操作易行，实验条件要求低，而且作为初始原料的碳纤维价格相对便宜。
◆ 微波辅助法
微波辐照通过给反应介质提供快速、均匀的加热条件，从而使产率和纯度大大提高、反应时间也大大缩短。利用微波辅助快速一步合成量子产率为11.7％的
黄绿色荧光的GQDs(gGQDs)，经过硼氢化钠还原后变为蓝色荧光GQDs(bGQDs)，其量子产率高达22.9％。首先通过改进Hummers 法制备了氧化石墨烯，然后将其分散在硝酸和硫酸组成的混酸中，再在微波炉中微波辐照3小时，然后将混合物超声后用氢氧化钠调pH 至8，最后进一步分离透析后就制备了发黄绿色荧光的gGQDs 。透析之前，如果将得到的滤液进一步用硼氢化钠还原在室温下还原就可以得到蓝色荧光的bGQDs 。
1.6.2 石墨烯量子点得应用与前景
作为一种新型功能材料，石墨烯-量子点综合了石墨烯材料导电导热能力强、力学强度大、比表面积大与量子点的生物兼容性好等优势，在传感器的制作、太阳能电池方面、光电材料等领域有非常好的发挥前景。
1、太阳能电池。zhou [21]等成功地利用单元叠加的方法，制作出了一种新型的层状石墨烯-QDs 电子迁移体系。通过实验发现，光电流较之前有了非常明显的提高，主要是因为该石墨烯-量子点纳米材料具有非常优异的收集与转移电子的能力，这种层状的纳米材料将会广泛应用于太阳能电池捕光器件方面。
2、生物成像。Liu [22]等首先合成黄色焚光石墨稀量子，不经过任何表征修饰处理，直接将它用来标记在干细胞上，干细胞的选择以此采用胰腺祖细胞、神经球细胞和心脏祖细胞，将它们与石墨炼量子点一起孵育，在焚光共聚焦显微镜下观察呈像，因为石墨烯-量子点的修饰，可清洗观察到三种干细胞的形态。
3、传感器。Zhao [23]等发现了一种制备石墨烯/Cdse NPs多层膜的简单方法，由于这种膜的电子迁移能力非常强，所以它将会被广泛应用于生物、化学等领域。通过构建功能化石墨烯与带正电的CASe NPs光敏膜，发现这种膜的光敏性能非常好，对光的响应能力极为敏感，通过石墨烯-量子点的组合性能，该光敏膜在光电化学生物传感器方面将会有非常好的应用前景。
石墨烯-量子点复合纳米材料很好的结合了两种材料各自的优势，其具有优异的光电热转化性能，在电子转移效率和抑制载流子再复合方面发挥出了它独特的性质。虽然现阶段对石墨烯-量子点复合纳米材料的研究还在初步期，但是随着科学的发展与技术的提升，相信对石墨烯-量子点复合材料的研究将会越来越多，其生物、化学、光伏等领域的应用前景将非常好。
1.7 论文研究的目的与主要研究的内容
通过查阅大量文献资料，并结合本实验室的条件，准备构建制作一种新型、简便、准确可靠的DNA 生物电极，将它应用于环境检测方面。本论文拟开展如下研究工作：
（1）通过溶剂热法制备石墨烯-ZnS 量子点，并将它修饰在工作电极-玻碳电极的表面，它的修饰将会大大提高电极的工作效率。
（2）采用循环方波伏安法对含有DNA 的溶液进行测定，通过计算比较在有无污染物的情况下，电化学响应信号的改变，及其污染物浓度改变时，响应信号的改变，找出其中对应的线性关系，分析DNA 与污染物作用的机理。
（3）采用控制变量法，用循环方波伏安法对含有DNA 的溶液进行测定，找出支持最佳电解液、最佳pH 值、最佳方波振幅、最佳方波频率等，完成实验条件的优化，在最佳实验条件下，对标准溶液进行测定，作出标准曲线，确定线性关系和线性相关系数的大小。
2 实验部分
2.1 主要试剂
鲱鱼精DNA(分析纯；Sigma D-315)、 氧化石墨烯（自制）、
Na 2S (分析纯) 、Zn(Ac)2 （分析纯）、K 2Cr 2O 7、NaH 2PO 4. 2H2O 、Na 2HPO 4. 12H 2O 、HAc 、NaAc(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 、抛光粉：Al 2O 3。
2.2 主要仪器
超声波清洗器（KQ3200B 型，上海司乐仪器有限公司）、实验室PH 计（PHSJ-3F 型，上海雷磁仪器厂）、电子天平（BS124S 型，北京赛多利斯仪器系列有限公司）、微量进样器（10µL ，上海医用激光仪器厂）、电化学工作站（CHI660A 型 Gaoss Union ）、吸量管（1mL 2根，10mL 1根）、217型双盐桥参比电极（甘汞电极，金属为Hg ，难溶盐为Hg 2Cl 2(s)，易溶盐溶液为KCl 溶液，电极可表示为Cl -/ Hg 2Cl 2(s)/Hg，上海康宁电光技术有限公司）、辅助电极：铂金CHI115电极、工作电极：玻碳电极
2.3 实验溶液的配制
2.3.1 0.1mol/LpH=7的PBS 溶液的配制
（1）0.1mol/L的Na 2HPO 4溶液的配制
精确称量Na 2HPO 4. 12H 2O 晶体17.907g ，在50mL 的烧杯中溶解，然后转移至500mL 的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀静置备用。
（2）0.2mol/L的NaH 2PO 4溶液的配制
精确称量NaH 2PO 4. 2H 2O 晶体7.8000g ，在50mL 的烧杯中溶解，然后转移至500mL 的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀静置备用。
（3）pH=7的PBS 溶液的配制
取干净的烧杯，在其中加入20mLNaH 2PO 4溶液，然后在其中逐渐滴加Na 2HPO 4溶液，用PHSJ-3F 型pH 计调节至pH=7为止。
2.3.2 2.5mg/mL的DNA 溶液的配制
精确称量鲱鱼精-DNA 固体0.2500g ，在50mL 的烧杯中溶解，然后经过超
声仪超声溶解至溶液呈澄清状，再转移至100mL 的容量瓶中，稀释至刻度，放入冰箱备用。
2.3.3 0.2mol/LpH=3.7-5.7的醋酸缓冲溶液的配制
（1）0.2mol/L的HAc 溶液的配制
于100mL 的烧杯中加入20mL 去离子水，精确量取5.7140mL 冰乙酸，沿烧杯壁缓慢倒入，边倒边用玻璃棒搅拌，之后将溶液转移至500mL 容量瓶，稀释至刻度，摇匀静置备用。
（2）0.2mol/L的NaAc 溶液的配制
精确称量NaAc 固体（分析纯）8.2030g ，在100mL 的烧杯中加入30mL 去离子水溶解，再转移至50mL 的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀静置备用。
（3）不同pH 醋酸缓冲溶液的配制
取干净的烧杯，在其中加入20mLHAc 溶液，然后在其中逐渐滴加NaAc 溶液，用PHSJ-3F 型pH 计调节至pH=3.7、3.9、4.1、4.5、4.9、5.3、5.7，分别保存，待用。
2.3.4 0.1mol/L的NaOH 溶液的配制
精确称量NaOH 固体（分析纯）0.4000g ，在100mL 的烧杯中加入20mL 去离子水溶解，再转移至100mL 的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀静置备用。
2.3.5 0.1mol/L的H 2SO 4溶液的配制
于100mL 的烧杯中加入20mL 去离子水，精确量取1.5000mL 冰乙酸，沿烧杯壁缓慢倒入，边倒边用玻璃棒搅拌，之后将溶液转移至500mL 容量瓶，稀释至刻度，摇匀静置备用。
2.3.6 Cr6+离子溶液系列浓度的配制
准确称取分析纯K 2Cr 2O 72.9418g ，配制成100mL 的溶液，得到1×10-1mol/L的六价铬离子溶液，之后依次稀释成1×10-2mol/L；1×10-3mol/L；1×10-4mol/L；1×10-5mol/L；1×10-6mol/L；1×10-7mol/L的梯度溶液。2.3.2 缓冲溶液的配制
2.3.7 Starter3C型实验室pH 计的校准
把E-201-C pH复合电极浸入pH=6.86和pH=4.01（25ºC ）的磷酸盐溶液中，按下―校准‖键，标定完成；关机后仍然有效，不要再进行校准。
2.4 实验过程
2.4.1 石墨烯-ZnS 量子点的制备
本实验采用溶剂热法制备石墨烯-ZnS 量子点：将50mg 的GO （氧化石墨烯）加入100mL 浓度为0.1mg/mL的乙酸锌的溶液中，用氨水调节pH 值至9左右，然后再滴加0.1mg/mL硫化钠溶液，140℃下水热反应10h ，制备了石墨烯一硫化锌(GO-Zns)纳米复合材料。
2.4.2电极的预处理
以直径为2mm 玻碳电极作为工作电极，在麂皮上依次放0.5和0. 05μm的Al 2O 3作为抛光粉，在此麂皮上抛光电极表面约5min ，然后分别用无水乙醇和去离子水超声清洗10min 取出后用去离子水淋洗干净，用高纯氮气吹干待用。
2.4.3 石墨烯量子点的附着
通过微量注射器将石墨烯-ZnS 量子点溶液滴加到电极表面，用热风机吹干待用。
2.4.4 波碳电极的电化学预处理
在电解池中加10m0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法扫描电极至稳定状态，对电极进行活化(方法：循环伏安法(CV、One vertex/multi)，参数设置：初始点位：0.5V ，顶点电位：-0.1V ，采样间隔：0.001V ，扫描速度：0.05V/s，循环次数：5，静置时间：5.0s ，自动滤波，灵敏度：10μA/V)，记为GCE(ox)。
2.4.5 循环方波伏安法（SWV+Cyclic）对含DNA 的响应测定
在一个新的电解池中加入9mLPBS+1mLDNA混合液，用循环/方波伏安法(SWV+Cyclic)( 参数选择：初始电位：0.2V ，顶点电位：1.5V ，终止点位0.2V ，方波振幅：0.04V ，电位增量：0.004v ，方波频率：10.0Hz ，静置时间：2.0s ，自动滤波，灵敏度：100μA/v) 测定只含有DNA 时电极的响应峰高。
取出电极，再在一个新的电解池中加入8mLPBS+1mLDNA+1mLCr6+溶液，选用循环方波伏安法(参数设置与不加污染物一样) 检测有污染物存在时电极对DNA 的响应峰高。
2.5 实验条件的优化
2.5.1 纳米材料的选择
以玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极；对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，分别将空白的玻碳电极、附载了氧化
石墨烯(GO) 的玻碳电极和附载了GO-ZnS 纳米材料的玻碳电极作为工作电极进行电化学预处理，然后用循环方波伏安法测定它们对只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应。
根据实验数据绘制不同附载纳米材料下响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的附载纳米材料。
2.5.2 预处理介质的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。首先将玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载GO-ZnS 纳米材料，用热风机烘干，在电解池中依次以0.1mol/L的NaOH 溶液、0.1mol/L的H 2SO 4溶液、pH=7.0的PBS 溶液作为预处理介质，用循环伏安法进行扫描电极至稳定，再用循环方波伏安法测定它们对只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应。
根据实验数据绘制不同预处理介质下响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的预处理介质。
2.5.3 电解质溶液的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载石墨烯-ZnS 量子点，用热风机烘干，在电解池中取0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法对电极进行氧化活化处理，另取一个电解池，分别以pH=7的PBS 缓冲溶液、pH=5.0的HAc-NaAc 缓冲溶液、H 2SO 4作为电解液，用循环方波伏安法分别测定只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应。
根据实验数据绘制不同电解液下响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的支持电解液。
2.5.4 HAc-NaAc缓冲溶液最佳pH 的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载石墨烯-ZnS 量子点，用热风机烘干，在电解池中取0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法对电极进行氧化活化处理，另取一个电解池，分别以pH=3.7、3.9、4.1、4.5、4.9、
5.3、5.7的HAc-NaAc 缓冲溶液作为电解液，用循环方波伏安法分别测定只含有
电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应。
根据实验数据绘制不同pH 下HAc-NaAc 缓冲溶液电解液下响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的电解液pH 。
2.5.5 方波振幅的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载GO-ZnS 纳米材料，用热风机烘干，在电解池中取0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法对电极进行氧化活化处理，另取一个电解池，以pH=4.1的HAc-NaAc 缓冲溶液作为电解液，用循环方波伏安法分别测定只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应，循环方波伏安法参数设置中，方波振幅的设置依次采用0.01V 、0.03V 、0.04V 、0.05V 、0.10V 、0.15V 。
根据实验数据绘制不同方波振幅下循环方波伏安法对DNA 响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的方波振幅。
2.5.6 方波频率的选择
工作电极、参比电极、对电极分别选择为玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极。对工作电极-玻碳电极进行表面预处理之后，在电极表面附载石墨烯-ZnS 量子点，用热风机烘干，在电解池中取0.1mol/L的NaOH 溶液，用循环伏安法对电极进行氧化活化处理，另取一个电解池，以pH=4.1的HAc-NaAc 缓冲溶液作为电解液，用循环方波伏安法分别测定只含有电解液与DNA 溶液和含有电解液、DNA 与污染物Cr 6+的响应，循环方波伏安法参数设置中，方波频率的设置依次采用3Hz 、4Hz 、5Hz 、6Hz 、7Hz 、9Hz 。
根据实验数据绘制不同方波频率下循环方波伏安法对DNA 响应的ΔI柱状图，依据柱状图的高低，找出最佳的方波频率。
2.5.7 Cr6+浓度的测定
（1）通过上述实验找出的最佳条件，依次在上述最佳条件下采用三电极体系测定含有电解液+DNA与电解液+DNA+污染物Cr 6+溶液，得到两个电流响应值，计算两次相应的差值ΔI。
（2）Cr 6+溶液的浓度依次取1×10-1mol/L；1×10-2mol/L；1×10-3mol/L；1×10-4mol/L；1×10-5mol/L；1×10-6mol/L；1×10-7mol/L。重复步骤（1）。测定得
到不同Cr 6+浓度值下，峰电流与电位关系曲线。
（3）根据实验数据绘制在Cr 6+溶液不同浓度下峰电流随浓度的变化曲线，以Cr 6+溶液浓度对数为横坐标，响应峰电流ΔI为纵坐标，绘制标准曲线。
3 结果与讨论
3.1 不同纳米材料修饰对电极的电化学行为的影响
DNA ，又称为脱氧核糖核酸。作为生命遗传物质，其由四种具有电化学
活性的嘌呤碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤) 和嘧啶碱基(胞嘧啶、胸腺嘧啶) 组成。由于氧化嘌呤碱基所需的过电位较低，所以在研究DNA 与污染物作用时，通常选取DNA 上的嘌呤氧化信号作为研究对象。但是，直接用裸玻碳电极去检测溶液中的DNA ，其电化学信号非常微弱，而通过在电极表面修饰纳米材料GO(氧化石墨烯) 或者GO-ZnS （氧化石墨烯- ZnS量子点），并测定循环方波曲线，可明显观察到DNA 碱基鸟嘌呤与腺嘌呤的氧化峰。它们分别出现在0.75V 和1.2V 左右，它与已报道的DNA 出峰位置有偏差，这是因为pH 对它产生了影响，在不同pH 的缓冲溶液中，由于质子参与反应，从而影响DNA 碱基的出峰位置。另外，不同电极修饰材料对固定在电极表面的DNA 鸟嘌呤与腺嘌呤的出峰位置也有显著的影响[24]。由于DNA 腺嘌呤的电化学响应提高显著，因此后续实验选定腺嘌呤的氧化峰作为本文的研究对象。
图3.1a 是工作电极-玻碳电极经过循环伏安法电化学与处理的CV 曲线图，从图3.1b 可以观察到，与GCE 、GCE/GO相比较， GO-ZnS/ GCE对DNA 电化学响应的增强最为显著。其原因一是由于纳米复合材料大的比表面积有利于DNA 在电极表面的吸附；二是石墨烯、硫化锌的协同效应促进了DNA 在电极表面的电子传递。DNA 在GCE/GO-ZnS上信号的增强说明GO-ZnS 纳米复合材料能作为一种有效的电极修饰材料用于DNA 电化学生物传感器的构建。
图3.1c 中abcd 四条曲线分别表示以GO-ZnS/GCE、GO/GCE、ZnS/GCE、GCE 为测定对象，以铁氰化钾-亚铁氰化钾作为电解液，测定其交流阻抗图谱。对
交流阻抗图谱来说，斜率越大，表示它的扩散速度越快，即传质速率、对流效应越强，从图中我们可以看出：a 线，即以GO-ZnS 修饰过的玻碳电极斜率最大，这也
印证了前面的实验结果，所以，我们选择以GO-ZnS 纳米材料修饰玻碳电极。
2.01.51.0
电流
(μA )
0.50.0-0.5-1.0-1.5-2.0
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
图3.1a 循环伏安法对玻碳电极扫描CV 图
Fig. 3.1a Cyclic voltammetry on a glassy carbon electrode scanning CV Figure
电压 (V)
ΔI (μA )
电极修饰状态
图3.1b 不同纳米材料修饰电极响应结果对比图
Fig. 3.1b Different nanomaterials modified electrode response results comparison chart
图3.1c 不同纳米材料修饰电极的EIS 图(a：GO-ZnS 、b ：GO 、c ：ZnS 、d ：GCE) Fig. 3.1c EIS diagram of different nanomaterials modified electrode (a: GO-ZnS, b: GO, c: ZnS, d:
GCE)
3.2 不同预处理介质对电极的电化学行为的影响
我们通常采用恒电流氧化、循环伏安法扫描、恒电位氧化法等对电极进行电氧化预处理，有的时候还会在对电极进行一定的氧化处理之后再将它进行阴极还原处理，或者继续通过循环伏安法对它进行扫描至电极稳定。对电极进行电氧化
处理主要是想使电极达到最佳实验效果并且使得实验的重现性提高。对电极进行处理的电解液一般有酸性、碱性、中性三种。恒电位阳极氧化法是指以玻碳电极为工作电极，给它施加一个恒定的正电位，对电极作用一段时间，这一处理将对电极起到活化的目的；循环伏安法是指在一定电位下对电极进行循环扫描。本文我们选择循环伏安法预处理，分别以NaOH 、H 2SO 4、PBS 预处理介质，通过实验结果分析何种预处理介质下响应的ΔI是最大的。
在修饰玻碳电极过程中，电极氧化预处理介质在电氧化预处理中起着极为重要的影响，它会对电极表面的粗糙度、电极表面的含氧量、电极表面的物理结构等均会造成一定程度的影响，因而对电极的电化学测定过程也会带来影响。不同的预处理介质对电极的测定影响也差别各异。一般情况下会选择H 2SO 4、磷酸缓冲溶液和NaOH 作为预处理介质。经过氧化预处理，电极表面的含氧量均将会大幅提升。从图3.2可以看出：经过NaOH 做介质的响应结果要好于H 2SO 4和磷酸缓冲溶液做介质的响应，因为经过H 2SO 4氧化预处理的电极表面粗糙度比NaOH 中氧化处理的电极表面粗糙度大，在以碱性溶液作为介质时，玻碳电极只是表面发生了氧化，在酸性溶液中处理时，除了电极表面被氧化其深层也发生了氧化。通过实验数据我们可以看出，以0.1mol/L的NaOH 作为预处理介质时，电化学响应的ΔI是最大的。
ΔI (μA )
预处理介质
图3.2 不同预处理介质下电极响应结果对比柱形图
Fig. 3.2 Pretreated with different electrode response results contrast media Column
3.3 不同电解质溶液对电极的电化学行为的影响
支持电解质的组成也是影响峰电流的一个重要因素，它为体系的氧化还原反应提供一定的介质环境，电极表面所有的反应均是在该溶液中发生，它能够有效
的促进被测物在电极表面的氧化还原进程。通常情况下，支持电解质溶液的浓度越大，其电化学响应峰电流也越大，当电解质溶液浓度达到一定程度，峰电流将趋于平稳，但是这一现象并非绝对，有些情况下，对于某些特殊物质，支持电解质越小，其电化学响应峰电流反而越大，这时候就要选用浓度比较低的电解质溶液作为介质，以此来提高测定的灵敏度。支持电解质不同影响DNA 响应电流大小，同时也改变其峰电位。从图3.4我们可以看出：在相同的电极处理条件及被测物浓度下，分别于H 2S04、HAc-NaAc 、PBS 溶液中测定其响应信号，实验结果表明在以HAc-NaAc 作为电解质溶液的情况下，DNA 响应ΔI均最大。
ΔI (μA )
电解质溶液
图3.3 不同电解质溶液下电极响应结果对比柱形图
Fig. 3.3 Electrolyte solution under different electrode response bar graph comparing results
3.4 HAc-NaAc缓冲溶液pH 对电极的电化学行为的影响
为了研究pH 对GO-ZnS/GCE对DNA 电化学行为的影响，我们采用不同pH 的
HAc-NaAc 缓冲溶液来测定传感器的腺嘌呤信号，研究峰电位与峰电流ΔI的变化
情况，结果如图所示。
从图3.4我们可以看出：随着pH 从3.7增大到5.7，DNA 腺嘌呤的氧化峰电位逐渐负移。另外，由图可知，随着pH 的增大，腺嘌呤的氧化峰电流ΔI值先增加后减小。当pH 为4.1时，峰电流ΔI达到最大值。
由此我们可以得出，DNA 在HAc-NaAc 中的电化学反应为质子参与反应。pH 不仅影响腺嘌呤的氧化峰电位，同时对鸟嘌呤氧化峰电流也有显著影响。经过分析得出，在pH4.1处鸟嘌呤的氧化峰电流最大。因此，后续实验选定pH 4.1的HAc-NaAc 缓冲液作为支持电解质。
ΔI (μA )
pH
图3.4 不同缓冲溶液pH 下电极响应结果对比图
Fig. 3.4 Buffer solution under different pH electrode response results comparison chart
3.5 不同方波频率、方波振幅对电极的电化学行为的影响
循环方波伏安法灵敏度较高，响应快，而扫描电位范围、方波频率、方波振幅等均会影响响应方波峰电流的大小，因此，我们在这里探讨一下方波频率和方波振幅对实验结果的影响。
从图3.5a 我们可以发现：随着方波频率增大，响应峰电流ΔI在3Hz 到7Hz 之间先增大后减小，峰电位负移，但半峰宽也增大，并且当频率大于6Hz 时，峰形变差，对测定不利，所以本法选择频率为5Hz 。
从图3.5b 我们可以看出：当扫描振幅在0.01mV ～0.15 mV间变化时，
DNA 在0.75 V左右的氧化峰峰电流ΔI随扫描振幅的增加先增大后减小，但半峰宽也随之增加，峰形有波动，不够稳定，即峰的分辨率随振幅的增加而减小，兼顾检测的灵敏度和分辨率，选择测定的扫描振幅为0.04 mV。
ΔI (μA )
方波频率 (Hz)
图3.5a 不同方波频率下电极响应结果对比图
Fig. 3.5a Different square-wave frequency electrode response results comparison chart
ΔI (μA )
方波振幅 (V)
图3.5b 不同方波振幅下电极响应结果对比图
Fig. 3.5b Square wave amplitude under different electrode response results comparison chart
3.6 不同Cr 6+溶液浓度对电极电化学行为的影响
I (μA )
电压 (V)
图3.6a DNA电化学生物传感器测定Cr 6+电流-电压响应曲线
Fig. 3.6a DNA electrochemical biosensor measurement Cr6+ current - voltage response curve
ΔI (μA )
Lg(C(Cr6+))
图3.6b DNA电化学生物传感器腺嘌呤氧化峰电流ΔI与Cr 6+-浓度对数关系 Fig. 3.6b DNA electrochemical biosensor adenine oxidation peak current ΔI and Cr6+
concentration logarithmic relationship
图3.6a 为采用经过实验得出的各最佳条件、参数下不同浓度的Cr 6+溶液在含有DNA 的电极上的循环方波伏安图。图3.6b 为标准曲线图，从图中我们可以看出当Cr 6+离子浓度在1×10-2mol/L-1×10-8 mol/L时，Cr 6+离子浓度与DNA 对电极的电化学相应峰电流ΔI呈良好的线性关系，线性方程为y=4.95045x+0.5025LgCCr6+，线性相关系数为R=0.99777。
3.7 重现性的测定
采用GO-ZnS 负载在玻碳电极表面，以0.1mol/L的NaOH 溶液作为预处理介质，以0.1mol/L的pH=4.1的HAC-NaAc 溶液作为电解质溶液，在方波振幅为0.04V 、方波频率为5Hz 的条件下，以浓度为1×10-4mol/L的Cr 6+溶液为待测液，做重现性的测定。
表1 重现性的测定
序号 ΔI (μA) 序号 ΔI (μA) 标准偏差(%)
1 2.97033 7 2.94566
2 2.93065 8 2.96687
3 2.98325 9 2.98853
1.82
4 2.99562 10 2.97743
5 2.97156 11 2.98142
6 2.99323 12 2.97634
从表1中可以看出，电极的重现性良好，可用来对Cr 6+进行检测。
3.8 回收率的测定
表2 回收率的测定
从表2中可以看出，回收率较高。
4 结论
开展本课题采用溶解热法合成石墨烯-ZnS 量子点(GO-ZnS)，将GO-ZnS 溶液通过微量注射器注射到裸玻碳电极表面，用热风机烘干，采用循环方波伏安法研究Cr 6+溶液在电极上的电化学行为，分别测电极在含有DNA 与DNA+污染物时的相应峰电流ΔI。通过最终的实验结果，对实验条件进行优化，找出最佳的纳米材料修饰物、最佳预处理介质、最佳支持电解质、最佳pH 值、最佳方波振幅、最佳方波频率，实验结果表明：
（1）通过比较裸电极、附着了石墨烯(GO)、石墨烯-ZnS 量子点(GO-ZnS)的玻碳电极作为工作电极，用污染物测定其电化学行为。得出结论：在电电极上修饰GO-ZnS 时，响应电流峰值ΔI最大，所以选择GO-ZnS 去修饰波碳电极。 （2）研究了不同预处理介质溶液对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：以0.1mol/L的NaOH 溶液作为预处理介质时，电极的响应最好。
（3）研究了在不同电解质溶液对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：以0.1mol/LHAc-NaAc时，电极的响应最好。
（4）研究了不同HAc-NaAc 溶液pH 对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：溶液的pH 对峰电位与峰电流均有影响，说明它参与了质子反应，在pH=4.1的HAc-NaAc 溶液下，电极的响应最好。
（5）研究了不同方波振幅对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：方波振幅为0.04V 时，电极的响应最好。
（6）研究了不同方波频率对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：方波频率为5Hz 时，电极的响应最好。
（7）研究了不同浓度的Cr 6+溶液对电极的电化学行为的影响，通过实验表明：在Cr 6+溶液浓度在1×10-2mol/L-1×10-8 mol/L时，Cr 6+溶液浓度与含有DNA+电解液和DNA+ Cr 6++电解液响应峰电流ΔI呈良好的线性关系，线性方程为y=4.95045x+0.5025LgCCr6+，线性相关系数为R=0.99777。 。
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无机优先污染物与DNA 之间作用的传感研究
致 谢
时光飞逝，光阴如梭，不知不觉中我已经在美丽的长沙理工大学度过了我人生中最美好的四年时光。在这四年里，我逐渐成长，在大家的帮助下，学习了很多，也收获了很多。在论文将要完成之际，我的心中涌出了无尽的感激……
首先要深深地感谢我的导师李丹和我的分析化学老师张玲老师。科研上，是你们将我领入科研的殿堂，让我逐渐学会如何发现问题、分析问题和解决问题，你们严谨的科学态度、不断求索的科学精神以及创新活跃的科学思维都深深的感染了我。感谢你们对我实验的严格要求和悉心指导，让我逐渐形成严谨的科研态度，取得了一定的科研成果。生活中，感谢你们对我的无私关怀和无尽包容，给了我很多方面的帮助，让我能够从一次次的困境中走出来。感激的地方太多太衷心感谢李以为报，衷心祝愿恩师身体健康、万事如意！
另外，我还要感谢徐运妹学姐，是你手把手教会我文献查阅、仪器操作、实验设计，也是你无私的帮我解决实验中遇到问题、修改论文。谢谢学姐一直以来对我的包容和帮助，祝愿学姐前程似锦。
感谢我的好友：安振宇、李文杞、刘维、何世日，跟你们在同一个实验室我很开心，在我迷茫的时候开导我，在我骄傲的时候提醒我，是你们让我感受了友情的温暖，也让我更加相信友情。谢谢你们陪我一起成长，让我一路走来从不觉得孤单，在以后的日子里我也会好好珍惜我们间的这份感情。
最后，对所有关心和帮助我的老师及同学表示衷心的感谢和诚挚的问候，祝大家身体健康，万事如意！
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