High Speed Counter Current
Chromatography
(HSCCC)高速逆流色谱
1. Principle2. Properties
3. Applications
分配定律：Nernst, 1891 年，Ｋ＝Ｃ1／Ｃ2两组分K相差较大：
一次萃取可得到分离
较小：多次萃取
•1941, Martin & Synge级联链型萃取，开创了分
配色谱技术
•1944，Craig 非连续式逆流分溶
(countercurrent distribution, CCD)
•1966，Ito 离心式螺旋管逆流色谱
(countercurrent chromatography,CCC)
•1981，Ito 高速逆流色谱
High Speed Counter Current Chromatography
(HSCCC)
液液分配色谱的新纪元
CCD法（Countercurrent distribution，反流分布法，逆流分溶法）：
是一种多次连续的液-液萃取分离过程
Principle
¾利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递
¾其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管绕成的螺旋管中
¾流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系数的不同依次洗脱而获得分离特殊的流体动力学？
逆流色谱(CCC)的原理
流体静力平衡体系
（hydrostatic equilibrium system,HSES)流体动力平衡体系••
（hydrodynamic equilibrium system,HDES)
z液滴逆流色谱
(DCCC)
z旋转腔室逆流色谱
(RLCCC)
HSCCC的原理
利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相，利用恒流泵连续输入另一相，溶质在两相之间反复分配，按
分配系数的次序，被依次洗脱。
单向性流体动力平衡
Principle
固定相的保留
¾利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES）¾从而实现流动相高速移动时固定相的保留
固定相的保留原理
螺旋柱中注满差不多相等体积的两相溶剂（见右侧试管），在螺旋柱的匀速转动下两相溶剂受到“阿基米德螺旋力”的作用，竞争性地朝首端移动。不久，两相在螺旋管地首端建立一种流体动力平衡，按一定比例共存，而这种情况发生在每一圈螺旋柱内。并且任何一相的超量都会被推向螺旋管的尾端一侧。
混合区：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，两相的激烈混合静置区：两溶剂相分成两层
较重的溶剂相在外部较轻的溶剂相在内部
HSCCC
的工作流程
逆流色谱分离体系的构成几何设计硬件 ---- 螺旋管行星式离心分离仪管柱体积 柱径软件 ---- 溶剂体系操作条件---转速 流速 柱温
优点（与HPLC等液-固色谱技术比较)• 分离原理不同：互补性强 • 操作成本低：节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗 （HPLC的1/10以下），运行使用的后续投入较低 • 无需固体作固定相：不存在固体对样品组分的吸 附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很 高的回收率，理论回收率100% • 可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件：无 需更换不同极性的色谱柱即可实现流动相从弱极 性到强极性或相反的转化
• 容积大：色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，样品 负载能力强，制备量大，重现性好 盘管总体积100mL， 一次分离量：0.5-2g 盘管总体积3000mL，一次分离量：15-60g 与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达几克，是HPLC的 104-105 倍; 与常压和低压色谱相比，HSCCC的分离能力强，经过1次分离 就可以得到1个甚至多个单体，并且分离时间短。
缺点 • 分离效率（理论塔板数）还不高（
HSCCC分离条件●溶剂系统的选择是应用逆流色谱的关键。 ● 溶剂系统的选择，目前尚 无充分的理论依据，一般根据 实验积累经验。 ● 对于一个定型的仪器来 说，制备分离能力决定于溶剂 系统的选择和仪器参数
溶剂条件的筛选方法1、文献报道的溶剂条件 经典体系1：氯仿-甲醇-水：4-3-2 经典体系2：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水：1-1-1-1 2、TLC方法初步筛选 初步判断样品在上、下相中的分配情况
3、HPLC法测定分配系数分析目标组分在两相中的分配系数K值KKi =i=AUiA 2 Ui AUi 1 − AUi 2A Ui 1 − A UiV ⋅ L 2 VU2VL ⋅ VU
4、利用分析型HSCCC 时间短、溶剂消耗少等优点
溶剂系统选择的基本步骤(1)首先预测要分离物质的极性, 溶解性特点，粗 选几个溶剂体系。 (2)建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。 (3)利用HPLC测定K，并计算容量因子a， 1.5>K>0.5, a>2，能够获得理想的分离,在高极性化 合物以K>2，能获得稳定的分离。 (4）制备性分离。
溶剂系统的选择与优化Step 1:采用简单的梯度洗脱系统如水-乙腈（100:0→0:100 ）用HPLC对样品进行极性扫描分析，得到样品的极性范围
Step 2: 溶剂系统的优化
区域化合物极性A 强极性B 中极性C 非极性
溶剂系统
正己烷/正丁醇/甲醇/水正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水
正己烷/乙腈
Step 3: 溶剂比例的优化
一次只改变一种溶剂的量
取少量样品在试管中进行分配系数实验TLC或HPLC测定实验结果
高速逆流色谱技术的应用领域
•中药现代化•抗生素分离纯化•异构体分离纯化•食品行业•化学合成•生物领域
•发酵产物分离纯化
在中药现代化中的应用
量控制
指纹图谱
指导原药材种植/GAP基地建设
HSCCC在中药中各类单体的制备均有应用，经过简单的前处理（提取、萃取或大孔树脂柱）后直接上样，一次分离就能得到高纯度和高得率的单体，已成为天然产物分离纯化中有效的不可替代的分离方法。
¾中药指纹图指中药经适当处理后，采用一定的分析手段（光谱和色谱）得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱¾中药成分复杂，指纹图谱是中药质量控制的有效方法
¾2000年8月国家药品监督管理局规定中药注射剂必须建立药材和制剂的指纹图谱标准，美国FDA及欧共体药审委也要求采用指纹图谱技术
¾色谱法是指纹图谱的首选，传统的色谱指纹图谱方法存在缺陷（比如HPLC法前处理要求严格，会有死吸附或样品的变性，对有些样品不能准确反应其特征）¾HSCCC是中药指纹图谱发展的一个新方向
HSCCC作为一种高效的液液分配色谱，拥有广阔的应用空间
二、高速逆流色谱联用技术
优势
¾基于样品的浓度
¾梯度洗脱时基线稳定，无溶剂峰
¾可用于检测挥发性低于溶剂的任何化合物
¾HSCCC-ELSD联用技术已成功用于脂肪酸，生物碱，皂苷类，萜类，甾体类等的分离
注意
¾ELSD连接接头为M5型号，而HSCCC为M6型号，所以连接时需要使用转换接头(厂家提供)
¾半制备型和制备型HSCCC与ELSD检测器联用时，需用分流器实现同时检测与馏分的收集
HSCCC-ESI-MS联用技术
¾HSCCC与ESI-MS联用法是一种新近发展起来的、具有适用范围广和灵敏度高等特点的分析方法
¾可直接用于复杂样品中有关成分的鉴别和测定
¾不需要对流出液做任何分离就可用于鉴定，降低了分离过程对样品造成污染的可能性
¾适用于分析非挥发性或热不稳定性物质
¾分析速度快
¾Oka等解决了HSCCC与质谱联用的根本问题即接口问题，设计了T型连接器，发现联用并不影响色谱的分离和质谱的分析
¾HSCCC-ESI-MS联用技术已成功地用于同时在线分离和分析丹参酮ПA，EGCG，三萜酸，多肽，多酚类和黄酮类等
HSCCC-FT-IR联用技术
¾HSCCC能够获得高的溶质-溶剂比的流出物，从而使流动相吸收红外光谱的问题得到缓解
¾HSCCC与FT-IR的联用只需要一个简单的流动池接口，不需要其他附加的去除溶剂的方法
优点
¾可以在分离的同时获得被分离物的结构信息缺点
¾需要较大的样品量（每种组分0.2-1mg）
¾Romanach和De Haseth应用HSCCC-FT-IR联用技术成功地对苯酚、硝基苯酚以及乙酰苯酚等进行了分离与鉴定，在线记录相应的IR光谱
小结
随着HSCCC的普及，HSCCC与多种其他技术联用，为HSCCC的应用扩展了更大的空间。
张天佑，王晓学工业出版社参考书：《高速逆流色谱技术》化
High Speed Counter Current
Chromatography
(HSCCC)高速逆流色谱
1. Principle2. Properties
3. Applications
分配定律：Nernst, 1891 年，Ｋ＝Ｃ1／Ｃ2两组分K相差较大：
一次萃取可得到分离
较小：多次萃取
•1941, Martin & Synge级联链型萃取，开创了分
配色谱技术
•1944，Craig 非连续式逆流分溶
(countercurrent distribution, CCD)
•1966，Ito 离心式螺旋管逆流色谱
(countercurrent chromatography,CCC)
•1981，Ito 高速逆流色谱
High Speed Counter Current Chromatography
(HSCCC)
液液分配色谱的新纪元
CCD法（Countercurrent distribution，反流分布法，逆流分溶法）：
是一种多次连续的液-液萃取分离过程
Principle
¾利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递
¾其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管绕成的螺旋管中
¾流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系数的不同依次洗脱而获得分离特殊的流体动力学？
逆流色谱(CCC)的原理
流体静力平衡体系
（hydrostatic equilibrium system,HSES)流体动力平衡体系••
（hydrodynamic equilibrium system,HDES)
z液滴逆流色谱
(DCCC)
z旋转腔室逆流色谱
(RLCCC)
HSCCC的原理
利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相，利用恒流泵连续输入另一相，溶质在两相之间反复分配，按
分配系数的次序，被依次洗脱。
单向性流体动力平衡
Principle
固定相的保留
¾利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES）¾从而实现流动相高速移动时固定相的保留
固定相的保留原理
螺旋柱中注满差不多相等体积的两相溶剂（见右侧试管），在螺旋柱的匀速转动下两相溶剂受到“阿基米德螺旋力”的作用，竞争性地朝首端移动。不久，两相在螺旋管地首端建立一种流体动力平衡，按一定比例共存，而这种情况发生在每一圈螺旋柱内。并且任何一相的超量都会被推向螺旋管的尾端一侧。
混合区：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，两相的激烈混合静置区：两溶剂相分成两层
较重的溶剂相在外部较轻的溶剂相在内部
HSCCC
的工作流程
逆流色谱分离体系的构成几何设计硬件 ---- 螺旋管行星式离心分离仪管柱体积 柱径软件 ---- 溶剂体系操作条件---转速 流速 柱温
优点（与HPLC等液-固色谱技术比较)• 分离原理不同：互补性强 • 操作成本低：节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗 （HPLC的1/10以下），运行使用的后续投入较低 • 无需固体作固定相：不存在固体对样品组分的吸 附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很 高的回收率，理论回收率100% • 可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件：无 需更换不同极性的色谱柱即可实现流动相从弱极 性到强极性或相反的转化
• 容积大：色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，样品 负载能力强，制备量大，重现性好 盘管总体积100mL， 一次分离量：0.5-2g 盘管总体积3000mL，一次分离量：15-60g 与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达几克，是HPLC的 104-105 倍; 与常压和低压色谱相比，HSCCC的分离能力强，经过1次分离 就可以得到1个甚至多个单体，并且分离时间短。
缺点 • 分离效率（理论塔板数）还不高（
HSCCC分离条件●溶剂系统的选择是应用逆流色谱的关键。 ● 溶剂系统的选择，目前尚 无充分的理论依据，一般根据 实验积累经验。 ● 对于一个定型的仪器来 说，制备分离能力决定于溶剂 系统的选择和仪器参数
溶剂条件的筛选方法1、文献报道的溶剂条件 经典体系1：氯仿-甲醇-水：4-3-2 经典体系2：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水：1-1-1-1 2、TLC方法初步筛选 初步判断样品在上、下相中的分配情况
3、HPLC法测定分配系数分析目标组分在两相中的分配系数K值KKi =i=AUiA 2 Ui AUi 1 − AUi 2A Ui 1 − A UiV ⋅ L 2 VU2VL ⋅ VU
4、利用分析型HSCCC 时间短、溶剂消耗少等优点
溶剂系统选择的基本步骤(1)首先预测要分离物质的极性, 溶解性特点，粗 选几个溶剂体系。 (2)建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。 (3)利用HPLC测定K，并计算容量因子a， 1.5>K>0.5, a>2，能够获得理想的分离,在高极性化 合物以K>2，能获得稳定的分离。 (4）制备性分离。
溶剂系统的选择与优化Step 1:采用简单的梯度洗脱系统如水-乙腈（100:0→0:100 ）用HPLC对样品进行极性扫描分析，得到样品的极性范围
Step 2: 溶剂系统的优化
区域化合物极性A 强极性B 中极性C 非极性
溶剂系统
正己烷/正丁醇/甲醇/水正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水
正己烷/乙腈
Step 3: 溶剂比例的优化
一次只改变一种溶剂的量
取少量样品在试管中进行分配系数实验TLC或HPLC测定实验结果
高速逆流色谱技术的应用领域
•中药现代化•抗生素分离纯化•异构体分离纯化•食品行业•化学合成•生物领域
•发酵产物分离纯化
在中药现代化中的应用
量控制
指纹图谱
指导原药材种植/GAP基地建设
HSCCC在中药中各类单体的制备均有应用，经过简单的前处理（提取、萃取或大孔树脂柱）后直接上样，一次分离就能得到高纯度和高得率的单体，已成为天然产物分离纯化中有效的不可替代的分离方法。
¾中药指纹图指中药经适当处理后，采用一定的分析手段（光谱和色谱）得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱¾中药成分复杂，指纹图谱是中药质量控制的有效方法
¾2000年8月国家药品监督管理局规定中药注射剂必须建立药材和制剂的指纹图谱标准，美国FDA及欧共体药审委也要求采用指纹图谱技术
¾色谱法是指纹图谱的首选，传统的色谱指纹图谱方法存在缺陷（比如HPLC法前处理要求严格，会有死吸附或样品的变性，对有些样品不能准确反应其特征）¾HSCCC是中药指纹图谱发展的一个新方向
HSCCC作为一种高效的液液分配色谱，拥有广阔的应用空间
二、高速逆流色谱联用技术
优势
¾基于样品的浓度
¾梯度洗脱时基线稳定，无溶剂峰
¾可用于检测挥发性低于溶剂的任何化合物
¾HSCCC-ELSD联用技术已成功用于脂肪酸，生物碱，皂苷类，萜类，甾体类等的分离
注意
¾ELSD连接接头为M5型号，而HSCCC为M6型号，所以连接时需要使用转换接头(厂家提供)
¾半制备型和制备型HSCCC与ELSD检测器联用时，需用分流器实现同时检测与馏分的收集
HSCCC-ESI-MS联用技术
¾HSCCC与ESI-MS联用法是一种新近发展起来的、具有适用范围广和灵敏度高等特点的分析方法
¾可直接用于复杂样品中有关成分的鉴别和测定
¾不需要对流出液做任何分离就可用于鉴定，降低了分离过程对样品造成污染的可能性
¾适用于分析非挥发性或热不稳定性物质
¾分析速度快
¾Oka等解决了HSCCC与质谱联用的根本问题即接口问题，设计了T型连接器，发现联用并不影响色谱的分离和质谱的分析
¾HSCCC-ESI-MS联用技术已成功地用于同时在线分离和分析丹参酮ПA，EGCG，三萜酸，多肽，多酚类和黄酮类等
HSCCC-FT-IR联用技术
¾HSCCC能够获得高的溶质-溶剂比的流出物，从而使流动相吸收红外光谱的问题得到缓解
¾HSCCC与FT-IR的联用只需要一个简单的流动池接口，不需要其他附加的去除溶剂的方法
优点
¾可以在分离的同时获得被分离物的结构信息缺点
¾需要较大的样品量（每种组分0.2-1mg）
¾Romanach和De Haseth应用HSCCC-FT-IR联用技术成功地对苯酚、硝基苯酚以及乙酰苯酚等进行了分离与鉴定，在线记录相应的IR光谱
小结
随着HSCCC的普及，HSCCC与多种其他技术联用，为HSCCC的应用扩展了更大的空间。
张天佑，王晓学工业出版社参考书：《高速逆流色谱技术》化