植物组织中超氧化物歧化酶（SOD ），过氧化物酶（POD ）, 过氧化氢
酶（CAT ），丙二醛（MDA ），和可溶性蛋白质的测定
酶液制备 1g 样品叶片剪碎放入研钵，加入2ml 0.05M pH7.8的PBS （磷酸缓冲
液）及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10ml 离心管，再加3ml PBS于研钵冲
洗研钵后倒入离心管，15000转下离心5min ，上清液为酶提取液，取上清液?ml ,
移入10ml 容量瓶中，用PBS 定容。 1 SOD的测定 ⑴ 0．05M 磷酸缓冲液配定方法
设磷酸二氢钠，磷酸氢二钠浓度分别为c1，c2mol/L。
由题意，c1+c2=0.05
再根据缓冲溶液ph 计算公式：pH=pKa+lg(c碱/c酸) 可得7.2+lg(c2/c1)=7.8
其中7.2是磷酸二氢根的pKa 值，7.8是溶液的pH 值。
联立解得c1=0.01，c2=0.04
所以磷酸二氢钠质量为0.01 * 120.0 = 1.20 克
磷酸氢二钠质量为0.04 * 142 .0= 5.68 克
称取1.20克无水磷酸二氢钠(或1.38克一水磷酸二氢钠，1.56克二水磷酸二氢钠)
和5.68克无水磷酸氢二钠（或10.72克七水磷酸氢二钠，14.32克十二水磷酸氢
二钠），置于烧杯中，加少量蒸馏水溶解。固体全部溶解后，将溶液转移到1000
毫升容量瓶中。用蒸馏水润洗溶解用的烧杯三次，润洗后的水也加入到容量瓶中，
定容，即得。
⑵ 130m M MET(甲硫氨酸) ：取1.9399gMET 用磷酸缓冲液定容至100ml 。棕色瓶
避光4℃保存。
⑶750u M NBT(氮蓝四唑) ：取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 。棕色瓶
避光4℃保存。
⑷100u M EDTA-Na2 :取0.03721 EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml 。棕色瓶
避光保存。
⑸20u M MFD(核黄素) ：0.00753MFD 用蒸馏水定容至1000ml 。棕色瓶避光保存。
反应液 PBS（PH 7.8） 50m M 1.5ml
MET(甲硫氨酸) 130m M 0.3ml
NBT （氮蓝四唑） 750u M 0.3ml
EDTA 100u M 0.3ml
MFD （核黄素） 20u M 0.3ml
酶液 50ul
蒸馏水 0.25ml
共3ml ，30℃，4000lux 光照15min ，560nm 比色。
对照，空白 不加酶液（加50um PBS 7.8），空白暗处下放置；
每个试验重复3次（3试验+3空白+3对照）
560nm 测定各管光密度值
2 MDA的测定
1ml 酶提取液+反应混合液，沸水浴20min ，冷却，1500转离心10min ，测定532,600nm 波长下比色。
混合液配制 TCA(三氯乙酸)101.25g+TBA(硫代巴比妥酸)2.5g, 加热溶解，定容至500ml, 试验时4ml 混合液加1ml 酶提取液即可。
3 POD 的测定
在试管中依次加入4ml 0.3%愈创木酚（0.02M pH6磷酸缓冲液配置），50ul 酶液，50ul0.3% H2O 2, 摇匀，立即计时，1min 后在470nm 波长下比色，每1min 记录一
次吸光度值，连续记录5min ，以每分钟内A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位（U ）
0.02M pH6磷酸缓冲液配置
取2.964g 二水磷酸二氢钠和2.592g 十二水磷酸氢二钠置于烧杯中，加少量蒸馏水溶解。固体全部溶解后，将溶液转移到1000毫升容量瓶中。用蒸馏水润洗溶解用的烧杯三次，润洗后的水也加入到容量瓶中，定容，即得。
4 CAT 活性测定
取10ml 试管3支，其中2支样品测定管，一支为对照空白，按下表加入试剂 管号 S0 S1 S2
酶提取液(ml) 0.2 0.2 0.2
PBS (ml) 1.5 1.5 1.5
蒸馏水（ml ） 1.0 1.0 1.0
将 S0号管在沸水浴煮，1min 以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃下预
热后，逐管加入0.3ml 0.1mol/l的H 2O 2，每加完一管立即计时，并迅速倒入石
英比色皿中，在240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数一次，共测定4min ，待3支管全部测完，计算酶活。
5可溶性蛋白测定
（1）标准蛋白质溶液：100ug •M1-1牛血清蛋白：称取牛血清蛋白25mg, 加水溶解并定容至100ml, 吸取上述溶液40ml, 用蒸馏水稀释至100ml 即可。
（2）5mlG-250考马斯亮蓝+25ul酶提取液，2min 后在595nm 下比色，
G-250配置，100mgG-250加50ml95%乙醇溶解后，加100ml85%磷酸后用水定容至1000ml 。贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。（注：酶液用量要适宜，pr 含量过低时再多加入，否则比色记出负数）
方法：
1. 标准曲线的绘制
取6支具塞试管，按表加入试剂，混合均匀后，向各管中加入5ml 考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min 左右，在595nm 下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白（ml ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（ug ） 0 20 40 60 80 100 2 样品测定
（1） 样品提取： 鲜样0.5g ，加入2ml 蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml 蒸
馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min ，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml 容量瓶，摇匀后待测。
（2） 吸取样品提取液0.1ml ，放入具塞试管（每个样品重复两次），加入5ml
考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min 后在595nm 下比色，测定吸光度，并通过标准曲线蛋白质含量。
（3） 结果计算（单位mg/g）
样品中蛋白质含量=（C •V T ）/(1000VS •W F )
式中：C-查的的标准值（ug ）
V T 提取液总体积（ml ）；W F -样品鲜重（g ）；V S -测定时加样量（ml ）
植物组织中超氧化物歧化酶（SOD ），过氧化物酶（POD ）, 过氧化氢
酶（CAT ），丙二醛（MDA ），和可溶性蛋白质的测定
酶液制备 1g 样品叶片剪碎放入研钵，加入2ml 0.05M pH7.8的PBS （磷酸缓冲
液）及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10ml 离心管，再加3ml PBS于研钵冲
洗研钵后倒入离心管，15000转下离心5min ，上清液为酶提取液，取上清液?ml ,
移入10ml 容量瓶中，用PBS 定容。 1 SOD的测定 ⑴ 0．05M 磷酸缓冲液配定方法
设磷酸二氢钠，磷酸氢二钠浓度分别为c1，c2mol/L。
由题意，c1+c2=0.05
再根据缓冲溶液ph 计算公式：pH=pKa+lg(c碱/c酸) 可得7.2+lg(c2/c1)=7.8
其中7.2是磷酸二氢根的pKa 值，7.8是溶液的pH 值。
联立解得c1=0.01，c2=0.04
所以磷酸二氢钠质量为0.01 * 120.0 = 1.20 克
磷酸氢二钠质量为0.04 * 142 .0= 5.68 克
称取1.20克无水磷酸二氢钠(或1.38克一水磷酸二氢钠，1.56克二水磷酸二氢钠)
和5.68克无水磷酸氢二钠（或10.72克七水磷酸氢二钠，14.32克十二水磷酸氢
二钠），置于烧杯中，加少量蒸馏水溶解。固体全部溶解后，将溶液转移到1000
毫升容量瓶中。用蒸馏水润洗溶解用的烧杯三次，润洗后的水也加入到容量瓶中，
定容，即得。
⑵ 130m M MET(甲硫氨酸) ：取1.9399gMET 用磷酸缓冲液定容至100ml 。棕色瓶
避光4℃保存。
⑶750u M NBT(氮蓝四唑) ：取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 。棕色瓶
避光4℃保存。
⑷100u M EDTA-Na2 :取0.03721 EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml 。棕色瓶
避光保存。
⑸20u M MFD(核黄素) ：0.00753MFD 用蒸馏水定容至1000ml 。棕色瓶避光保存。
反应液 PBS（PH 7.8） 50m M 1.5ml
MET(甲硫氨酸) 130m M 0.3ml
NBT （氮蓝四唑） 750u M 0.3ml
EDTA 100u M 0.3ml
MFD （核黄素） 20u M 0.3ml
酶液 50ul
蒸馏水 0.25ml
共3ml ，30℃，4000lux 光照15min ，560nm 比色。
对照，空白 不加酶液（加50um PBS 7.8），空白暗处下放置；
每个试验重复3次（3试验+3空白+3对照）
560nm 测定各管光密度值
2 MDA的测定
1ml 酶提取液+反应混合液，沸水浴20min ，冷却，1500转离心10min ，测定532,600nm 波长下比色。
混合液配制 TCA(三氯乙酸)101.25g+TBA(硫代巴比妥酸)2.5g, 加热溶解，定容至500ml, 试验时4ml 混合液加1ml 酶提取液即可。
3 POD 的测定
在试管中依次加入4ml 0.3%愈创木酚（0.02M pH6磷酸缓冲液配置），50ul 酶液，50ul0.3% H2O 2, 摇匀，立即计时，1min 后在470nm 波长下比色，每1min 记录一
次吸光度值，连续记录5min ，以每分钟内A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位（U ）
0.02M pH6磷酸缓冲液配置
取2.964g 二水磷酸二氢钠和2.592g 十二水磷酸氢二钠置于烧杯中，加少量蒸馏水溶解。固体全部溶解后，将溶液转移到1000毫升容量瓶中。用蒸馏水润洗溶解用的烧杯三次，润洗后的水也加入到容量瓶中，定容，即得。
4 CAT 活性测定
取10ml 试管3支，其中2支样品测定管，一支为对照空白，按下表加入试剂 管号 S0 S1 S2
酶提取液(ml) 0.2 0.2 0.2
PBS (ml) 1.5 1.5 1.5
蒸馏水（ml ） 1.0 1.0 1.0
将 S0号管在沸水浴煮，1min 以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃下预
热后，逐管加入0.3ml 0.1mol/l的H 2O 2，每加完一管立即计时，并迅速倒入石
英比色皿中，在240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数一次，共测定4min ，待3支管全部测完，计算酶活。
5可溶性蛋白测定
（1）标准蛋白质溶液：100ug •M1-1牛血清蛋白：称取牛血清蛋白25mg, 加水溶解并定容至100ml, 吸取上述溶液40ml, 用蒸馏水稀释至100ml 即可。
（2）5mlG-250考马斯亮蓝+25ul酶提取液，2min 后在595nm 下比色，
G-250配置，100mgG-250加50ml95%乙醇溶解后，加100ml85%磷酸后用水定容至1000ml 。贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。（注：酶液用量要适宜，pr 含量过低时再多加入，否则比色记出负数）
方法：
1. 标准曲线的绘制
取6支具塞试管，按表加入试剂，混合均匀后，向各管中加入5ml 考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min 左右，在595nm 下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白（ml ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（ug ） 0 20 40 60 80 100 2 样品测定
（1） 样品提取： 鲜样0.5g ，加入2ml 蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml 蒸
馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min ，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml 容量瓶，摇匀后待测。
（2） 吸取样品提取液0.1ml ，放入具塞试管（每个样品重复两次），加入5ml
考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min 后在595nm 下比色，测定吸光度，并通过标准曲线蛋白质含量。
（3） 结果计算（单位mg/g）
样品中蛋白质含量=（C •V T ）/(1000VS •W F )
式中：C-查的的标准值（ug ）
V T 提取液总体积（ml ）；W F -样品鲜重（g ）；V S -测定时加样量（ml ）