2008年11月
第18卷 第11期中国比较医学杂志CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINENovember,2008Vol.18 No.11研究报告
小鼠主动脉弓缩窄模型的建立及评价
李晓梅,马依彤,杨毅宁,高晓明,刘 芬,韩 伟,张健发
(1.新疆医科大学第一附属医院心脏中心,乌鲁木齐 830054;
2.Baker心脏研究所实验心脏病学研究室,Melbourne6492,澳大利亚)
【摘要】 目的 通过显微外科技术建立小鼠主动脉弓缩窄压力超负荷模型,探讨心脏形态及功能变化的规
律。方法 135只雄性昆明小鼠随机分为主动脉弓缩窄组75只和假手术组60只。在术前、术后1周、4周、6周、8
周、12周进行高频心脏超声、血流动力学、心脏病理学检测,并对器官称重,对死亡原因进行分析。结果 (1)主动
脉弓缩窄手术成功率为88%;(2)与假手术组比较,术后4周,缩窄组小鼠出现左室向心性肥厚,左心室收缩期、舒
张期后壁厚度(Pwsth;Pwdth)、左心室重量指数(LVMI)显著增加(P
势;术后4、6、8、12周,缩窄组小鼠动脉收缩压(SBP)、动脉舒张压(DBP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压
(LVEDP)显著增加(P
上升和下降最大速率(dp dtmax;dp dtmin)显著降低(P
LVEDP显著降低(P
心衰的动物模型,类似人类心肌肥厚向心衰发展的病理过程,是用于临床研究的一种较理想动物模型。
【关键词】 主动脉弓缩窄;压力负荷;左室肥厚;心力衰竭
【中图分类号】Q463 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856(2008)11-0024-061112111
EstablishmentandAssessmentofaMouseModelofAorticArchConstriction
LIXiao-mei1,MAYi-tong1,YANGYi-ning1,GAOXiao-ming2,LIUFen1,HANWei1,ZHANGJian-fa1
(1.DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,
XinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830054,China;
2.ExperimentalCardiologylaboratory,BeckerHeartResearchInstitute,Melbourne6492,Australia)
【Abstract】 Objective Toestablishthetransverseaorticconstriction(TAC)mousemodelthroughmicrosurgeryandto
explorethechangedtendencyofheartstructureandfunction.Methods 135KMmicerandomlyweredividedintotwogroups:transverseaorticconstriction(TAC)group(n=75)andsham-operation(SH)group(n=60).Echocardiographicassessments
witha15MHzHFlineararraytransducer,hemodynamicdetermination,heartweightandhistologicalexaminationwereperformed
beforeandat1,4,6,8,10and12weeksaftersurgery.Thecauseofdeathwasanalyzed.Results (1)Thesuccessrateof
TACwas88%.(2)ComparedwithSH,Pwsth、Pwdth、LVMIofTACgroupat4weekincreasedsignificantly(P
aboveindexshowedalightlyprogressiveincreaseat6、8、12week.SBP、DBP、LVSP、LVEDPofTACgroupat4、6、8、12week
wereincreasedsignificantly(P
significantlyincreased(P
[基金项目]新疆维吾尔自治区高校科研计划创新研究群体基金(XJEDU2005G03)。
中国比较医学杂志2008年11月第18卷第11期 ChinJCompMed,November2008,Vol.18.No.1125(P
(P
heartfailurebypressureoverloadhavedeveloped.Thismodelissimilartopathogeneticprocessofhumanheartdisease.
【Keywords】 Transverseaorticconstriction;Pressureoverload;Leftventricularhypertrophy;Heartfailure
主动脉弓缩窄致左室肥厚模型是一种理想的符
合人类左室肥厚病理生理过程的动物模型,借助
该模型对大鼠进行心血管相关药物、分子生物学研
究的例证较广泛[2][1]在右颈总动脉分出后0.3cm处,用26～27G垫扎针头(直径0.4～0.6mm,自制)垫扎(可造成70%左右狭窄),对主动脉及垫扎针进行结扎(结扎部位见图1),结扎确实后抽出垫扎针,检查主动脉弓近心端波
动增强,逐层关胸,缝皮。手术切口处用红霉素眼膏
涂敷并皮下注射0.5mL生理盐水,待小鼠自主呼吸
恢复后脱机拔管,移至加热垫继续观察至苏醒。假
手术组同期开胸但不进行主动脉弓结扎。。近年来,随着转基因动物的技术的兴起,借助小鼠进行心血管疾病研究成为一种新的趋势,但对小鼠建立该模型具有一定难度,国内尚缺乏制作该模型的相关报道。本研究通过自制器械,使用微创显微外科方法对昆明小鼠建立主动脉
弓缩窄压力超负荷左室肥厚模型,并进行不同时间
点无创高频经胸心脏超声、有创血液动力学检测及
形态学观察,了解心脏形态及功能的变化,探讨此模
型构建中的具体问题,为今后该模型的应用研究奠
定基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物及分组:8～10周龄清洁级雄性昆
明(KM)小鼠135只,体重22～25g,由新疆医科大学
实验动物中心提供[生产许可证SCXK(新)2003-
0001],随机分2组,假手术组术前、术后1周、4周、6
周、8周、12周各个时间点各10只共60只及缩窄组
每时间点各15只共75只。
1.1.2 主要仪器:687型小动物呼吸机(美国
HARVARD公司)、INTRALUX-5000-1鹅颈冷光源、
XSM-100体视手术显微镜、REF加热垫(美国
GAYMAR公司)、小鼠外科显微手术器械、Powerlab
工作站及传感器、美国惠普5500Sonos超声及15MHz
超声探头、L L-S分析天平。
1.2 实验方法
1.2.1 主动脉弓缩窄小鼠模型制作:小鼠经腹腔注
射氯胺酮(80mg kg)、甲苯噻嗪(20mg kg)和阿托品
(0.6mg kg)混合液麻醉,麻醉生效后,采用自制小
鼠插管(20G静脉套管针外鞘及自制导丝,长度30
mm)行气管插管,接呼吸机控制呼吸(频率90～100
次 min、潮气量0.4～0.5mL)。小鼠仰卧位固定于
操作台恒温垫(30℃),清洁手术区域,双目体视显微
镜(下操作,取胸前正中切开皮肤,上至胸骨上窝,下
图1 主动脉弓缩窄部位示意图Fig.1 Conceptualdiagramoftransverseaorticconstriction(TAC)1.2.2 超声心功能评价方法及观察指标:参照马依彤等[3]小鼠超声检查方法,于术前、术后1周、4周、6周、8周、12周对假手术组及手术组小鼠行经胸超声检查。获得M型超声心动图像,测量心率,左心室收缩期、舒张期后壁厚度(Pwsth;Pwdth),左心室收缩末期、舒张末期内径(LVESd;LVEDd)和左心室舒张外径(EXLVDd);左心室射血分数(LVejectionfraction,EF%)按以下公式计算:EF%=(EDV-ESV) EDV,左心室重量(LVmass,LVM),左心室重量指数(LVmassindex,LVMI)按以下公式计算:LVM(mg)=33(ExLVDd-LVEDd)×1.055,LVMI(mg g)=LVM bodyweight,所有测量均由两位超声医师双盲法操作,取两者均值。1.2.3 血流动力学监测:于术前、术后1周、4周、6周、8周、12周对各组存活小鼠行微导管术进行血液
固定于操作台恒温垫,于镜下取颈部正中切口,钝性
分离右侧颈总动脉,结扎远心端,牵拉阻断近心端,
应用自制成角穿刺针(30G注射针头)于远心端穿刺
血管,将微导管经穿刺点插入右颈总动脉、升主动
脉,插至左心室内,并经压力换能器连接多道生理放
大器,记录心率(HR)、动脉收缩压(SBP)、动脉舒张
压(DBP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压
(LVEDP)及左心室压力上升和下降最大速率(dp
dtmax;dp dtmin)。所有结果记录于电脑内,以自带
分析软件选择连续8～10个心动周期进行测量。
1.2.4 标本采集与处理:术后观察小鼠的呼吸,发
绀程度、毛发色泽,活动度。发现死亡立即解剖,判
断死亡原因。各时间点小鼠行血液动力学检测,称
重(BW)后处死,迅速开胸取出心脏,剪去心脏周围
组织和血管,沿房室沟将左心房剪下,沿室间沟将
右心室游离壁去除称左心室重量(LVW),称取肺脏
(LungW)重量,分别计算各器官重量指数LVW B
W,LungW BW。
1.2.5 病理组织学检测:左心室标本10%福尔马林
固定,沿左室冠状面切取环状心肌组织切片(间距0.6mm,厚度5μm),梯度乙醇脱水,石蜡切片,HE染色,显微镜下观察。1.2.6 统计分析:应用SPSS12.0统计软件包进行数据处理。文中计量数据用均数±标准差( x±s)表示,两组间比较采用t检验,率比较采用x检验,变量间采用简单相关分析。2 结果2.1 模型的存活率及并发症在预实验观察中,发现主动脉弓缩窄术中及术后24h导致小鼠死亡主要原因为主动脉弓破裂、喉头水肿及大血管损伤等。技术稳定后,主动脉弓缩窄术中及术后24h内死亡率12%(9 75),术后1周死亡率7%(5 66);术中及术后一周死亡率为18.7%(14 75),60只假手术组术后无1例死亡。2.2 各组不同时间点组织重量比较各时点假手术组与缩窄组小鼠体重相比,差异无统计学意义(P>0.05);术后4周,缩窄组LV、LVW BW均明显高于假手术组(P
图2 不同时间点体重(BW)(A)、左室重量(LVW)(B)、左室重量指数(LVW BW)(C)、肺脏重量指数(LungW BW)(D)变化,△表示缩窄组(n=8),□,表示假手术组(n=6).各时间点缩窄组与同期假手术组比较,﹡P
Fig.2 Timecourseofthechangesinbodyweight(BW)(A),leftventricularWeight(LVW)(B),theLVweight-to-bodyweightratio(LVW BW)(C),theLungweight-to-bodyweightratio(LungW BW)(D).△,animalssubjectedtotransverseaortic
加83%((145±25)mgvs(79±7)mg),并呈上升趋
势;6、8、12周缩窄组LVW BW保持较恒定水平;缩
窄术后12周时缩窄组LungW BW比值较假手术组
明显增加,差异有统计学意义(P
同程度的左心及全心衰(图2A-D)
。
2.3 各组不同时点超声结果比较
与假手术相比较,术后4周缩窄组Pwsth、
Pwdth、LVMI显著增加,差异有统计学意义(P
0.05),术后6、8、12周上述指标呈轻度上升趋势;术
后8周起,LVESd、LVEDd显著增加,差异有统计学意义(P0.05);术后4、6、8、12周缩窄组
图3 不同时间点各组小鼠左室舒张期后壁厚度(Pwdth)(A)、左室收缩期后壁厚度(Pwsth)(B)、左心室舒张末期内
径((LVEDd)(C)、左心室收缩末期内径(LVESd)(D)、左室射血分数(EF%)(E)、左室重量指数(LVMI)(F)的变化.△表示缩窄组(n=8),□,表示假手术组(n=6).各时间点缩窄组与同期假手术组比较,＊P
Fig.3 Changesinducedbytransverseaorticconstriction(TAC)inposteriorwallthicknessatdiastole(Pwdth)(A),posteriorwallthicknessatsystole(Pwsth)(B),LVend-diastolicdimensions(LVEDd)(C),LVend-systolicdimensions(LVESd)(D),
ejectionfraction(EF%)(E),andleftventricular(LV)massindex(LVMI)(F),△,animalssubjectedtotransverseaortic
28中国比较医学杂志2008年11月第18卷第11期 ChinJCompMed,November2008,Vol.18.No.11SBP、DBP、LVSP、LVEDP均显著增加,(P
8周缩窄组比较,12周缩窄组上述指标均显著降低
(P
dtmin较假手术组均显著增加(P
表1 不同时间点血液动力学参数变化
Tab.1 TimecourseofthechangesinHemodynamicsparameters
组别Group术前Beforeoperation1周1week假手术组
SH
n=6
353±14
90±12
4±1n=6342±2388±75±1缩窄组TACn=8351±25132±11＊4.6±0.94周4week假手术组SHn=6350±1291±611±2缩窄组TACn=8367±21138±18＊19±1＊6周6week假手术组SHn=6349±1489±164±1缩窄组TACn=8330±23146±17＊22±2＊8周8week假手术组SHn=6345±2487±93±1缩窄组TACn=8361±12129±18＊6±2＊12周12week假手术组SHn=6359±1589±33.6±0.3缩窄组TAC TACn=8342±24101±7#心率(HR)beats min收缩压(SBP)mmHg舒张压(DBP)mmHg
10.2±0.3＊#
左心室收缩压
(LVSP)mmHg
左心室舒张末压
(LVEDP)mmHg
左心室压力上升最大
速率(+dp dtmax)mmHg s
左心室压力下降最大速
率(-dp dtmin)mmHg s95±86.5±0.86368±2345275±21191±25.8±0.8115±37.5±1.294±1142±5＊90±3150±12＊90±7155±8＊96±3112±4＊11.0±0.1＊#4011±251＊#3833±321＊#5.0±0.66.0±0.6＊6.7±0.67.2±0.7＊5.6±0.47.0±0.6＊5.2±0.36236±4327721±4676654±3757258±3507388±4909536±314＊6455±3878690±202＊6543±4566548±2546654±4445035±4666808±3314763±2906307±270＊6051±4277464±286＊5642±434
#P注:各时间点缩窄组与同期假手术组比较,＊P
Note:＊P
2.5 组织形态学观察
病理组织切片观察发现:假手术组心肌纤维排
列正常,无血管扩张及血管壁增厚等表现;4周后手
术组表现为心肌细胞胞浆变宽,细胞核变大,在相同
倍数单位面积细胞数减少,心肌细胞排列不整齐、着
色不匀,心肌细胞间连接松散;12周时心脏肌纤维
疏松水肿,间隙增宽,部分肌束间纤维结缔组织增
生,心肌细胞肥大明显(图4,见彩插Ⅱ)。
3 讨论
心肌肥厚可以是一种生理性反应,但在许多心
血管疾病,如高血压、冠心病、瓣膜病时,长期心肌肥
大,最终可导致心力衰竭,其病理生理过程、分子
[5]生物学及药物干预一直是研究的一个热点。使动
物主动脉弓缩窄,将增加左心排出血液的阻力,导致
心脏做功与耗氧量增加,由于压力负荷过度将导致
心肌肥厚到心衰、心衰从代偿走向失代偿,与临床心
血管疾病具有良好的相关性。
本实验参照国外高晓明方法进行一定改良,
通过微创手术法对国产昆明小鼠主动脉弓进行缩
窄,即缩窄处位于右头臂动脉和左颈总动脉之间,由
于右头臂动脉可部分分流血液,因此可逐渐形成左
室肥厚的动物模型,该方法较好模拟左室肥厚患者
[6][4]厚建模时间长的缺点。手术切口取胸骨正中上至胸骨上窝,下至第二肋骨水平,术中无需切开胸膜,避免术后膨肺,极大减少手术中对肺及胸膜的损伤,降低手术死亡率。笔者对该模型进行的前期预实验时发现,小鼠围手术期死亡率较高,约20%,主要原因为小鼠进行显微外科操作难度较大,易损伤大血管及周围组织导致手术中即刻发生大出血死亡;主动脉弓缩窄程度过重及手术早期尚未形成左室肥厚代偿机制易导致小鼠急性心衰发生;术中损伤主动脉的外膜致术后主动脉弓破裂。因此为提高手术成功率,避免上述原因发生,术中的主要操作要点如下:①寻找主动脉弓时分离周围组织手法要细致,避免损伤周围组织,否则易导致主动脉弓与周围组织发生炎性水肿、粘连,损伤主动脉外膜;②应选用合适结扎线对主动脉弓进行结扎,不宜选用过细丝线,过细丝线易离断主动脉弓;③在丝线穿过主动脉弓时,注意不要过分牵拉主动脉弓,尽量保持主动脉弓的原位,以免牵拉损伤主动脉弓外膜;④进行主动脉弓结扎时,结扎不易过紧,应松紧适度,避免垫扎针抽出时损伤主动脉弓。⑤主动脉弓结扎应迅速,较长时间阻断主动脉弓易导致心脏停搏,增加死亡率。手术熟练后,偶见主动脉弓破裂,手术平均时间为8～10min,手术成功率为88%左右。[7]
中国比较医学杂志2008年11月第18卷第11期 ChinJCompMed,November2008,Vol.18.No.1129关,国外报道主动脉弓严重缩窄术后3d即可出现
左室肥厚[8]bandinginmice:effectsofalteredcardiomyocyteinsulinsignalingduringpressureoverload[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2003,
285(3):1261-1269.
[2] MooreXL,TanSL,LoCY,etal.Relaxinantagonizeshypertrophy
andapoptosisinneonatalratcardiomyocytes[J].Endocrinology.
2007,148(4):1582-1589.
[3] 马依彤,杨毅宁,高晓明,等.应用高频超声评价小鼠缺血性
心肌病左室重塑的实验研究[J].中国超声医学杂志,2006,22
(10):730-733.
[4] BerenjiK,DraznerMH,RothermelBA,etal.Doesloadinduced
ventricularhypertrophyprogresstosystolicheartfailure[J]?Am
JPhysiolHeartCircPhysiol,2005,289(1):8-16.
[5] LorellBH,CarabelloBA.Leftventricularhypertrophy-pathogenesis,
detectionandprognosis[J].Circulation,2000,102(4):470-479.
[6] GaoXM,KiriazisH,MooreXL,etal.Regressionofpressure
overload-inducedleftventricularhypertrophyinmice[J].AmJ
PhysiolHeartCircPhysiol,2005,288(6):2702-2707.
[7] NakamuraA,RokoshDG,PaccanaroM,etal.LVsystolic
performanceimproveswithdevelopmentofhypertrophyafter
transverseaorticconstrictioninmice[J].AmJPhysiolHeartCirc
Physiol,2001,281(9):1104-1112.
[8] LiaoY,IshikuraF,BeppuS,etal.Echocardiographicassessment
ofLVhypertrophyandfunctioninaortic-bandedmice:necropsy
validation[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2002,282(5):
1703-1708.
〔修回日期〕2008-05-06,缩窄程度重则术后心衰出现时间早而肥厚持续时间短,反之则短时间内不易形成心肌肥厚。本研究对主动脉弓进行60%～70%中度狭窄建立缩窄模型后,通过高频超声心动图对心脏进行连续、反复的观察,结果显示术后4周缩窄组即出现心肌向心性肥厚;4周至6周左室壁增厚维持稳定;至8周出现离心性肥厚,表现为左室壁增厚,左室扩张,心功能正常;12周左室壁无进一步增厚,左室扩张,心功能下降,出现失代偿性心力衰竭。小鼠解剖称重发现,第四周小鼠左室重量、左室重量指数明显增加,左室重量增加呈明显上升趋势,而左室重量指数维持稳定,因其可除外体重增加因素,因此左室重量指数是较好评判肥厚的指标,与超声指标LVMI具有较好的符合性;此外,术后连续心导管检查及组织病理学染色均证实上述结论。提示术后4周即可出现稳定心肌肥厚,且心肌肥厚的发展和收缩功能的减退是一个时间依赖性的过程;同时也提示在动物模型建立的过程中,超声心动图为心肌肥厚的形态及功能监测提供可靠无创性检查技术手段。在技术成熟的基础上,通过主动脉弓缩窄可以成功建立的小鼠左室肥厚———心衰的动物模型,该
模型为左室肥厚研究提供了稳定可靠的动物模型平
台。
参考文献:
[1] HuP,ZhangD,SwensonL,etal.Minimallyinvasiveaortic[10]
2008年11月
第18卷 第11期中国比较医学杂志CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINENovember,2008Vol.18 No.11研究报告
小鼠主动脉弓缩窄模型的建立及评价
李晓梅,马依彤,杨毅宁,高晓明,刘 芬,韩 伟,张健发
(1.新疆医科大学第一附属医院心脏中心,乌鲁木齐 830054;
2.Baker心脏研究所实验心脏病学研究室,Melbourne6492,澳大利亚)
【摘要】 目的 通过显微外科技术建立小鼠主动脉弓缩窄压力超负荷模型,探讨心脏形态及功能变化的规
律。方法 135只雄性昆明小鼠随机分为主动脉弓缩窄组75只和假手术组60只。在术前、术后1周、4周、6周、8
周、12周进行高频心脏超声、血流动力学、心脏病理学检测,并对器官称重,对死亡原因进行分析。结果 (1)主动
脉弓缩窄手术成功率为88%;(2)与假手术组比较,术后4周,缩窄组小鼠出现左室向心性肥厚,左心室收缩期、舒
张期后壁厚度(Pwsth;Pwdth)、左心室重量指数(LVMI)显著增加(P
势;术后4、6、8、12周,缩窄组小鼠动脉收缩压(SBP)、动脉舒张压(DBP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压
(LVEDP)显著增加(P
上升和下降最大速率(dp dtmax;dp dtmin)显著降低(P
LVEDP显著降低(P
心衰的动物模型,类似人类心肌肥厚向心衰发展的病理过程,是用于临床研究的一种较理想动物模型。
【关键词】 主动脉弓缩窄;压力负荷;左室肥厚;心力衰竭
【中图分类号】Q463 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856(2008)11-0024-061112111
EstablishmentandAssessmentofaMouseModelofAorticArchConstriction
LIXiao-mei1,MAYi-tong1,YANGYi-ning1,GAOXiao-ming2,LIUFen1,HANWei1,ZHANGJian-fa1
(1.DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,
XinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830054,China;
2.ExperimentalCardiologylaboratory,BeckerHeartResearchInstitute,Melbourne6492,Australia)
【Abstract】 Objective Toestablishthetransverseaorticconstriction(TAC)mousemodelthroughmicrosurgeryandto
explorethechangedtendencyofheartstructureandfunction.Methods 135KMmicerandomlyweredividedintotwogroups:transverseaorticconstriction(TAC)group(n=75)andsham-operation(SH)group(n=60).Echocardiographicassessments
witha15MHzHFlineararraytransducer,hemodynamicdetermination,heartweightandhistologicalexaminationwereperformed
beforeandat1,4,6,8,10and12weeksaftersurgery.Thecauseofdeathwasanalyzed.Results (1)Thesuccessrateof
TACwas88%.(2)ComparedwithSH,Pwsth、Pwdth、LVMIofTACgroupat4weekincreasedsignificantly(P
aboveindexshowedalightlyprogressiveincreaseat6、8、12week.SBP、DBP、LVSP、LVEDPofTACgroupat4、6、8、12week
wereincreasedsignificantly(P
significantlyincreased(P
[基金项目]新疆维吾尔自治区高校科研计划创新研究群体基金(XJEDU2005G03)。
中国比较医学杂志2008年11月第18卷第11期 ChinJCompMed,November2008,Vol.18.No.1125(P
(P
heartfailurebypressureoverloadhavedeveloped.Thismodelissimilartopathogeneticprocessofhumanheartdisease.
【Keywords】 Transverseaorticconstriction;Pressureoverload;Leftventricularhypertrophy;Heartfailure
主动脉弓缩窄致左室肥厚模型是一种理想的符
合人类左室肥厚病理生理过程的动物模型,借助
该模型对大鼠进行心血管相关药物、分子生物学研
究的例证较广泛[2][1]在右颈总动脉分出后0.3cm处,用26～27G垫扎针头(直径0.4～0.6mm,自制)垫扎(可造成70%左右狭窄),对主动脉及垫扎针进行结扎(结扎部位见图1),结扎确实后抽出垫扎针,检查主动脉弓近心端波
动增强,逐层关胸,缝皮。手术切口处用红霉素眼膏
涂敷并皮下注射0.5mL生理盐水,待小鼠自主呼吸
恢复后脱机拔管,移至加热垫继续观察至苏醒。假
手术组同期开胸但不进行主动脉弓结扎。。近年来,随着转基因动物的技术的兴起,借助小鼠进行心血管疾病研究成为一种新的趋势,但对小鼠建立该模型具有一定难度,国内尚缺乏制作该模型的相关报道。本研究通过自制器械,使用微创显微外科方法对昆明小鼠建立主动脉
弓缩窄压力超负荷左室肥厚模型,并进行不同时间
点无创高频经胸心脏超声、有创血液动力学检测及
形态学观察,了解心脏形态及功能的变化,探讨此模
型构建中的具体问题,为今后该模型的应用研究奠
定基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物及分组:8～10周龄清洁级雄性昆
明(KM)小鼠135只,体重22～25g,由新疆医科大学
实验动物中心提供[生产许可证SCXK(新)2003-
0001],随机分2组,假手术组术前、术后1周、4周、6
周、8周、12周各个时间点各10只共60只及缩窄组
每时间点各15只共75只。
1.1.2 主要仪器:687型小动物呼吸机(美国
HARVARD公司)、INTRALUX-5000-1鹅颈冷光源、
XSM-100体视手术显微镜、REF加热垫(美国
GAYMAR公司)、小鼠外科显微手术器械、Powerlab
工作站及传感器、美国惠普5500Sonos超声及15MHz
超声探头、L L-S分析天平。
1.2 实验方法
1.2.1 主动脉弓缩窄小鼠模型制作:小鼠经腹腔注
射氯胺酮(80mg kg)、甲苯噻嗪(20mg kg)和阿托品
(0.6mg kg)混合液麻醉,麻醉生效后,采用自制小
鼠插管(20G静脉套管针外鞘及自制导丝,长度30
mm)行气管插管,接呼吸机控制呼吸(频率90～100
次 min、潮气量0.4～0.5mL)。小鼠仰卧位固定于
操作台恒温垫(30℃),清洁手术区域,双目体视显微
镜(下操作,取胸前正中切开皮肤,上至胸骨上窝,下
图1 主动脉弓缩窄部位示意图Fig.1 Conceptualdiagramoftransverseaorticconstriction(TAC)1.2.2 超声心功能评价方法及观察指标:参照马依彤等[3]小鼠超声检查方法,于术前、术后1周、4周、6周、8周、12周对假手术组及手术组小鼠行经胸超声检查。获得M型超声心动图像,测量心率,左心室收缩期、舒张期后壁厚度(Pwsth;Pwdth),左心室收缩末期、舒张末期内径(LVESd;LVEDd)和左心室舒张外径(EXLVDd);左心室射血分数(LVejectionfraction,EF%)按以下公式计算:EF%=(EDV-ESV) EDV,左心室重量(LVmass,LVM),左心室重量指数(LVmassindex,LVMI)按以下公式计算:LVM(mg)=33(ExLVDd-LVEDd)×1.055,LVMI(mg g)=LVM bodyweight,所有测量均由两位超声医师双盲法操作,取两者均值。1.2.3 血流动力学监测:于术前、术后1周、4周、6周、8周、12周对各组存活小鼠行微导管术进行血液
固定于操作台恒温垫,于镜下取颈部正中切口,钝性
分离右侧颈总动脉,结扎远心端,牵拉阻断近心端,
应用自制成角穿刺针(30G注射针头)于远心端穿刺
血管,将微导管经穿刺点插入右颈总动脉、升主动
脉,插至左心室内,并经压力换能器连接多道生理放
大器,记录心率(HR)、动脉收缩压(SBP)、动脉舒张
压(DBP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压
(LVEDP)及左心室压力上升和下降最大速率(dp
dtmax;dp dtmin)。所有结果记录于电脑内,以自带
分析软件选择连续8～10个心动周期进行测量。
1.2.4 标本采集与处理:术后观察小鼠的呼吸,发
绀程度、毛发色泽,活动度。发现死亡立即解剖,判
断死亡原因。各时间点小鼠行血液动力学检测,称
重(BW)后处死,迅速开胸取出心脏,剪去心脏周围
组织和血管,沿房室沟将左心房剪下,沿室间沟将
右心室游离壁去除称左心室重量(LVW),称取肺脏
(LungW)重量,分别计算各器官重量指数LVW B
W,LungW BW。
1.2.5 病理组织学检测:左心室标本10%福尔马林
固定,沿左室冠状面切取环状心肌组织切片(间距0.6mm,厚度5μm),梯度乙醇脱水,石蜡切片,HE染色,显微镜下观察。1.2.6 统计分析:应用SPSS12.0统计软件包进行数据处理。文中计量数据用均数±标准差( x±s)表示,两组间比较采用t检验,率比较采用x检验,变量间采用简单相关分析。2 结果2.1 模型的存活率及并发症在预实验观察中,发现主动脉弓缩窄术中及术后24h导致小鼠死亡主要原因为主动脉弓破裂、喉头水肿及大血管损伤等。技术稳定后,主动脉弓缩窄术中及术后24h内死亡率12%(9 75),术后1周死亡率7%(5 66);术中及术后一周死亡率为18.7%(14 75),60只假手术组术后无1例死亡。2.2 各组不同时间点组织重量比较各时点假手术组与缩窄组小鼠体重相比,差异无统计学意义(P>0.05);术后4周,缩窄组LV、LVW BW均明显高于假手术组(P
图2 不同时间点体重(BW)(A)、左室重量(LVW)(B)、左室重量指数(LVW BW)(C)、肺脏重量指数(LungW BW)(D)变化,△表示缩窄组(n=8),□,表示假手术组(n=6).各时间点缩窄组与同期假手术组比较,﹡P
Fig.2 Timecourseofthechangesinbodyweight(BW)(A),leftventricularWeight(LVW)(B),theLVweight-to-bodyweightratio(LVW BW)(C),theLungweight-to-bodyweightratio(LungW BW)(D).△,animalssubjectedtotransverseaortic
加83%((145±25)mgvs(79±7)mg),并呈上升趋
势;6、8、12周缩窄组LVW BW保持较恒定水平;缩
窄术后12周时缩窄组LungW BW比值较假手术组
明显增加,差异有统计学意义(P
同程度的左心及全心衰(图2A-D)
。
2.3 各组不同时点超声结果比较
与假手术相比较,术后4周缩窄组Pwsth、
Pwdth、LVMI显著增加,差异有统计学意义(P
0.05),术后6、8、12周上述指标呈轻度上升趋势;术
后8周起,LVESd、LVEDd显著增加,差异有统计学意义(P0.05);术后4、6、8、12周缩窄组
图3 不同时间点各组小鼠左室舒张期后壁厚度(Pwdth)(A)、左室收缩期后壁厚度(Pwsth)(B)、左心室舒张末期内
径((LVEDd)(C)、左心室收缩末期内径(LVESd)(D)、左室射血分数(EF%)(E)、左室重量指数(LVMI)(F)的变化.△表示缩窄组(n=8),□,表示假手术组(n=6).各时间点缩窄组与同期假手术组比较,＊P
Fig.3 Changesinducedbytransverseaorticconstriction(TAC)inposteriorwallthicknessatdiastole(Pwdth)(A),posteriorwallthicknessatsystole(Pwsth)(B),LVend-diastolicdimensions(LVEDd)(C),LVend-systolicdimensions(LVESd)(D),
ejectionfraction(EF%)(E),andleftventricular(LV)massindex(LVMI)(F),△,animalssubjectedtotransverseaortic
28中国比较医学杂志2008年11月第18卷第11期 ChinJCompMed,November2008,Vol.18.No.11SBP、DBP、LVSP、LVEDP均显著增加,(P
8周缩窄组比较,12周缩窄组上述指标均显著降低
(P
dtmin较假手术组均显著增加(P
表1 不同时间点血液动力学参数变化
Tab.1 TimecourseofthechangesinHemodynamicsparameters
组别Group术前Beforeoperation1周1week假手术组
SH
n=6
353±14
90±12
4±1n=6342±2388±75±1缩窄组TACn=8351±25132±11＊4.6±0.94周4week假手术组SHn=6350±1291±611±2缩窄组TACn=8367±21138±18＊19±1＊6周6week假手术组SHn=6349±1489±164±1缩窄组TACn=8330±23146±17＊22±2＊8周8week假手术组SHn=6345±2487±93±1缩窄组TACn=8361±12129±18＊6±2＊12周12week假手术组SHn=6359±1589±33.6±0.3缩窄组TAC TACn=8342±24101±7#心率(HR)beats min收缩压(SBP)mmHg舒张压(DBP)mmHg
10.2±0.3＊#
左心室收缩压
(LVSP)mmHg
左心室舒张末压
(LVEDP)mmHg
左心室压力上升最大
速率(+dp dtmax)mmHg s
左心室压力下降最大速
率(-dp dtmin)mmHg s95±86.5±0.86368±2345275±21191±25.8±0.8115±37.5±1.294±1142±5＊90±3150±12＊90±7155±8＊96±3112±4＊11.0±0.1＊#4011±251＊#3833±321＊#5.0±0.66.0±0.6＊6.7±0.67.2±0.7＊5.6±0.47.0±0.6＊5.2±0.36236±4327721±4676654±3757258±3507388±4909536±314＊6455±3878690±202＊6543±4566548±2546654±4445035±4666808±3314763±2906307±270＊6051±4277464±286＊5642±434
#P注:各时间点缩窄组与同期假手术组比较,＊P
Note:＊P
2.5 组织形态学观察
病理组织切片观察发现:假手术组心肌纤维排
列正常,无血管扩张及血管壁增厚等表现;4周后手
术组表现为心肌细胞胞浆变宽,细胞核变大,在相同
倍数单位面积细胞数减少,心肌细胞排列不整齐、着
色不匀,心肌细胞间连接松散;12周时心脏肌纤维
疏松水肿,间隙增宽,部分肌束间纤维结缔组织增
生,心肌细胞肥大明显(图4,见彩插Ⅱ)。
3 讨论
心肌肥厚可以是一种生理性反应,但在许多心
血管疾病,如高血压、冠心病、瓣膜病时,长期心肌肥
大,最终可导致心力衰竭,其病理生理过程、分子
[5]生物学及药物干预一直是研究的一个热点。使动
物主动脉弓缩窄,将增加左心排出血液的阻力,导致
心脏做功与耗氧量增加,由于压力负荷过度将导致
心肌肥厚到心衰、心衰从代偿走向失代偿,与临床心
血管疾病具有良好的相关性。
本实验参照国外高晓明方法进行一定改良,
通过微创手术法对国产昆明小鼠主动脉弓进行缩
窄,即缩窄处位于右头臂动脉和左颈总动脉之间,由
于右头臂动脉可部分分流血液,因此可逐渐形成左
室肥厚的动物模型,该方法较好模拟左室肥厚患者
[6][4]厚建模时间长的缺点。手术切口取胸骨正中上至胸骨上窝,下至第二肋骨水平,术中无需切开胸膜,避免术后膨肺,极大减少手术中对肺及胸膜的损伤,降低手术死亡率。笔者对该模型进行的前期预实验时发现,小鼠围手术期死亡率较高,约20%,主要原因为小鼠进行显微外科操作难度较大,易损伤大血管及周围组织导致手术中即刻发生大出血死亡;主动脉弓缩窄程度过重及手术早期尚未形成左室肥厚代偿机制易导致小鼠急性心衰发生;术中损伤主动脉的外膜致术后主动脉弓破裂。因此为提高手术成功率,避免上述原因发生,术中的主要操作要点如下:①寻找主动脉弓时分离周围组织手法要细致,避免损伤周围组织,否则易导致主动脉弓与周围组织发生炎性水肿、粘连,损伤主动脉外膜;②应选用合适结扎线对主动脉弓进行结扎,不宜选用过细丝线,过细丝线易离断主动脉弓;③在丝线穿过主动脉弓时,注意不要过分牵拉主动脉弓,尽量保持主动脉弓的原位,以免牵拉损伤主动脉弓外膜;④进行主动脉弓结扎时,结扎不易过紧,应松紧适度,避免垫扎针抽出时损伤主动脉弓。⑤主动脉弓结扎应迅速,较长时间阻断主动脉弓易导致心脏停搏,增加死亡率。手术熟练后,偶见主动脉弓破裂,手术平均时间为8～10min,手术成功率为88%左右。[7]
中国比较医学杂志2008年11月第18卷第11期 ChinJCompMed,November2008,Vol.18.No.1129关,国外报道主动脉弓严重缩窄术后3d即可出现
左室肥厚[8]bandinginmice:effectsofalteredcardiomyocyteinsulinsignalingduringpressureoverload[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2003,
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〔修回日期〕2008-05-06,缩窄程度重则术后心衰出现时间早而肥厚持续时间短,反之则短时间内不易形成心肌肥厚。本研究对主动脉弓进行60%～70%中度狭窄建立缩窄模型后,通过高频超声心动图对心脏进行连续、反复的观察,结果显示术后4周缩窄组即出现心肌向心性肥厚;4周至6周左室壁增厚维持稳定;至8周出现离心性肥厚,表现为左室壁增厚,左室扩张,心功能正常;12周左室壁无进一步增厚,左室扩张,心功能下降,出现失代偿性心力衰竭。小鼠解剖称重发现,第四周小鼠左室重量、左室重量指数明显增加,左室重量增加呈明显上升趋势,而左室重量指数维持稳定,因其可除外体重增加因素,因此左室重量指数是较好评判肥厚的指标,与超声指标LVMI具有较好的符合性;此外,术后连续心导管检查及组织病理学染色均证实上述结论。提示术后4周即可出现稳定心肌肥厚,且心肌肥厚的发展和收缩功能的减退是一个时间依赖性的过程;同时也提示在动物模型建立的过程中,超声心动图为心肌肥厚的形态及功能监测提供可靠无创性检查技术手段。在技术成熟的基础上,通过主动脉弓缩窄可以成功建立的小鼠左室肥厚———心衰的动物模型,该
模型为左室肥厚研究提供了稳定可靠的动物模型平
台。
参考文献:
[1] HuP,ZhangD,SwensonL,etal.Minimallyinvasiveaortic[10]