植物实时荧光定量PCR内参基因的选择

中国农业科技导报，２００９，１ｌ（６）：３０—３６ＪｏｕｍａｌｏｆＡ加ｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ明ｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

植物实时荧光定量ＰＣＲ内参基因的选择

胡瑞波，

范成明，傅永福

（中国农业科学院作物科学研究所，国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京１０００８１）摘

要：实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ

ｑｕａｔｌｔｉｔａｔｉｖｅ

Ｄｅｖｅｒｓｅ

ｔｒ粕ｓｃｒｉｐｌｉｏｎＰＣＲ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）具有定量准确、灵敏

度高和高通量等特点，已被广泛应用于基因的表达分析。常规ｑＲＴ—ＰｃＲ采用相对定量进行分析，其关键步骤是选择合适的稳定内参基因进行校正和标准化。持家基因被广泛用作内参基因，但在所有生理条件下均稳定表达的理想内参基凶并不存在。大多数传统内参基因已不能满足ｑＲＴ－ＰｃＲ准确定量的要求。基于基因芯片表达数据和ＥｓＴ数据库并结合ｑＲＴ—ＰｃＲ，可以筛选稳定性好的新的内参基因。简要综述ｒ植物ｑＲＴ—ＰｃＲ内参基冈的研究进展，并就内参基冈的选择中应注意的问题进行了探讨。

关键词：实时荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ；内参基因；ｇｅＮｏ珊；基因表达

中图分类号：Ｑ７８９

文献标识码：Ａ

文章编号：１００８旬８“（２００９）０６ＪＤ０３０旬７

ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＧｅｎｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＲｅａｌ－ｔｉｍｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ

ＲｅＶｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ

ＰＣＲ（ｑＲＴ—ＰＣＲ）

Ｒｅ８０ｕｒｃｅ锄ｄＧｅｎｅｔｉｃＩＩｎｐｒｏｖｅｍｅｍ，

ＨＵＲｕｉ－ｂｏ，ＦＡＮＣｈｅｎｇ—ｍｉｎｇ，ＦＵＹｏｎｇ—ｆｕ

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ｔｒａｍｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ；ｒｅｆ每ｒｅｎｃｅｇｅｎｅｓ；ｇｅＮｏ珊；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

实时荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ

ｒｅｖｅｒｓｅ

ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ

ｔｒａｎ８ｃｒｉｐｔｉｏｎ

ＰＣＲ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）是在传统

进行校正和标准化‘３，４１。ｑＲＴ．ＰＣＲ结果的准确性在很大程度上取决于内参基冈的选择。本文就植物ｑＲＴ—ＰＣＲ内参基因的研究进展作简要综述。

１

ＰＣＲ技术基础上发展起来的一种新的核酸定量技术，具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量等特点，已被广泛应用于基因的表达分析¨，２Ｊ。在ｑＲＴ—ＰｃＲ中，为了去除不同样本在ＲＮＡ产量、质量和反转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择内参基因

内参基因的选择标准

理想的内参基因应满足以下条件：①在不同

发育阶段和不同组织器官中稳定表达‘４１；②表达

收稿日期：２００９ｍ３－２５；修回日期：２００９一ｌＯ－２８

基金项目：国家８６３计划项日（２００６ＡＡｌＯＡｌｌｌ，２００７ＡＡｌＯｚｌｌ９）；国家转基因重大专项（２００８ｚｘ０８０９ＪＤ０１）；“十一五”国家科技支撑

计划项目（２００７ＢＡＤ５９肋２）资助。

作者简介：胡瑞波，博十研究生。研究方向为植物发育分子生物学。Ｅ．咖ｉｌ：ｍｙｈｕ＠ｙａＩＩｏｏ．ｃｎ。通讯作者：傅永福，研究员，主要研究

方向为植物发育分子生物学。１＇ｅｌ：０１０．８２１０５８６７；Ｅ—ｍｉｌ：胁１９ｃｎ＠１６３．ｃｍ

６期

胡瑞波等：植物实时荧光定最ＰｃＲ内参基因的选择

３ｌ

不受细胞周期调控，不受诸如温度、光照、生物或非牛物胁迫等内源和外源信号的影响㈣；③其稳

定的表达水平与目标基因表达水平相近‘６｜。但迄今为止，尚未发现这样的理想内参基因。

２传统内参基因的缺陷

在植物ｑＲＴ—ＰＣＲ研究中用的最多的内参基因通常是持家基因（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅｓ），主要包括１８ＳｒＲＮＡ，３一磷酸甘油醛脱氢酶基因（甜只

ＤⅣ），转录延伸因子基因（朋－Ｊ仅），多聚泛素酶基

因（∞ｐ），肌动蛋白摹因（Ａｃｒ），０【微管蛋白基因

和Ｂ微管蛋白基因（删，形８）等＂’４’６’７Ｉ。在前

基因组时代，人们之所以选择持家基因作内参基因是因为持家基因是牛物体维持生命活动所必需

的细胞器骨架的基本组分（Ａｃｍ阴，刚曰等）或

参与牛物体的基本生化代谢过程（ＧＡ肋日，ＥＦ．

，ａ，蝴ｐ等），因此持家基因应该在所有的细胞和

生理状态下都较稳定地表达。但是，最近一些研

究表明，持家基因在不同细胞类型和不同生理状态下的表达并不是恒定不变的¨。．９Ｊ。这就使持家基因作为ｑＲＴ—ＰｃＲ内参基因的功能受到挑战。

但是长期以来，人们在没有更好的内参基因供选择的情况下，仍采用传统的持家基冈作内参

基因而不去考虑在该实验条件下持家基因的表达是否会发生变化。这主要是由于以往的基因表达

分析中，人们主要依赖于Ｎｏｒｈｔｅｍ杂交、组织化学

染色或ＲＴ—ＰＣＲ，而这种分析基本上是定性分析

或相对定量分析，持家基因由于表达丰度高，如果

目标基因表达被上调或下调就能明显表现出来。但是ｑＲＴ—ＰＣＲ是对基冈表达的准确定量分析，传统的持家基因就不能满足定量分析对内参基因的

要求。再者，持家基凶在某些组织器官、发育时期或生理状态一般是稳定表达的，而当实验条件改

变时它们的表达也会发生变化，而且不同类型的样品（如不同器官问的比较）持家基因的表达也不一样。如果考虑小到内参基因表达的变化就会导致ｑＲＴ—ＰｃＲ的结果准确性降低甚至得到卡Ｈ反或错误的结论¨¨１２Ｊ。例如１８ＳｒＲＮＡ基因常被用

来作内参基因，但是并不是十分理想ＪＪ。其一，

１８ｓ

ｒＲＮＡ表达丰度很高，当目标基因丰度较低

时，定量结果准确性较低；其二，１８ＳｒＲＮＡ要求反

转录必须使用随机引物，而目标基因反转录常使用ｏｌ培ｏｄＴ，这可能会使二者的反转录效率不同而影响基囚表达水平的可比性；其三，不同生理状态的组织器官中ｒＲＮＡ与ｍＲＮＡ的比例并不是恒定不变的，ｍＲＮＡ通常占总ＲＮＡ的５％一１０％【ｌ

３｜。

虽然ｒＲＮＡ合成的调节独立于ｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ的转

录易受到各种生物因素和药物的影响，其表达水平也并不是恒定不变的，在有丝分裂期间，１８Ｓ

ｒＲＮＡ明显减少或停止表达。再者，ＲＮＡ的部分

降解对１８ｓｒＲＮＡ的表达水平的影响似乎要小于

对ｍＲＮＡ的影响¨４｜。

Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ等【１列分析了拟南芥１０个传统内参基因（ＡＣ珐，ＡＣ刀，ＡＣ飓，ＡＰ＂，ｅ几ａ，ｅ，群ａ，

ＴＵＢ２，ＴＵＢ６，ＴＵＢ９，ＵＢＱ４，ＵＢＱ５，ＵＢＱｌｏ，

珊ＱＪＪ）在１４个不同组织器官中的表达稳定性，

结果表明不同内参基因的稳定性存在显著差异，

ＡＪｐ＂和池∞的稳定性相对最好，而刑腼的稳

定性最差。

Ｋｉｍ等。叫分析了４个水稻内参基因（１８ｓ

ｒＲＮＡ，甜ＰＤ日，ＡＣ丁，刚Ｂ）表达稳定性，结果表明

１８Ｓ

ｒＲＮＡ无论是在不同发育时期的黄化苗，还是

在不同品种和紫外伤害下的黄化苗，表达均最为

稳定。Ｊａｉｎ等｜１６Ｊ分析了１０个常用内参基因（１８Ｓ

ｒＲＮＡ，２５Ｓ

ｒＲＮＡ，硼Ｃ，瑚∞，叩Ｑ，Ｄ，ＡＣ丌，，

ＧＡＰＤ日，ＥＦＪｄ，ｅ伊４仅和？础）在２５个水稻样品中的表达稳定性，结果表明邶∞和ＥＦ，ａ在不

同发育时期和组织器官中稳定性最好，而１８ｓ

ｒＲＮＡ和２５ＳｒＲＮＡ在逆境胁迫样品中的稳定性最好。

李钱峰等Ⅲｏ以６个籼粳稻品种胚乳为研究

材料，分析了７个常用持家基因（ｅＥ几如，胛４口，

瑚｝Ｃ，甜尸Ｄ日，船９巧，观和ＡＣ死）表达稳定

性，通过ｇｅＮｏ唧分析表明：不同的品种间，ｅＥＦ勘

和ＡＣ＂的表达最为稳定，咄ｃ的表达变化最为

明显。

Ｈｏｎｇ等¨引分析了９个短柄草内参基因

（ＡＣＴ７．ＲＣＡ，ＥＦｌ仅，ＧＡＰＤＨ，ｓ伍ｍＤＣ，ＴＵＡ６，

叩ｃＪ８，叩钟，昭ＱＪ）在２１个不同发育时期组织

器官在逆境胁迫（干旱、盐、冷、热）和激素条件下的表达稳定性，ｇｅＮｏ肿和ＮｏＨｎＦｉｎｄｅｒ分析表明泛素结合酶基因１８（ｕ占ｃ，８）在所有供试样品中表

达稳定性最好，船僻和ⅧＱＪＤ在不同组织器官

和发育时期样品中表达最为稳定，Ｓ一腺苷甲硫氨

酸合成酶基因（疏ｍＤＣ）在环境胁迫样品中的表

３２

中国农业科技导报ｌｌ卷

达最为稳定。

Ｊｉａｎ等【１引分析了１０个大豆内参基因（ＡＣ呓／

７．ＡＣＴｌｌ。ＴＵＡ，ＴＵＢ，ＥＬＦｌ仅，ＵＢＣ２，ＥＬＦｌｂ，ＣＹＰ２，

伤ＰＤ，叩ＱＪ『Ｄ）在２１个不同发育时期、组织器官

等样本中的表达稳定性，结果表明ｌＯ个内参基因的表达稳定性存在显著差异，在所有供试样品中

脱几６和Ｃ凇稳定性最好，笳尸Ｄ和叩ｐ，Ｏ的

稳定性最差。在不同的组织器官或发育时期样品

中，其稳定性也不同，脱Ｆ，６和Ｃ脚适合于组织

器官样品的表达分析，而ＡＣ挖／７和丁蚴在不同

发育时期的样品中表达稳定性最好。

涂礼莉等Ⅲ１分析了７个内参基因（１８Ｓ

ｒＲＮＡ，胍幻棚，ⅧＱ７，Ａｃ￡ｉ以，Ｃ冲，叩ＱＪ，叩Ｑ２）

在棉花不同组织和不同发育时期的表达稳定性，发现在纤维发育的后期这些基因的表达都下调，而纤维发育后期特异表达基因ＡＧＰ的表达则上

调。舰￡ｏ棚，咄Ｑ和叩ＱＪ在棉花纤维发育过程

中稳定性较好，而Ａｃ眩和昭Ｑ２稳定性最差。

Ｎｉｃｏｔ等【ｌ¨分析了７个传统内参基因（Ａｃｒ，

ＡＰＲｒ，１８Ｓ

ｒＲＮＡ，Ｅ川仅，兀倡，Ｃ，ｒＰ，Ｒ沾傩ＤｍｏＺ

ｐ厂ｏ￡ｅ流Ｌ２）在马铃薯生物胁迫（晚疫病）和逆境胁

迫（盐、干旱）条件下的表达稳定性，结果表明ＥＦＪｄ的稳定性最好。以不同稳定性的内参基因

作标准，目标基因丘啦Ｄ．２的表达水平变化很大，用稳定性差的内参基因作内参导致＾啦Ｄ．２的表

达水平有较大的误差。

Ｉｓｋａｎｄａｒ等旧¨分析了４个内参基因（ＡＣｒ，

ｒⅧ，翻ＪｐＪ｜）片，２５Ｓ

ｒＲＮＡ）在甘蔗不同组织器官和

不同品种中的表达稳定性，结果表明２５Ｓ

ｒＲＮＡ

在不同样品间的表达水平最为一致，以Ｐ嬲在不

同组织器官中稳定性最好。

Ｂｍｎｎｅｒ等【８１分析了ｌＯ个传统内参基因

０ＵＢＱｌｌ．ＩＵＡ，１８ｓｒＲＮＡ。ＡＣ您．ＵＢＱ７．ＥＦｌｂ。ｌＵＢ。

Ａｃ＂Ｊ，剧丹６，Ｃ印）在杨树８个不同发育时期样

品中的表达稳定性，发现不同的内参基因的稳定性存在显著差异，１８ｓ

ｒＲＮＡ表达丰度最高，删

表达丰度最低，ⅧＱＪＪ『和ｒ泓在不同样品间变异

系数最小，表达最为稳定，而ｃｙＰ稳定性最差。

综上，已有研究结果表明，不同植物和不同样品间的ｑＲＴ—ＰｃＲ内参基肉的稳定性存在显著差

异。因而，针对特定的实验条件和样品类型选择合适的内参基因进行标准化对于得到准确的基因

表达结果至关重要。

３

内参基因筛选的新策略

合适的内参基因的选择应取决于研究者的实

验条件，因此在一种实验条件下合适的内参基因并不一定适用另一种实验条件，或者不同植物间的内参基因＿ＨＪ．能也是不同的。因此在ｑＲＴ—ＰＣＲ中有必要对内参基因的表达稳定性进行评价并选出适合不同实验条件下使用的内参基因。Ｖａｎｄｅ—ｓｏｍｐｅｌｅ等悼２ｏ开发．ｒ专门用于分析内参基因稳定

性的程序ｇｅＮｏ珊（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｇｅｎ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／～ｊｖｄｅｓｏｍｐ／ｇｅｎｏ咖），不但可以分析内参基因在不

同样品中的表达稳定性，计算出内参基因表达稳定性的Ｍ值，肘值越大稳定性越差，反之，稳定性越好。还可计算引入１个新的内参基因后标准化

因子（ｎｏ咖ａｌｉｚａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）的配对变异（ｐａｉｒｗｉｓｅ

ｖａｒｉａｔｉｏｎ）ｙ值，并可根据‰／‰＋ｌ比值来判定引入１个新的内参基因是否会对标准化因子产生显著影响，默认的ｙ值为０．１５，如果‰／‰＋１大于Ｏ．１５，则有必要引入第乃＋１个基冈，反之，则不必

引入新的内参基因。在内参基因的稳定性分析中，可以利用ｇｅＮｏ彻程序来确定准确定量所需要

的合适的内参基因数目。Ａｎｄｅｒｓｅｎ等旧纠也开发

了同类的程序Ｎｏ咖Ｆｉｎｄｅｒ。与ｇｅＮｏ珊的计算方法不同，Ｎｏ咖Ｆｉｎｄｅｒ是基于方差分析对内参基因

的表达稳定性进行直接评价。在哺乳动物、酵母和细菌中，已有很多研究用该类软件去评价内参基因的稳定性并筛选合适的内参基因ⅢＪ。但是在植物基因表达分析中，相关的研究还较少。

３．１

基于基因表达芯片数据发现新的内参基因大量基冈表达芯片数据为新的内参基因的选

择开辟了一条新的途径。通过对基因芯片数据的分析可以发现在不同生理条件或细胞类型中稳定表达的基因。Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ等【１２ｌ利用拟南芥全基因组ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＡＴＨｌ基因芯片数据，筛选ｒ

２２

个在不同发育时期、逆境胁迫（盐分、干旱、冷害）、生物胁迫、激素、营养缺乏（硫素、碳源、磷）和不同光照条件下稳定表达的基因，并用ｑＲＴ—ＰｃＲ比较了该２２个新的内参基因与５个传统的

常用内参基因（ＡＣ眩，ｒ班珩，朋一Ｊａ，咖Ｑ，０，ＧＡＰ－

朋）在不同生长条件和逆境胁迫下的表达稳定

性。结果表明，多数新的内参基因的表达稳定性

均显著优于传统的内参基因，７删Ｊ（Ａ确筘铊７Ｄ），

６期

胡瑞波等：植物实时荧光定量ＰｃＲ内参基凶的选择

３３

鲥＾口（４砣晓舳９Ｄ）和ＰＰ２Ａ（ＡｔＪｇ，刀加）可以作为新的内参基因，而在以前的基因表达分析中广

泛使用的４Ｃ跎是稳定性最差的。而且一些新的

内参基因（如艘弘）的表达丰度要明显低于传统

的内参基因，这对定量表达丰度较低的目标基因

时尤为有效。

Ｌｉｈａｕｌｔ等陋１通过分析大豆已发表的基因芯片数据，发现，多达２００个稳定性较好的基因，并

对其中１８个基因在不同发育时期、组织器官、逆

境胁迫（创伤、激素、锈病）１３０个样本进行了

ｑＲＴ—ＰＣＲ表达分析，结果表明多数基因的稳定性优于传统内参基因Ａｃｒ和ｓ班｝，２。但是，肽酶

５Ｊ６基因和呼吸爆发氧化酶基因的稳定性最差，

说明通过基因芯片数据筛选到的基因必须经过ｑＲＴ—ＰｃＲ实验的验证。筛选出了４个新的大豆

内参基因，分别为ＡＢＣ转运凶子基因，Ｆ－ｂｏｘ家族

基因，胰岛素降解酶基因和ｃＤＰＫ蛋白激酶基因。

但是，ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ等¨副的研究结果并没有引起人们的足够重视，在过去几年中，很多研究者在

进行植物基囚表达分析时仍倾向于使用传统的持

家基因作内参，而没有在各自的实验条件下对这些内参基因的稳定性做任何验证分析。３．２基于ＥＳＴ数据库发现新的内参基因

Ｆａｃｃｉｏｌｉ等Ⅲ１建立了一套从大麦ＥｓＴ数据库筛选新的内参基因的方法。首先根据ｃＤＮＡ文库来源对大麦公共数据库中的ＥｓＴ序列进行分类，

从中寻找在特定ｃＤＮＡ文库中出现频率高即表达

丰度较高的ＥｓＴ序列，再结合网络搜索得到这些

基因在不同实验条件下（如逆境胁迫）的表达谱，筛选出了一批稳定性较好的候选内参基因，并通过ｑＲＴ—ＰｃＲ验证得到４个大麦的新的内参基因

分别为Ｓ一腺苷蛋氨酸脱羧酶基因、甜ＰＤ日、热激蛋白＾印９Ｄ基因和一个未知功能基因

（ＴＣｌ３９０５６）。

Ｃｏｋｅｒ等１２川统计分析了番茄ＥＳＴ数据库中

的１２７个基因在不同ｃＤＮＡ文库中的出现频率，

并据此来判断基因的表达稳定性，得出５个稳定性最好的基因：Ｄａｎ—Ｊ蛋白基因，肿瘤蛋白基因，ＴＵＡ。ＣＹＰ瓢ＧＡＰＤＨ。

４新的内参基因的表达稳定性评价

Ｒｅｍａｎｓ等‘圳分析了拟南芥在铜（Ｃｕ）和镉

（Ｃｄ）胁迫条件下１０个内参基因表达的稳定性，

这１０个基因包括３个传统的常用持家基因和７个Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ等¨纠报道的新的内参候选基因，分析结果表明并非所有的新的内参基因的表达稳定性均优于传统内参基因，Ａ巧ＧＪ５７，Ｄ（Ｆ－ｂｏｘ蛋白基因），Ａ呓晓韶９Ｄ（鲥ⅣＤ）和４巧６Ｄ８２９Ｄ（ｙＬｓ８）可作为今后该类实验中的新的内参基因。而在以往研究中广泛使用的内参基因Ｅｐ，ａ和ＡＣ挖因稳定性太差不应再继续使用。但是新的内参基冈

孤ｗＪ，溜Ｃ和ＰＰＲ即∞￡基因在铜（Ｃｕ）和镉

（Ｃｄ）胁迫条件的表达稳定性最差，反而不如传统内参基因。

Ｅｘｐ６ｓｉｔｏ—ＲｏｄｒＩｇｕｅｚ等Ⅲ１分析了４个新的候

选内参基因（卯丹．ｆ，酗ⅣＤ，ｃＡＣ和ＳＧⅣ．叩拍。卿）

ＡＰ丁，Ｄ＾Ｈ．，，Ｍ）在番茄２７个不同发育时期的组

和７个传统持家基因（甜ＰＤＨ，Ｅ盯ａ，船尸，彤瑚，

织器官中的表达稳定性，应用ｇｅＮｏ瑚，Ｎｏ丌ｎＦｉｎｄｅｒ

和变异系数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ

ｏｆ

ｖ撕ａｔｉｏｎ）进行分析，结

果表明４个新的候选内参基因的稳定性均显著优于传统内参基因，明ｃ和孤ｗ，的稳定性最好，而

胛Ｊｄ和咒从的稳定性最差。

Ｒｅｉｄ等ｍ１分析了１４个内参基因（Ａ丹７，

ＣＹＰ，ＥＦｌｏ【，ＧＡＰＤＨ，ＭＤＨ，ＰＰ２Ａ，ｓＡＮＤ，ＴｌＰ４ｌ，

ｒ以，７１凇，叩Ｃ，叩Ｑ．厨Ｄ，咖Ｑ，Ｄ）在葡萄浆果发

育过程中的表达稳定性，其中包括３个新的内参

基因ＪＰ＿Ｐ２Ａ，ｓＡ彻和＂刚Ｊ是拟南芥新的内参基

因的同源基因。对不同年份的２组共１８个不同

浆果发育时期的样品分析结果表明，甜肋日，

Ａｃ丁，Ｅ，，ａ和鲥ⅣＤ的总体稳定性较好。但是，把２组样品单独分析时内参基因的稳定性却并不一致，对第一组样品来说，内参基因的稳定性排序为ＴｌＰ４ｌ，ＡＰ４７＞ＧＡＰＤＨ＞ＭＤＨ＞ｓＡＮＤ；对筛二

组样品来说则是ＡＣ彤ＥＦＪｄ＞甜ＰＤⅣ＞叩Ｑ一

群Ｄ＞肘ＤＨ。在拟南芥中稳定最好的内参基因尸＿Ｐ２４和死ｗＪ，在葡萄浆果发育过程中的稳定性反不如传统内参基因。由此可见，稳定好的内参基因并不是通用的，其选择需根据不同物种和不

同实验条件而定。

Ｇｕｔｉｅ仃ｅｚ等¨纠分析了４个内参基因在杨树中的表达稳定性，其中２个为传统内参基因

咄ｐ，Ｄ和１８ＳｒＲＮＡ，另外２个是拟南芥新的内参

基因Ａ群驴铊７０和Ａ蛹哪３舳的同源基因。在８

个不同的发育时期样品中，杨树Ａ群驴铊７Ｄ和

Ａ确筘３３８０同源基因的稳定要高于叩ＱＪＤ和１８ｓ

中国农业科技导报

１ｌ卷

ｒＲＮＡ。但在不同形成层样品中，Ａ群驴４２７０同源

基因是不存在的。内参基因的稳定性是相对的，不同的内参基因在不同生理条件的表达通常不是恒定不变的。在一种实验条件表现稳定的内参基因不一定适用于另一种实验条件（表１）。研究者

基因和咖Ｑ，０的稳定性最好，Ａ两筘３３８Ｄ同源基

因的稳定性较差。用不同的内参基因对杨树

Ａ删陋Ｇｍ循Ⅳ刚（ＡⅣｒ）基因进行表达分析会得出

截然不同的结论。

５

必须结合各自的实验条件和样品类型来选择合适

的内参基因。

同一基因家族内不同成员问的表达稳定性也可能不同。泛素基因是一类持家基因，在细胞的

内参基因选择应注意的几个问题

已有研究结果表明，在所有组织器官、发育时

蛋白质降解中发挥重要作用，并广泛用作内参基

期、生理状态逆境条件下均稳定表达的理想内参

表ｌ

Ｔａｂｌｅｌ

因。真核生物中，编码泛素蛋白的主要有多聚泛

已报道的植物ｑＲＴ－ＰＣＲ内参基因

“ｓｔｏｆｒｅｐｏｒ【ｅｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅｓｆｏｒｑＲＴ—ＰＣＲｉｎｐｌａｎｔｓ

６期胡瑞波等：植物实时荧光定量ＰｃＲ内参基因的选择

３５

Ｒｕｂｉｓｃｏ活化酶基因（Ｒ甜）

胁慨ｌＤ击啪Ｄｅｖｅｌｏｐ啪ｎｔａｌｓｔａｇｅｓ，ｔ汹ｅ／ｏｒｇａ啮，

ｄ厶ｔⅡｃ，ｉｙｏｎ

ａｂｉｏｆｉｃ

短柄草

发育时期组织器官和逆境胁迫（干旱，盐，高温，低温）、激素

ｓｔｒｅｓｓ（ｄｍｕｇｈｔ，

Ｒｕｂｉｓｃｏａｃｔｉｖａｔｉｎｇｅｎｚｌｍ圯

ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅ

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Ｓ－腺苷甲硫氨酸合成酶基因［１８］

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组织器官，发育时期，光周期，品种

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［１９］

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沣：ａ．末通过ｑＲＴ—ＰＣＲ验证；ｂ．未用ｇｅＮｏｍ或Ｎ０ｆＴｎＦｉｎｄｅｒ分析．

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定适用于另一种植物的所有样品类型。比如在拟

南芥中表达稳定的孤ｗＪ和ＰＰ２Ａ在葡萄浆果的

素（ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）和泛素延伸蛋白（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｐｍｔｅｉｎ）两类基因。在拟南芥中研究发

现，泛素基因家族不同成员的表达稳定性存在明

ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ

发育过程中的稳定性较差，”ＷＪ在铜和镉胁迫

条件下的表达稳定最差，反倒不如传统的内参基

显差异，一些泛素结合酶基因（如Ａ确眵７９６Ｄ）和Ｅ３泛素连接酶基因（如Ａ￡Ｊ９７５盯Ｄ）的稳定性较

因。同理，在杨树中不同形成层样品中ｓＡ肋的

稳定性也较差（表１）。

好，而一些多聚泛素基因（如咄ＱＪＯ和凇ＱＪ）稳

定性较差，而另一些多聚泛素基因（如叩钟和

咖∞）被证明在拟南芥、短柄草和水稻中稳定性

较好（表Ｊ）。肌动蛋白基因家族也被广泛用作内

选择两个以上的内参基因作参照有助于得到更为可靠的表达结果，这在大豆¨５ｌ、马铃薯【２９１、葡萄口叫和杨树¨纠中已被证实。因此在追踪基因表达的微小变化时，单独使用一个内参基因往往不能得到准确的定量结果，必须几个内参基因结合使用。

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于双倡（表１）。

在Ｔｕｂｕｌｉｎ基因家族中，删的稳定性也普遍高

内参基因在不同物种间没有绝对的通用性，不同物种间同源的内参基因的稳定性也不同，在一种植物中稳定性表现非常好的内参基因也不一

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植物实时荧光定量PCR内参基因的选择

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

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中国农业科学院作物科学研究所,国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程,北京,100081

中国农业科技导报

JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY2009,11(6)14次

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本文读者也读过(4条)

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7. 刘凤梅. 刘左军. 李富香钝裂银莲花Actin基因片段的克隆与序列分析[期刊论文]-中国食品工业 2014(3)8. 隋志伟. 余笑波. 王晶. 李亮. 臧超. 叶子弘转基因水稻种子核酸提取方法的比较研究[期刊论文]-中国稻米2011(6)

9. 李飞. 徐建飞. 刘杰. 段绍光. 雷尊国. Jiwan Palta. 金黎平冷驯化前后野生马铃薯Solanum acaule内参基因的筛选[期刊论文]-西南农业学报 2012(5)

10. 袁秀云. 田云芳. 蒋素华. 崔波萼脊兰Actin基因片段的克隆及序列分析[期刊论文]-中国农学通报 2012(13)11. 刘芳. 吴亮其. 王辉. 张媛雅. 柴团耀商陆小G蛋白激活蛋白基因PaAGAP在逆境下表达研究[期刊论文]-中国科学院研究生院学报 2011(1)

12. 赵鑫. 张林生小麦脱水素基因wzy2表达量实时荧光定量PCR方法的建立和应用[期刊论文]-西北植物学报2011(5)

13. 牙库甫江·阿西木. 关波. 张富春植物基因表达转录分析中内参基因的选择与应用[期刊论文]-生物技术通报2011(7)

14. 刘莉铭. 刘红彦. 田保明茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选[期刊论文]-作物学报 2012(3)

15. 黄河. 牛雅静. 杨可. 戴思兰甘菊内参基因CITUA的克隆与表达分析[期刊论文]-北京林业大学学报 2012(2)

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